专利名称：南五味子醇浸膏制成的成品药中五味子甲素含量的测定法的制作方法
技术领域：
本发明涉及五味子甲素含量的测定法，具体地说是涉及由南五味子醇浸膏制成的成品药中五味子甲素含量的测定法。
背景技术：
南五味子(原名华中五味子)加水煎煮，药渣烘干，粉碎，用70％乙醇回流提取，可得南五味子醇浸膏。由南五味子醇浸膏进一步制成的成品药包括胶囊、片剂、滴丸、散剂等。该中成药能降低血清谷丙转氨酶，可用于慢性、迁延性肝炎谷丙转氨酶升高者。现代研究表明，南五味子中具有保肝、降酶作用的有效成分为木脂素类成分，主要有五味子甲素和五味子酯甲。
现执行的国家药品标准项下的关于由南五味子醇浸膏制成的成品药中五味子甲素含量的测定方法，系采用紫外可见分光光度法中的吸收系数法测定。该方法专属性不强，供试品的紫外扫描最大吸收波长与五味子甲素的最大吸收波长222nm不一致且相差较大，每一批供试品的紫外扫描最大吸收波长也都不完全一致；而且该法供试品溶液的制备繁琐、测定时间长、易引入误差、结果不准确。国家中药保护品种对该品种审批件的改进意见要求进一步完善质量标准，改进含量测定方法，使其能控制该药的内在质量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种由南五味子醇浸膏制成的成品药中五味子甲素含量的高效液相色谱测定方法。
本发明南五味子醇浸膏制成的成品药中五味子甲素含量的测定方法包括如下的步骤(1)色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相甲醇∶乙腈∶1‰磷酸的体积比为50～85∶5～20∶10～35，检测波长为222nm，理论板数按五味子甲素峰计算不低于3000；(2)对照品溶液的制备 取五味子甲素对照品适量，加甲醇配制而成；(3)供试品溶液的制备 取装量差异项下的内容物适量加甲醇溶解，超声处理，加甲醇稀释，滤过，取续滤液，加甲醇稀释；
(4)测定 吸取对照品溶液及供试品溶液，注入液相色谱仪，测定。
所述步骤(1)色谱条件中流速为0.5～1.5ml/min，优选流速为1ml/min。
所述步骤(1)中柱温为20～35℃，优选30℃。
所述步骤(1)中流动相甲醇∶乙腈∶1‰磷酸的体积比优选65～75∶5～15∶15～25，最优选70∶10∶20。
所述步骤(2)制得的对照品溶液中每1ml含五味子甲素为2～40ug，优选4～20ug，最优选10ug。
所述步骤(3)中超声处理的时间为10～30分钟，优选20分钟；所述超声处理时的频率为40KHz；功率为250W。
上述方法也适用于南五味子醇浸膏中五味子甲素含量的测定。
五味子甲素为南五味子的特征有效成分，采用高效液相色谱法测定南五味子醇浸膏制成的成品药中五味子甲素的含量，灵敏度高、准确；该方法中供试品溶液的制备采用超声处理，简单易操作，误差小。通过对五味子甲素含量的检测控制，可有效地控制由南五味子醇浸膏制成的成品药的内在质量。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细说明。
图1 254nm波长处五味子甲素对照峰；图2 222nm波长处五味子甲素对照峰；图3对照品甲醇-乙腈-0.4％H3PO4(70∶10∶20)的五味子甲素对照峰；图4对照品甲醇-四氢呋喃-水(76∶4∶20)的五味子甲素对照峰；图5供试品甲醇-乙腈-0.4％H3PO4(70∶10∶20)的五味子甲素峰；图6供试品甲醇-四氢呋喃-水(76∶4∶20)的五味子甲素峰；图7供试品甲醇-乙腈-1‰H3PO4(70∶10∶20)的五味子甲素峰；图8五味子甲素对照品液色谱图；图9空白样品液色谱图；图10胶囊供试品液色谱图；图11五味子甲素标准曲线。
具体实施例方式
五味子甲素含量测定以下提到的超声处理的条件均为功率250W，频率40KHz1.仪器与试药仪器岛津LC-2010A HT液相色谱仪样品四川禾正制药有限责任公司提供的二十三批南五味子醇浸膏制成的胶囊大生产产品(醇浸膏含总木脂素以五味子甲素计11.25g，碳酸钙10％，加淀粉及其他辅料适量，混匀，制成颗粒，干燥，装入胶囊，制成1000粒)批号为031102、031112、040708、040710、040801、040802、040807、040902、040903、041002、041003、041007、041008、041101、041108、041203、041204、041206、050101、050103、050406、050407、050408试剂甲醇、乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其它均为分析纯对照品五味子甲素为中国药品生物制品检定所提供(批号0764-00107)2.溶液制备方法2.1提取溶剂的筛选取本品(批号041206)6份，每份约0.5g，精密称定，置50ml量瓶中，1、2、3号样品加甲醇约46ml，超声处理20分钟，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得1、2、3号供试液；4、5、6号样品加乙醇约46ml，超声处理20分钟，放冷，加乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml置10ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，即得4、5、6号供试液。将上述6个样品各取10ul注入液相色谱仪测定，结果见表1，其中RSD表示相对标准偏差。
