专利名称：五味子醇甲、五味子甲素及五味子醇提取物防治老年痴呆的新用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，是五味子醇甲、五味子甲素及五味子醇提取物用于防治老年痴呆症的用途。
背景技术：
阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease,简称AD)是老年痴呆中最常见疾病，属渐进性发展的致死性神经退行病变。临床表现以进行性和退行性大脑认知、识别功能障碍为特征，记忆力降低并伴随个性和行为的改变，生活自理能力随疾病发展而日趋降低，直至完全丧失。随着我国进入老龄社会，老年性痴呆的发病率也在逐年增高。按照我国60岁以上老年人口 1. 67亿，发病率约4%-6%计算，保守估计我国患病人数已超过600万，占全世界所有患病人数的1/4。AD将成为继心脑血管疾病、癌症和艾滋病之后又一严重威胁人类健康和生存质量的疾病。因此寻找有效治疗和改善该病的药物也成为一项紧迫的任务并成为具有国际竞争的领域。AD发病机理尚不清楚，目前认为与神经递质紊乱、基因突变、自由基损伤、神经细胞凋亡、淀粉样蛋白(amyloid beta peptide fragment，简称AA)沉积和tau蛋白异
常磷酸化等有关。小胶质细胞是脑内具有巨噬细胞类似功能的一类细胞，在中枢神经系统(CNS)的炎症进程中发挥重要作用。小胶质细胞是CNS受损伤后最早发生反应的细胞类型。中枢神经系统的多种病理状态均可激活小胶质细胞，例如创伤和中风、炎症反应和神经退行性疾病等。小胶质细胞的适度激活对神经元具有保护作用，然而过度激活的小胶质细胞释放大量的神经毒性因子，从而调节和影响脑内其他细胞生长发育的生理过程，参与了病理过程的启动、进展以及最后结局，介导并加重机体组织的损害。总之，小胶质细胞活化在缺血缺氧性脑病、神经退行性疾病的病理过程中发挥着重要的作用。因此抑制小胶质细胞活化，被认为可能成为有效防治神经退行性疾病、改善脑缺血脑损伤的重要策略。目前治疗药物大致分为促进乙酰胆碱释放药物，拟胆碱药物，生长因子促进剂， 抗AA肽药物以及脑功能改善药物等。由于老年性痴呆症的发病因素较多，发病机制复杂，涉及到多系统、多靶点的异常病理，单一作用点的药物一般很难取得满意的治疗效果，多种合成药物在使用中还存在着不同的毒副作用。而中草药用于改善学习记忆，防治老年性痴呆，具有天然、多效、低毒等特点，在老年性痴呆症的预防和治疗方面具有更大的潜力。五味子为木兰科植物五味子的干燥成熟果实，具有敛肺滋肾、生津敛汗、涩精止安、宁心安神的功效。晋代《抱朴子》有五味子“常服能返老还童、延年益寿”的记载；明代 《本草纲目》记载五味子“补虚劳，令人身体悦泽，明目”。提示五味子有很好的抗衰老作用。 近有报道五味子乙素，五味子酚等木脂素有较好的抗氧化作用。五味子醇提部位可明显提高小鼠的学习能力。
五味子醇甲可延长小鼠巴比妥钠及戊巴比妥钠的睡眠时间，减少自主活动，抑制电刺激或长期单居引起的小鼠激怒行为，并可选择性地抑制大鼠回避性条件反射及二级条件反射，具有一定的安定作用。药代动力学研究表明，五味子醇甲主要分布在大鼠下丘脑及纹状体等组织中。腹腔注射给予五味子醇甲(50 mg/ml),30 min后断头取脑，剥离脑组织取出下丘脑和纹状体，高效液相色谱一电化学检测法测定单胺类递质及其代谢产物含量。大鼠下丘脑内多巴胺和纹状体中DA及其代谢产物DOPAC含量明显增加，表明五味子醇甲能增加DA的转换率。大鼠脑缺血20分钟后再灌造成神经递质水平明显升高。缺血前30分钟腹腔注射五味子醇甲(50 mg/kg)，可有效抑制缺血引起的大鼠纹状体细胞外液神经递质水平的升高。五味子醇甲能有效抑制脑缺血引起的兴奋性神经递质NE、DA、Glu和Asp的大量释放， 提高抑制性递质GABA的水平，提示五味子醇甲通过降低脑缺血引起的兴奋毒性而对缺血性脑损伤起保护作用，该研究为阐明五味子醇甲的脑保护作用机制提供了神经化学方面的研究依据。以PC12细胞为模型细胞，采用四氮唑(MTT)比色法检测6_羟基多巴胺(6-0HDA) 对PC12细胞活性的影响；采用放射免疫法测定PC12细胞对培养液中谷氨酸的摄取；采用高效液相色谱法(HPLC)测定细胞外液中谷氨酸的浓度。6-0HDA能抑制PC12细胞摄取谷氨酸，提高胞外谷氨酸的浓度，降低细胞的存活率；五味子醇甲能增强PC12细胞对谷氨酸的摄取，降低胞外谷氨酸的浓度，并拮抗6-0HDA对PC12细胞摄取谷氨酸的抑制作用和对细胞存活率的影响。五味子醇甲对PC12细胞有保护作用，其保护作用机制可能与增强谷氨酸转运体(Glutamate transporters, GluTs)的功能有关。在急性炎症和败血症动物模型中和巨噬细胞的细胞因子水平考察五味子醇甲的抗炎活性。结果表明五味子醇甲能显著抑制角叉菜胶诱导的小鼠足肿胀和降低醋酸诱导的血管渗透性。此外，五味子醇甲对LPS诱导的感染性休克有保护效应。在体外五味子醇甲能抑制NO的生成、前列腺素E2的释放、环氧化酶-2以及诱生型一氧化氮合酶的表达，这些都起因于五味子醇甲对7巨噬细胞系中NF- κ B、JNK、MAPK活性的抑制。我们的前期研究也发现五味子醇甲能够明显抑制小胶质细胞的活化，对炎症介质NO的分泌有抑制作用，而激活的小胶质细胞及炎症反应与老年痴呆症的发病密切相关。
