专利名称：虹吸纳米生物传感芯片及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物传感芯片，同时还涉及该生物芯片的制备方法，属于医疗检测技术领域。
背景技术：
酶生物传感器(尤其是葡萄糖酶生物传感器)是一项快速发展的疾病检测新技术。以在有机体内应用的葡萄糖生物传感器为例，其机理为借助氧气，以葡萄糖氧化酶催化氧化葡萄糖的反应为基础，通过监测过氧化氢的生成或氧气的消耗量达到检测目的。其主要缺点是检测的精确度依赖葡萄糖反应完全，无法在短时间完成检测。此外，制造工艺过程需要一个聚合物体控制镀层，用以消除来自其他种类、酶层和外层的干扰，比较复杂。
近年来，采用厚膜技术(例如丝网印刷术)制造的葡萄糖生物传感器不仅在自我监测或保健方面明显优于医院里使用的传统仪器，而且生产过程得到简化，具有一定的重复特性，因此得到应用。此类典型的葡萄糖传感器由分别印在基材的上参比电极(或同时还有输导电流电极)、工作酶电极构成，其上面为保护电极不受损坏的覆盖膜。工作电极可以进行酶催化反应，并由一个电子中介载体将反应产生的电子传到电极上，由于产生的电流与酶的活性和血样中葡萄糖浓度有关，因此可以实现葡萄糖浓度的检测。然而，现有葡萄糖生物传感器在精确性、线性和可重复性方面尚存在一定问题。例如，目前的试验精度只能勉强达到20％。
检索发现，申请号为02150735和申请号为03127127的中国发明专利申请分别公开了采用纳米材料的生物传感器，但其技术上的成熟度尚有待考证。
发明内容
本发明的目的是针对以上现有技术存在的缺点，提出一种制作工艺相对简单、切实可行、能够快速精确完成所需检测的虹吸纳米生物传感芯片，同时还将给出其制备方法。
申请人经过实验研究认识到，由于酶催化葡萄糖反应之后，反应产生的电子需要转移到电极表面，然后被血糖仪检测到，这一过程中的电子转移实际上是通过活性分子而不是通过传播装置本身实现的。因此，此类生物传感器实质上是一种间接的电子转移装置，其工作的有效程度并非想象中那么有效。可以说，这是目前市场上已有产品精确测度无法突破20％的主要原因。
为了达到以上目的，本发明的虹吸纳米生物传感芯片主要由附着在基材上的两石墨电极、分别附着在两石墨电极上的参比电极和工作酶电极构成；所述参比电极由金属纳米粉材分散在高分子溶液中组成的导电高分子粘合体系构成，形成纳米级聚集态和纳米级有效孔洞；所述工作酶电极由金属纳米粉以及酶活性组分分散在高分子溶液中组成的导电高分子粘合体系构成，形成纳米级聚集态和纳米级有效孔洞。
以上的导电高分子粘合体系、纳米级聚集态、纳米级有效孔洞均作常规理解。即，“导电高分子粘合体系”为由高分子材料、金属和/或非金属导电材料以及溶剂组成的体系，实质是利用高分子的长分子链，将微小颗粒状导电材料有效地形成宏观均匀而微观不同相态的粘合剂；“纳米级聚集态”指由纳米材料在生产和加工完成之后形成的固态微观多相形态，其微相结构在纳米范围；“纳米级有效孔洞”指由纳米材料在生产和加工完成之后的固态聚集态中存在的自由体积，在微相结构表面和内部形成纳米级别的范围孔洞以上金属纳米粉材优选纳米Au、Ag、Pt、Pd中的至少一种(导电纳米粉材通常指Au、Ag、Pt、Pd和石墨中的一种)；酶活性组分为(Lipoprotein Lipase)脂蛋白脂肪、(Glycerol Kinase)甘油激酶、(L-α-Glycerophosphate Oxidase)L-α-磷酸甘油氧化酶、(Cholesterol Esterase)胆固醇酶、(Cholesterol