表1不同提取溶剂提取效果比较
从上表可见，甲醇的提取效率略高于乙醇，故选用甲醇为提取溶剂。
2.2提取方法的筛选超声处理取本品(批号041206)3份，每份约0.5g，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇约46ml，超声处理20分钟，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得供试液1、2、3。
回流提取取本品(批号041206)3份，每份约0.5g，精密称定，加甲醇50ml回流提取1小时，滤过，用甲醇洗涤沉淀三次，合并滤液，加甲醇稀释至100ml摇匀，精密吸取5ml置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度得供试液4、5、6。
将上述6个样品各取10ul注入液相色谱仪进行测定，结果见表2
表2超声提取、回流提取效果比较
结果表明，超声处理，提取充分、快捷、简便可行，故选择为超声提取。
2.3超声提取时间的筛选取本品(批号041206)6份，每份约0.5g，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇约46ml，超声处理10分钟、20分钟、30分钟，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。将上述6个样品各取10ul注入液相色谱仪测定，结果见表3表3不同超声时间提取效果比较
结果表明，本品超声处理20分钟提取效果更好。
综上所述，确定本品供试液的优选的制备方法为取本品约0.5g，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇约46ml，超声处理20分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
2.4对照品溶液的制备 根据五味子甲素的溶解性，测定多采用乙醇或甲醇作为溶剂，本方法选用甲醇作为溶剂。称取五味子甲素对照品约4～20mg，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml加甲醇稀释至100ml，摇匀，即得，每1ml含五味子甲素4～20ug。
2.5阴性溶液的制备 参照供试品溶液制备方法，精密称取缺南五味子的空白辅料混合物0.4210g(该批样品胶囊的处方为南五味子醇浸膏占16％，空白辅料碳酸钙、糊精、淀粉混合物共占84％)置50ml量瓶中，加甲醇约46ml，超声处理20分钟，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得空白样品。
3.方法的考察色谱条件的选择与系统适应性试验3.1检测波长的确定 取五味子甲素对照品，用甲醇稀释成约0.2002mg/ml，进行紫外扫描，结果在222nm处有最大吸收峰。
色谱柱十八烷基键合硅胶为填充剂流动相甲醇∶乙腈∶1‰磷酸的体积比为50～85∶5～20∶10～35，优选65～75∶5～15∶15～25，最优选70∶10∶20。
流速0.5～1.5ml/min，优选流速1ml/min。柱温20～35℃，优选30℃。
在选定的色谱条件下，取对照品溶液(10ug/ml)和空白样品溶液各10ul，注入液相仪，在222nm波长处检测，结果空白样品在五味子甲素峰位置处无吸收峰，不干扰测定，故选择222nm为检测波长。
我们在下面的色谱条件下与检测波长254nm进行比较各取五味子甲素对照品溶液(80ug/ml)10ul，注入液相仪，分别在222nm和254nm波长处检测。
流动相甲醇∶乙腈∶1‰H3PO4的体积比为70∶10∶20色谱柱十八烷基键合硅胶为填充剂流速1ml/min柱温30℃如图1所示，结果在254nm波长处五味子甲素对照峰的峰面积为1799544，图2所示222nm波长处五味子甲素对照峰的峰面积为6340120。表明在222nm波长处，吸收更大，与紫外扫描结果一致。故选择222nm为检测波长。
3.2流动相组分的选择1.甲醇-乙腈-H3PO4和甲醇-四氢呋喃-水的比较1.1我们分别采用甲醇-乙腈-0.4％H3PO4(70∶10∶20)和甲醇-四氢呋喃-水(76∶4∶20)这两种流动相，各取上述对照品溶液(80ug/ml)10ul，注入液相仪，在222nm波长处检测。
如图3所示，结果可见流动相为甲醇-乙腈-0.4％H3PO4(70∶10∶20)的五味子甲素对照峰的峰面积为5980480，保留时间11.042min，分离度6.51，拖尾因子1.02。图4所示，流动相为甲醇-四氢呋喃-水(76∶4∶20)的五味子甲素对照峰的峰面积为5751151，保留时间10.083min，分离度5.19，拖尾因子1.13。1.2另取本品10粒，倾出内容物，研细，取约0.5g，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇约46ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液，作为供试品溶液。
