专利名称：农药倍硫磷残留免疫检测方法
技术领域：
本发明涉及农药倍硫磷残留酶联免疫吸附分析(ELISA)检测方法，属于生物技术领域。专用于农产品和农业生产环境中倍硫磷(Fenthion)农药残留的高灵敏度快速检测，特别适用于大批量样品检测和现场监测。
背景技术：
倍硫磷(Fenthion)属有机磷杀虫剂，结构为 毒性中等，杀虫谱宽，残效期长，使用广泛。倍硫磷残留对人、畜等具有一定危害性，倍硫磷的大量推广使用，必然会给环境卫生和农产品安全带来危害。因此世界各国都对倍硫磷在农产品中的最大允许残留量作了严格地规定，我国也不例外。
目前倍硫磷检测方法主要是传统的色谱法，该方法对机器依赖性强，成本高，操作复杂，分析时间长，难以满足高通量、快速、在线检测的要求。
上世纪70年代末，美国Bruce D.Hammock和他的合作者们开创了农药免疫定量分析技术；80年代后，免疫化学分析技术已成为优先研究、开发和利用的农药残留快速检测技术，美国化学会将免疫分析方法与GC(气相色谱)、HPLC(高效液相色谱)方法一起列为化学农药残留分析的三大支柱技术，是21世纪最具竞争性和挑战性的超微量检测技术。利用ELISA(酶联免疫吸附分析)方法不仅可以定性而且可以定量检测样品中的农药残留，这种分析方法对仪器设备要求不高，快速简便，一般无需对样品进行复杂的预处理，灵敏度高，特异性强，而且价格便宜，易于标准化、自动化和适于大容量样本分析等优点。已有文献报道了60多种杀菌剂、杀虫剂、除草剂等的ELISA检测方法的建立，其检测水平可达纳克(ng)甚至皮克(pg)。国外一些公司已开发出商品化的农药残留检测试剂盒，如Immunosystems Inc.的Res-I-Mune Carbifuran试剂盒可检测农药克百威残留，Environmental Diagnostics公司的EZ-Screen试剂盒可检测农药1605残留等。我国在这方面起步较晚，只是90年代后才有越来越多的单位和研究人员重视并从事农药免疫速测技术研究，并已取得一些成果，如刘凤权等人建立了农药速灭威的免疫检测方法并获得了相应的国家发明专利权。倍硫磷免疫检测技术国内还未见报道。
发明内容技术问题本发明的目的是针对现有色谱仪器技术中的倍硫磷检测方法操作较复杂、检测费用较高、检测效率低下的缺陷，提供倍硫磷ELISA检测方法，为倍硫磷农药残留找到一种既快速准确又简单低廉的超微量检测方法。对倍硫磷农药的残留量进行检测，准确度高、灵敏度高、简单、快速、低廉。
技术方案本发明农药倍硫磷残留量ELISA检测方法，包括(1)倍硫磷多克隆抗体制备采用倍硫磷人工抗原的免疫原“倍硫磷-牛血清白蛋白偶联物”，常规免疫方法免疫新西兰白兔，制备得到的抗倍硫磷的兔抗血清即为倍硫磷多克隆抗体；(2)包被采用倍硫磷人工抗原的包被抗原“倍硫磷-卵清蛋白偶联物”1.2μg/mL在微量分析板中每孔加50μL，4℃冰箱过夜，倒净，以常规洗涤缓冲液磷酸盐-吐温缓冲液洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；(3)封闭1％明胶作封闭物，微量分析板每孔100μL，37℃反应1小时，倒净，以常规洗涤缓冲液磷酸盐-吐温缓冲液洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；(4)加抗体及抗体与待测样品的混合液用稀释8000倍的倍硫磷抗血清与待测样品和空白抗原抗体反应溶液即常规磷酸盐-吐温缓冲液等体积充分混合，后以每孔50μL加到微量分析板中，37℃反应1小时，倒净，以常规洗涤缓冲液磷酸盐-吐温缓冲液洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；(5)加酶标二抗用pH7.4、0.15mol/L的常规洗涤缓冲液磷酸盐-吐温缓冲液将商品化的HRP-羊抗兔IgG稀释2000倍，微量分析板每孔加50μL，37℃反应1小时，倒净，以常规洗涤缓冲液磷酸盐-吐温缓冲液洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；(6)显色微量分析板每孔加50μL的四甲基联苯胺底物溶液，37℃显色反应10分钟(7)终止反应并读数加2mol/L的硫酸，微量分析板每孔加25μL，终止显色反应，酶联仪上450nm处读出吸光值，空白基质作阳性对照吸光值Bo，待测样品吸光值B；(8)数据处理计算出结合率B/Bo及Logit(B/Bo)，Logit(B/Bo)＝Ln[(B/Bo)/(1-B/Bo)]公式1代入如下检测方程Logit(B/Bo)＝-0.7575LogC-1.4928公式2其中C为微量分析板孔中测得的倍硫磷浓度，通过公式1和公式2可以求得；X＝n×2C，n为反应前样品被稀释的倍数公式3待测样品中以浓度X表示的倍硫磷残留量可通过公式3求得。