发明内容
本发明研究五味子醇甲、五味子甲素及五味子醇提取物防治老年痴呆症的新用途。本发明采用侧脑室注射Κβ ^42致痴呆小鼠模型进行实验，通过Y迷宫及Morris 水迷宫法，测试五味子醇提取物、五味子醇甲、五味子甲素对小鼠学习记忆能力的影响。并使用分光光度计检测脑内丙二醛(malondialdehyde，简称MDA)含量、谷胱甘肽 (glutathione,简称 GSH)含量、氧化型谷胱甘肽(glutathione oxidized,简称 GSSG)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,简称SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px) 活性来探讨其作用机制。结果表明五味子乙醇提取物、五味子醇甲、五味子甲素可显著改善小鼠工作记忆障碍及空间辨别学习记忆障碍。提高SOD和GSH-Px活性，减少MDA含量，增加GSH含量并降低GGSG含量，提示五味子醇提取物、五味子醇甲、五味子甲素可能通过多种途径清除体内氧化应激所产生的自由基，抑制脂质过氧化，提高机体抗氧化能力，从而改善
4Αβ !-42所致的氧化应激损伤。采用脂多糖(LPS)诱导的小胶质细胞活化模型，以NO释放为指标，Griess法检测五味子醇甲对LPS激活小胶质细胞的抑制作用；MTT法对小胶质细胞细胞成活率的影响。结果表明，五味子醇甲能够明显抑制小胶质细胞的活化，对炎症介质NO的分泌有抑制作用。对炎症因子的作用强于阳性药米诺环素，并且各浓度均不影响N9小胶质细胞的存活率。提示五味子醇甲可能通在抗炎方面改善老年痴呆症。因此五味子可用于制备防治老年痴呆症的药品或保健食品。
图1为五味子醇甲对N9细胞存活率的影响；
图2为五味子醇甲对脂多糖诱导N9小胶质细胞NO释放的抑制作用。
具体实施例方式实施例1:
一、实验动物与材料 1.实验动物
昆明种小鼠，雄性，18-22g，120只。由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。许可证号SCXK-(京)2009-0004。2.药物与试剂
五味子醇提取物(总木脂素含量对%)、五味子醇甲(纯度>95%)、五味子甲素(纯度 >95%)均为本实验室自制，CMC-Na溶解；Aβ H2=Sigma美国，批号:079Κ8729 ；盐酸多奈哌齐卫材(中国)药业有限公司，批号090922Α ；考马斯亮蓝蛋白试剂盒南京建成生物工程研究所，批号20101103 ；SOD试剂盒南京建成生物工程研究所，批号20101103 ；MDA试剂盒南京建成生物工程研究所，批号20101103 ；GSH-PX 南京建成生物工程研究所，批号 20101103 ；GGSG 南京建成生物工程研究所，批号21101110 ；GSH 南京建成生物工程研究所，批号 20101110。3.实验仪器
动物脑立体定位仪日本东京，型号NARISHIGE SCIENTFIC INS- TRUMENT. LAB, SR-5N, NO. 00031 ；单臂数字式脑立体定位仪深圳市瑞沃德生命科技有限公司，型号 69001 ；自发活动视频分析系统上海吉量软件科技开发公司；行为学实验装置水迷宫、Y 迷宫及避暗装置均为自制。二、实验方法
将120只小鼠随机分为12组假手术组、模型组、五味子醇提取物400、200、100 mg/ kg组、五味子醇甲4、12、36 mg/kg组、五味子甲素4、12、36 mg/kg组及盐酸多奈哌齐0.65 mg/kg组，每组8-10只。Αβ !_42 0. 1 mg，用1.2 Pl DMSO (二甲基亚砜)溶解，加入161 //L无菌生理盐水， 37 °C孵育120 h，待用。手术时，假手术组小鼠侧脑室注射0.7%DMS0生理盐水3 //L，其余各组小鼠侧脑室注射Κβ i_42溶液3 "L (含Κβ i_42 410 pmol)。术后第1天起，各组小鼠连续灌胃给药，给药体积为20 ml/kg，假手术组及模型组给予等体积蒸馏水，直至实验结束。术后第7天，进行小鼠自发活动实验，第8天进行小鼠Y迷宫实验，第9-13天进行小鼠水迷宫实验，以上行为学实验均在给予相应药物或溶剂1 h后进行。第14天处死取脑，分离小鼠海马及皮层，按照南京建成生物工程公司试剂盒说明书分别进行SOD、MDA、GSH-PX、GGSG、 GSH测定。1.自发活动测试