Dehydrogenase)胆固醇脱氢酶、(Cholesterol Oxidase)胆固醇氧化酶、(GlucoseOxidase)葡萄糖氧化酶、(Glucose Dehydrogenase)葡萄糖脱氢酶、(Lactate Dehydrogenase)乳酸脱氢酶、(Bilirubin Oxidase)胆红素氧化酶、(Ascorbate Oxidase)抗坏血酸氧化酶、(Peroxidase)过氧化物酶中的至少一种；所用的高分子为聚氯乙稀、聚乙酸乙烯脂、聚乙烯醇、聚丙烯酸脂类、聚酰胺类、环氧树以及改性纤纬素等高分子材料以及其共聚物中的至少一种。
由于本发明合理采用了纳米材料和纳米技术，因此使生物传感器与现有技术相比，反应灵敏性和精确度明显提高。从理论上讲，纳米材料表面积很大，通过将其分散在导电高分子粘合体系中，形成纳米级聚集态和纳米级有效孔洞后，可以使采集到的体液与活性酶充分接触，从而在加速酶催化反应的同时，大大提高酶催化反应电子向电极表面的转移机率，因此检测精度很容易控制在10％之内，且具有理想的线性和重复性，检测时间可以缩短在到几秒。此外，检测所需血液等体液的采集量明显减少，可低到纳米毫微升。因此，本发明在显著提高检测精度的同时，一举多得，与现有技术相比，具有显著的实质性特点和突出的进步。
本发明虹吸纳米生物传感芯片的基本制备步骤如下
1)、制备石墨电极浆料1-1将所选高分子材料溶于相应的溶剂中，制成高分子溶液；1-2将石墨粉加入高分子溶液中，均匀混合；1-3添加溶剂，将粘度调节到1-100Pa.s(较好范围为2-60)，制成石墨电极浆料；2)、制备参比电极浆料2-1同1-1；2-2将纳米金属粉散布在高分子溶液中，充分混合，不断加大剪切力，直到分散相的粒度达到纳米级，制成导电高分子粘合体系；2-3添加溶剂，将粘度调节到1-100Pa.s(较好范围为2-60)，制成参比电极浆料；3)、制作工作酶电极3-1同1-13-2将纳米金属粉以及所选活性酶散布在高分子溶液中，充分混合，不断加大剪切力，直到分散相的粒度达到纳米级；3-3添加溶剂，将粘度调节到1-100Pa.s(较好范围为2-60)，制成工作酶电极浆料；或者3-1’同1-13-2’同2-23-3’将所选活性酶散布在导电高分子粘合体系中，充分混合；3-4同3-3；或者3-1”将含有纳米金属的复合高分子材料溶于相应的溶剂中，制成导电高分子粘合体系；
3-2”将所选纳米级酶体和纳米级促活剂散布在导电高分子粘合体系中，混合均匀；3-3”同3-2；4)、制作芯片4-1将石墨电极浆料均匀附着在基材上，形成第一和第二石墨电极；4-2分别使参比电极浆料和工作酶电极浆料均匀附着在基材的第一和第二石墨电极上，形成纳米级聚集态和纳米级有效孔洞。
整个工艺过程相对简单，并切实可行。
下面结合附图，以优选实施例对本发明作进一步的说明。
图1、图2分别为本发明一个实施例的主视图和侧视图。
具体实施例方式
实施例一本实施例的虹吸纳米生物传感芯片用于测试血糖，图1和图2所示，主要由附着在基材1上的两邻近石墨电极2、3，以及分别附着在两石墨电极前端的参比电极4(参比电极也可以完全或部分覆盖整个芯片石墨电极)和工作酶电极5构成(酶电极后端部分也可以被导电性能优于石墨其它材料，如所用的参比电极材料，完全或部分覆盖)。其中的基材是双取向PET(聚对苯二甲酸乙二酯)，各电极上表面覆盖通过粘合层7粘接的起保护作用的透明、半透明或不透明的PET塑料膜6。