分别采用甲醇-乙腈-0.4％H3PO4(70∶10∶20)和甲醇-四氢呋喃-水(76∶4∶20)这两种流动相，各取上述供试品溶液10ul，注入液相仪，在222nm波长处检测。
如图5所示，流动相为甲醇-乙腈-0.4％H3PO4(70∶10∶20)的五味子甲素峰的峰面积为8567660，保留时间10.967min，分离度6.45，拖尾因子1.03。图6所示，流动相为甲醇-四氢呋喃-水(76∶4∶20)的五味子甲素峰的峰面积为5751151，保留时间10.100min，分离度1.83，拖尾因子1.10。
从图3、4、5、6可看出用甲醇-四氢呋喃-水作流动相的图谱与用甲醇-乙腈-0.4％H3PO4作流动相的图谱比较，甲醇-四氢呋喃-水作流动相所测得的五味子甲素峰分离度较低，拖尾较严重。说明其主成分峰分离效果差，故暂选择流动相为甲醇-乙腈-0.4％H3PO4。
2.甲醇-乙腈-0.4％H3PO4和甲醇-乙腈-1‰H3PO4的比较因H3PO4对色谱柱的使用寿命的影响较大，故我们又进行了0.4％H3PO4和1‰H3PO4的比较。
另取上述供试品溶液10ul，用甲醇-乙腈-1‰H3PO4(70∶10∶20)为流动相，如图7所示，在222nm波长处检测；与流动相为甲醇-乙腈-0.4％H3PO4(70∶10∶20)比较，如图5所示。
流动相为甲醇-乙腈-1‰H3PO4(70∶10∶20)，五味子甲素峰的保留时间9.450min，分离度7.47，拖尾因子1.02。
用甲醇-乙腈-1‰H3PO4作流动相的图谱与用甲醇-乙腈-0.4％H3PO4作流动相的图谱比较，甲醇-乙腈-1‰H3PO4作流动相的五味子甲素峰的保留时间短、分离度好，并且为色谱柱的使用寿命考虑，故选择流动相为甲醇-乙腈-1‰H3PO4。
3.3色谱柱的理论板数在选定的色谱条件下，吸取供试品溶液10ul，注入色谱仪，记录色谱图，理论塔板数为5240，故规定理论塔板数不低于3000。
对照品进样精密度精密吸取对照品溶液(10ug/ml)10ul，重复进样，五味子甲素峰面积值的RSD为0.38％，结果见表4表4重复性试验
结果表明，对照品进样精密度良好。
4.可行性考察取供试品液、对照品溶液、阴性溶液各10ul，注入色谱仪，记录色谱图，结果见图8、图9、图10，图中tR8.550min为五味子甲素。
结果表明，阴性溶液无干扰，测定方法具可行性。
5.定量限取五味子甲素对照品溶液加甲醇稀释配成10μg/ml的溶液后，逐级稀释进样，观察五味子甲素对照峰和基线噪声，当其浓度为0.02ug/ml时，进样10μl，其信噪比约为10∶1，本品定量限为0.02ng。
6.线性关系的考察分别精密吸取已配制的五味子甲素对照品液(200.2ug/ml)1、2、3、4、5ml加甲醇稀释成50ml，摇匀，制成浓度为4ug/ml、8ug/ml、12ug/ml、16ug/ml、20ug/ml的溶液，分别精密吸取上述5个溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，结果见表5表5五味子甲素对照品标准曲线
以峰面积值(A)为纵坐标，进样量为横坐标(C)作图，绘制标准曲线，见图11，计算得回归方程，A＝3482.3+129017.95C相关系数r＝0.9999结果表明，五味子甲素在进样量0.04～0.20ug范围内，线性关系良好。
7.精密度试验取041206批供试品约0.5g，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇约46ml，超声处理20分钟，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。精密吸取供试品液10ul，重复进样6次，测定峰面积，结果见表6表6精密度试验
RSD为0.75％，说明本法精密度良好。
8.稳定性试验取041206批供试品约0.5g，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇约46ml，超声处理20分钟，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。精密吸取供试品液10ul间隔一定时间进样一次，测定五味子甲素的峰面积，结果见表7表7稳定性试验
结果表明，样品供试品溶液在24小时内稳定。
9.重现性试验取041206批供试品五份，每份约0.5g(平均装量0.2585g/粒)，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇约46ml，超声处理20分钟，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。精密吸取供试品液10ul，进样测定峰面积，结果见表8表8重现性试验
其相对标准偏差为1.31％。实际表明本法重复性试验结果较好。