将小鼠放入自发活动装置中，摄像机拍摄20 min内的活动过程并输入计算机， DigBehv动物行为分析系统自动记录并分析大鼠的总路程。2. Y迷宫法
实验装置由3个夹角为120°的木制支臂组成，分别称为A、B、C臂。每臂长40 cm, 高12 cm,上宽10 cm,下宽5 cm。实验时将小鼠放入A臂末端，让其自由出入3个臂，记录8 min内每只小鼠进入3个臂的总次数(N)及顺序。以连续进入3个不同的臂为一次正确交替反应，记录正确交替反应次数(η)。用自发交替反应率反映空间工作记忆能力。 [自发交替反应率=η/(Ν-2)Χ100%] 3. Morris水迷宫法
水迷宫装置尺寸为63X36X20 cm,由F型棕色塑料隔板交错分割成相通的五部分， 形成一条曲折的水道，水深10 cm,水温23士 1°C，S为起始区，F为目标区。在F区处有一阶梯，动物到达阶梯F可以获得休息。每只小鼠每天训练7次，间隔30 S。每次训练记录小鼠进入水中至到达安全区的时间。4.统计方法
实验数据用mean 士 SD表示，使用SPSS 17. 0软件进行组间资料的单因素方差分析。 水迷宫实验数据统计同时使用双因素方差分析和单因素方差分析。三、实验结果
1.对侧脑室注射U卜42致痴呆模型小鼠自发活动总路程的影响实验结果表明与假手术组相比，模型组小鼠自发活动总路程无显著性差异；与模型组相比，各给药组小鼠自发活动总路程无显著性差异(见表1 )，即侧脑室注射凝聚态Κβ H2 及药物本身未对小鼠自发活动产生明显影响，提示化合物不会通过影响中枢神经系统兴奋性而干扰后续的行为学实验。表1五味子醇提取物、五味子醇甲、五味子甲素对侧脑室注射kfi ^42所致痴呆模型小鼠自发活动总路程的影响(n = 8-10，mean 士 SD)
权利要求
1.五味子醇甲在制备防治老年痴呆症的药品和/或保健品中的应用。
2.五味子甲素在制备防治老年痴呆症的药品和/或保健品中的应用。
3.五味子醇提取物在制备防治老年痴呆症的药品和/或保健品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述五味子醇提取物含有五味子醇甲和/ 或五味子甲素。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述五味子醇提取物经过乙醇提取得到。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的五味子醇提取物通过如下方法纯化有机溶剂萃取法、树脂吸附法、正相柱层析法、反相柱层析法、正相制备薄层层析法、反相制备薄层层析法、反复重结晶法、反相制备液相色谱法中的一种或多种。
7.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述的五味子醇甲、五味子甲素或五味子醇提取物能够与药学上可接受的赋形剂或载体混合制成临床上可接受的药物制剂，或者制成保健品、食品或化妆品。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述制剂为片剂、硬胶囊、软胶囊、散剂、 酊剂、口服液、滴丸或注射剂。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，公开了五味子醇甲、五味子甲素及五味子醇提取物用于防治老年痴呆症的用途。具体涉及五味子醇提物、五味子醇甲、五味子甲素对侧脑室注射Aβ1-42致痴呆小鼠学习记忆障碍的改善作用，并探讨其作用机制。结果表明五味子乙醇提取物、五味子醇甲、五味子甲素可显著改善小鼠工作记忆障碍及空间辨别学习记忆障碍。提高SOD和GSH-Px活性，减少MDA含量，增加GSH含量并降低GGSG含量，提示五味子醇提取物、五味子醇甲、五味子甲素可能通过多种途径清除体内氧化应激所产生的自由基，抑制脂质过氧化，提高机体抗氧化能力，从而改善Aβ1-42所致的氧化应激损伤。可用于制备防治老年痴呆症的药品或保健食品。
文档编号A61K31/09GK102178664SQ201110113859
公开日2011年9月14日 申请日期2011年5月4日 优先权日2011年4月21日
发明者刘志惠, 杨静玉, 殷军, 胡荻, 韩娜 申请人:沈阳药科大学