其制作具体过程如下1)、制备纳米石墨电极浆料1-1将20-35％的高分子环氧树脂溶于80-65％混合溶剂(石油裂解芳香型有机溶剂)，在50-60℃条件下，缓慢溶解2-3小时，配制出高分子溶液；1-2将配制出的高分子溶液和纳米级石墨在三滚密炼机充分混合，剪切力度不断加大，直到分散相的粒度达到纳米级；1-3用混合溶剂将粘度调节到20-60Pa.s。
2)、制备参比电极浆料2-1同1-1；2-2将配制出的高分子溶液与50-70％纳米级银、氯化银(比例Ag∶AgCl＝80∶20)在三滚密炼机中充分混合，剪切力度不断加大，直到分散相的粒度达到纳米级，配制出导电高分子粘合体系；2-3用混合溶剂将配制出的导电高分子粘合体系料的粘度调节到20-60Pa.s，制成参比电极浆料。
3)、制备工作酶浆料3-1将含有纳米金属Pt2-4％的改性纤纬树脂以体积百分比0.5-2％的含量加入100克0.1mM磷酸缓冲液；3-2再加入1-2％的纳米级酶体Glucose Oxidase葡萄糖氧化酶和0.1-5％纳米级促活剂Ferrocenes(双五元环有机铁化物及其衍生物)，混合均匀；(此步骤中如再加入0.5-10％的纳米级二氧化硅将有助于促进固体颗粒的分散。)3-3、用磷酸缓冲液将粘度调节到20-60Pa.s。
4)、制作芯片4-1将石墨电极浆料用250目的丝网均匀印刷到到双取向PET基材上，形成两邻近第一和第二石墨电极；4-2分别将参比电极浆料和工作酶电极浆料用250目的丝网均匀印刷到基材的第一和第二石墨电极前端，形成纳米级聚集态和纳米级有效孔洞。
4-3印刷粘胶，覆盖透明、半透明或不透明PET上膜。
即可制成本实施例的虹吸纳米生物传感芯片。
使用时，只需采集微量血样，芯片借助虹吸作用使血样达到工作酶电极，与之发生酶催化反应，并将反应产生的电子传到电极上，通过测试参比电极与工作酶电极产生的电信号，即可测出血液中的葡萄糖浓度，整个过程可在一至几秒钟内完成，十分迅捷。
本实施例生物传感器标定血糖(Glucose)的反应表述过程基于血糖氧化酶(GOD)的生物反应实现，即
其中促活剂起到促活性和电子转移双重作用，整个反应基于酶化、界面和电化学机理。由于参比电极、工作酶电极、以至石墨电极均采用了纳米材料，因此测试精度比现有技术显著提高。
精度测试结果表明，标准静脉血液22℃测试结果精度均≤10％，所得测试结果关于直线y＝1.0045x-0.0578线性相关，相关系数为0.9912。
具体测试数据如下
实施例二本实施例生物传感器的基本结构与实施例一相同，具体制备过程如下1)、制备纳米石墨电极浆料1-1将15％的聚丙烯酸和15％聚酰胺溶于70％混合溶剂(石油裂解芳香型有机溶剂)，在50-60℃条件下，缓慢溶解2-3小时，配制出高分子溶液；1-2将配制出的高分子溶液和纳米级石墨在三滚密炼机充分混合，剪切力度不断加大，直到分散相的粒度达到纳米级；1-3用混合溶剂将粘度调节到20-60Pa.s。
2)、制备参比电极浆料2-1同1-1；2-2将配制出的高分子溶液与68％纳米级银、氯化银(比例Ag∶AgCl＝70∶30)在三滚密炼机中充分混合，剪切力度不断加大，直到分散相的粒度达到纳米级，配制出导电高分子粘合体系；2-3用混合溶剂将配制出的导电高分子粘合体系料的粘度调节到20-60Pa.s，制成参比电极浆料。
3)、制备工作酶浆料3-1将含有2-4％纳米金属Pd的聚乙烯醇以体积百分比0.5-2％的含量加入100克0.2mM乳酸缓冲液；3-2再加入1-2％的纳米级Glucose Dehydrogenase葡萄糖脱氢酶、3-5％pyrroloquinolinequinone辅酶和0.1-5％纳米级促活剂Quinones(对苯二酮及其衍生物)，混合均匀；(此步骤中如再加入0.5-10％的纳米级二氧化硅将有助于促进固体颗粒的分散。)3-3用乳酸缓冲液将粘度调节到20-60Pa.s。