10.加样回收率试验精密称取六份已知含量的样品(批号041206，含量2.21mg/粒，平均装量0.2585g/粒，折合成8.55mg/g)约0.25g，精密称定，置50ml量瓶中，再加入已配制的五味子甲素对照品溶液(0.268mg/ml)，加甲醇至约46ml，超声处理20分钟，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得加样回收供试品溶液。精密吸取加样回收供试品液10ul，进样，测定峰面积，按下式计算回收率，结果见表9、10
表9五味子甲素对照品溶液(0.268mg/ml)加入量
表10回收率试验结果
结果表明加样回收实验合格。
11.色谱分离耐用性试验不同色谱柱的比较，见表11表11不同色谱柱的比较
从上可见，选用不同的色谱柱，结果影响不大。
不同柱温的比较，见表12表12不同柱温的比较
从上可见，选用不同的柱温，结果有一定差距，其中20℃、30℃之间差别不大，换用40℃时，结果有明显偏离。
不同流动相比例的比较，见表13表13不同流动相比例的比较
从上可见，流动相比例作少量调整，结果差异不大。
12.含量测定法根据以上结果，总结本品中五味子甲素的含量测定法如下色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相甲醇∶乙腈∶1‰磷酸的体积比为70∶10∶20；检测波长为222nm，柱温30℃，理论板数按五味子甲素峰计算不低于3000。
对照品溶液的制备取五味子甲素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含10ug的溶液，即得。
供试品溶液的制备取装量差异项下的内容物，研细，取约0.5g，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇约46ml，超声处理(功率250W，频率40KHz)20分钟，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10ul，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定，即得。
13.样品测定
分别精密吸取对照品液(10ug/ml)10ul与供试品溶液10ul，按上述色谱条件测定，照上述算式计算五味子甲素含量，结果见表14表14样品含量测定
上述五味子甲素的含量测定法不仅适用于硬胶囊，还适用于由南五味子醇浸膏制成的其它制剂，如片剂、颗粒剂、滴丸、软胶囊、散剂等。
权利要求
1.一种南五味子醇浸膏制成的成品药中五味子甲素含量的测定法，其特征在于，它包括如下的步骤(1)色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相甲醇∶乙腈∶1‰磷酸的体积比为50～85∶5～20∶10～35，检测波长为222nm，理论板数按五味子甲素峰计算不低于3000；(2)对照品溶液的制备取五味子甲素对照品适量，加甲醇配制而成；(3)供试品溶液的制备取装量差异项下的内容物适量加甲醇溶解，超声处理，加甲醇豨释，滤过，取续滤液，加甲醇稀释；(4)测定吸取对照品溶液及供试品溶液，注入液相色谱仪，测定。
2.根据权利要求1所述的一种南五味子醇浸膏制成的成品药中五味子甲素含量的测定法，其特征在于，所述步骤(1)色谱条件中流速为0.5～1.5ml/min。
3.根据权利要求1所述的一种南五味子醇浸膏制成的成品药中五味子甲素含量的测定法，其特征在于，所述步骤(1)中柱温为20～35℃。
4.根据权利要求1所述的一种南五味子醇浸膏制成的成品药中五味子甲素含量的测定法，其特征在于，所述步骤(1)中流动相甲醇∶乙腈∶1‰磷酸的体积比为65～75∶5～15∶15～25。
5.根据权利要求4所述的一种南五味子醇浸膏制成的成品药中五味子甲素含量的测定法，其特征在于，所述流动相甲醇∶乙腈∶1‰磷酸的体积比为70∶10∶20。
6.根据权利要求1所述的一种南五味子醇浸膏制成的成品药中五味子甲素含量的测定法，其特征在于，所述步骤(2)制得的对照品溶液中每1ml含五味子甲素2～40ug。
7.根据权利要求6所述的一种南五味子醇浸膏制成的成品药中五味子甲素含量的测定法，其特征在于，所述制得的对照品溶液中每1ml含五味子甲素4～20ug。
8.根据权利要求1所述的一种南五味子醇浸膏制成的成品药中五味子甲素含量的测定法，其特征在于，所述步骤(3)中超声处理10～30分钟。
9.根据权利要求1或8所述的一种南五味子醇浸膏制成的成品药中五味子甲素含量的测定法，其特征在于，所述超声处理时的频率为40KHz。
10.根据权利要求1或8所述的一种南五味子醇浸膏制成的成品药中五味子甲素含量的测定法，其特征在于，所述超声处理时的功率为250W。
全文摘要
本发明公开了一种由南五味子醇浸膏制成的成品药中五味子甲素含量的测定方法，它包括如下的步骤(1)色谱条件与系统适应性试验；(2)对照品溶液的制备；(3)供试品溶液的制备；(4)测定。该方法采用高效液相色谱法测定五味子甲素的含量，灵敏度高、准确；该方法中供试品溶液的制备采用超声处理，简单易操作，误差小。通过对五味子甲素含量的检测控制，可有效地控制由南五味子醇浸膏制成的成品药的内在质量。
文档编号G01N30/00GK1895358SQ200610021218
公开日2007年1月17日 申请日期2006年6月21日 优先权日2006年6月21日
发明者吴克勤, 许邑 申请人:四川禾正制药有限责任公司