4)、制作芯片
4-1将石墨电极浆料均匀喷涂到到双取向PET基材上，形成两邻近第一和第二石墨电极；4-2分别将参比电极浆料和工作酶电极浆料均匀喷涂到基材的第一和第二石墨电极前端，形成纳米级聚集态和纳米级有效孔洞。
4-3印刷粘胶，覆盖透明、半透明或不透明PET上膜。
即可制成本实施例的虹吸纳米生物传感芯片。
精度测试结果为，标准静脉血液22℃测试结果精度均≤10％，所得测试结果关于直线y＝0.995x-0.4275线性相关，相关系数为0.9823。
具体测试数据见下表
实施例三本实施例生物传感器的基本结构与实施例一相同，具体制备过程如下1)、制备纳米石墨电极浆料1-1将15-30％的甲基丙烯酸、正丁基丙烯酸的共聚物和5-10％聚乙酸乙烯脂溶于70％混合溶剂(石油裂解芳香型有机溶剂)，在50-60℃条件下，缓慢溶解2-3小时，配制出高分子溶液；1-2将配制出的高分子溶液和石墨粉末均匀混合；1-3用混合溶剂将粘度调节到20-60Pa.s。
2)、制备参比电极浆料
2-1同1-1；2-2将配制出的高分子溶液与50-70％纳米级银、氯化银(比例Ag∶AgCl＝60∶40)在三滚密炼机中充分混合，剪切力度不断加大，直到分散相的粒度达到纳米级，配制出导电高分子粘合体系；2-3用混合溶剂将配制出的导电高分子粘合体系料的粘度调节到20-60Pa.s，制成参比电极浆料。
3)、制备工作酶浆料3-1将含有2-4％纳米金属Pt的改性纤纬树脂以1％的体积百分比含量加入100克0.2mM乳酸缓冲液；3-2再加入2％的纳米级酶体Glucose Oxidase葡萄糖氧化酶和0.1-5％纳米级促活剂Hexaammineruthenium chloride(六胺化氯化钌)，混合均匀；(此步骤中如再加入0.5-10％的纳米级二氧化硅将有助于促进固体颗粒的分散。)3-3用乳酸缓冲液将粘度调节到20-60Pa.s。
其余步骤同实施例一，不另赘述。；精度测试结果表明，标准静脉血液22℃测试结果精度均≤10％，所得测试结果关于直线y＝0.9678x-0.0868线性相关，相关系数为0.9987。
具体测试数据如下
以上实施例中未注明的比例和百分比均为重量百分比，各步骤中的百分比、时间、温度等均为优选参数，不难根据经验得出，这些参数在较大范围时，依然可以达到本发明的基本目的。
实验证明，本发明全面采用纳米技术，使得自我血糖监测与保健的质量显著提高，操作更方便，测试更准确、灵敏。同时，检测时间锁短到几秒，同时能够有效控制进样血液量或其它液体试剂的量。归纳起来，本发明具有如下有益效果1、采用纳米材料和纳米技术使生物传感器具有更高的反应灵敏性和精确度，精度可控制在10％之内，标准状态下的血糖值，精度大多达到5％，且有很好的线性和重复性。
2、采用纳米材料和纳米技术配方工艺，在提高精确度同时，使用更多的环保材料，其工作浆料99％是非有机化合物材料，使生产配方和工艺基本实现”绿色”环保，此外所用基本原材料只有市场现有产品的1/2-1/3，节省资源。
3、采用末端进血，在180度范围的任何方向和部位都可以开放型自由无阻力地虹吸，进血样大多在＜1秒(多数在0.2秒)虹吸完成，并且可以通过改变虹吸半径、虹吸板间距有效地控制进样量(血液或其它液体试剂)在纳米微升范围之内。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
权利要求
1.一种虹吸纳米生物传感芯片，主要由附着在基材上的两石墨电极、分别附着在两石墨电极上的参比电极和工作酶电极构成；其特征在于所述参比电极由金属纳米粉材分散在高分子粘合体系中形成的导电高分子粘合体系构成，含有纳米级聚集态和纳米级有效孔洞；所述工作酶电极由金属纳米粉以及酶活性组分分散在高分子粘合体系中形成的导电高分子粘合体系构成，含有纳米级聚集态和纳米级有效孔洞。
2.根据权利要求1所述虹吸纳米生物传感芯片及其制备方法，其特征在于所述各电极上表面覆盖起保护作用的塑料膜。
3.根据权利要求1或2所述虹吸纳米生物传感芯片及其制备方法，其特征在于所述参比电极和工作酶电极分别附着在两石墨电极前端。
4.根据权利要求3所述虹吸纳米生物传感芯片及其制备方法，其特征在于所述基材和塑料膜材质为聚对奔二甲酸乙二酯。
5.根据权利要求1所述虹吸纳米生物传感芯片的制备方法，包括以下步骤1)、制备石墨电极浆料1-1将所选高分子材料溶于相应的溶剂中，制成高分子溶液；1-2将石墨粉加入高分子溶液中，均匀混合；1-3添加溶剂，将粘度调节到适合于厚膜加工的粘度，制成石墨电极浆料；2)、制备参比电极浆料2-1同1-1；2-2将纳米金属粉散布在高分子溶液中，充分混合，不断加大剪切力，直到分散相的粒度达到纳米级，制成导电高分子粘合体系；2-3添加溶剂，将粘度调节到适合于厚膜加工的粘度，制成参比电极浆料；3)、制作工作酶电极3-1同1-13-2将纳米金属粉以及所选活性酶散布在高分子溶液中，充分混合，不断加大剪切力，直到分散相的粒度达到纳米级；3-3添加溶剂，将粘度调节到将粘度调节到适合于厚膜加工的粘度，制成工作酶电极浆料；或者3-1’同1-13-2’同2-23-3’将所选活性酶散布在导电高分子粘合体系中，充分混合；3-4同3-3；或者3-1”将含有纳米金属的复合高分子材料溶于相应的溶剂中，制成导电高分子粘合体系；3-2”将所选纳米级酶体和纳米级促活剂散布在导电高分子粘合体系中，混合均匀；3-3”同3-3；4)、制作芯片4-1将石墨电极浆料均匀附着在基材上，形成第一和第二石墨电极；4-2分别使参比电极浆料和工作酶电极浆料均匀附着在基材的第一和第二石墨电极上，形成纳米级聚集态和纳米级有效孔洞。
6.根据权利要求5所述虹吸纳米生物传感芯片的制备方法，其特征在于所述步骤1)中加入纳米级石墨，制成纳米石墨电极浆料。
7.根据权利要求6所述虹吸纳米生物传感芯片的制备方法，其特征在于所述各粘度调节步骤将粘度进一步调节到20-60Pa.s。
8.根据权利要求7所述虹吸纳米生物传感芯片的制备方法，其特征在于所述步骤3-2中再加入纳米级二氧化硅，其浓度范围0.5-10％。
全文摘要
本发明涉及一种生物传感芯片，同时还涉及该生物芯片的制备方法，属于医疗检测技术领域。本发明的虹吸纳米生物传感芯片主要由附着在基材上的两石墨电极、分别附着在两石墨电极上的参比电极和工作酶电极构成；所述参比电极由金属纳米粉材分散在高分子粘合体系中，形成纳米级聚集态和纳米级有效孔洞；所述工作酶电极由金属纳米粉以及酶活性组分分散在高分子粘合体系中，形成纳米级聚集态和纳米级有效孔洞。本发明的生物传感器反应灵敏性和精确度明显提高，且具有理想的线性和重复性，检测时间可以缩短在到几秒，检测所需血液等体液的采集量明显减少。
文档编号G01N27/327GK1825110SQ20061003790
公开日2006年8月30日 申请日期2006年1月20日 优先权日2006年1月20日
发明者韩进 申请人:南京剑桥医疗器械有限公司, 韩进