上述倍硫磷农药残留量ELISA检测方法中，抗原抗体反应液磷酸盐-吐温缓冲液中甲醇含量为5％、pH值为7.4、离子强度为0.15mol/L，微量分析板中每孔50μL。
公式2可由倍硫磷系列标准浓度的竞争曲线进行校正。
有益效果本发明在倍硫磷半抗原结构筛选等大量前期工作基础上开发了一组具有自主知识产权的ELISA组合(指分别用于免疫原和包被抗原的半抗原组合)，并以此半抗原组合建立了一套更加灵敏的倍硫磷ELISA方法。与现有倍硫磷检测技术相比，其优点和积极效果表现在(1)实用性好传统的农药分析主要在实验室进行，其前处理过程烦琐，分析速度慢、成本高，使用的大量有机溶剂易造成环境污染，且对实验室的仪器化程度和人员素质要求较高，不能满足农产品贸易对快速、简便、准确、大量检测的需求。而我们提供的倍硫磷ELISA检测方法具有操作简单、快速(以封闭好的微量分析板做检测只需要2～3小时即可)、分析成本低、分析容量大、安全可靠等优点，一般不需贵重仪器，可大量简化甚至省去前处理过程，对使用人员的专业技术水平要求不高，容易普及和推广，特别适用于大批量样本检测和现场监测。
(2)准确性高与我国目前市场上常用的快速检测方法速测灵、速测卡、速测仪等检测方法相比，倍硫磷ELISA检测方法准确度较高，重复性较好(平均变异系数低于5％)，倍硫磷抗体特异性识别倍硫磷农药，对其他农药几乎不识别。
(3)灵敏性高检测极限远低于其他常规方法，已经达到0.0002ppb，可以精确检测到10-9，即1ppb，远低于国家要求的50ppb的检测要求。检测曲线的斜率靠近1，较为合理。
(4)检测范围宽适宜的检测范围为0.001～1.382ppb。
具体实施例方式
倍硫磷免疫原“倍硫磷-牛血清白蛋白偶联物”的合成方法为(1)倍硫磷免疫半抗原4-(4-(二甲氧基硫代磷酰氧基)-2-甲基苯基胺基)-4-羰基丁酸(分子式C13H18NO6PS，结构式 )的合成称取O，O-二甲基-O-(3-甲基-4-硝基苯基)硫代磷酸酯2.1g(约7mmol)置于反应瓶中，加80mL无水乙醚溶解；搅拌下加入锌粉4.1g(约60mmol)；量取浓盐酸和冰醋酸的混和液21mL(HCl/CH3COOH＝1/9)，搅拌下缓慢滴加到反应瓶中，约1.5h滴完；加热至沸腾，回流1h后结束反应。待反应液自然冷却后，先在50mL乙醚帮助下，将反应终液转移到砂心布氏漏斗中，然后用20mL乙醚洗涤锌粉3次，洗液一并转入到砂心布氏漏斗中，减压过滤；滤液转移到分液漏斗，50mL水洗涤3次；乙醚层用无水碳酸钾干燥过夜，过滤后减压蒸馏，去掉乙醚后得到2.0g棕红色油状物；过硅胶柱(二氯甲烷作洗脱剂，Rf＝0.55)后得到油状产物1.4g。将上述油状产物1.4g加入反应瓶中，加90mL二氯甲烷搅拌溶解；称取丁二酸酐0.78g(约7mmol，稍过量)，加入反应瓶中。反应处于室温中磁力搅拌下进行，过夜后结束反应。反应终液经减压蒸馏去除二氯甲烷，残留固体经过无水乙醚处理，得到1.9g淡红褐色固体产物，即为倍硫磷免疫半抗原4-(4-(二甲氧基硫代磷酰氧基)-2-甲基苯基胺基)-4-羰基丁酸。
(2)倍硫磷免疫原“倍硫磷-牛血清白蛋白偶联物”的合成反应瓶中加入倍硫磷免疫半抗原4-(4-(二甲氧基硫代磷酰氧基)-2-甲基苯基胺基)-4-羰基丁酸0.385g和N-羟基琥珀酰亚胺0.131g，再加入N，N-二甲基甲酰胺0.5mL溶解；称取0.313gN，N-二甲基碳二亚胺，用0.3mLN，N-二甲基甲酰胺溶解，并滴加到反应瓶中；反应在磁力搅拌下室内温度进行4小时。将反应液置透析袋内，于0.2mol/LpH6.8的磷酸缓冲液中4℃搅拌透析，每4小时换一次透析液，共透析60小时。透析结束后，透析袋中的白色乳状液即为倍硫磷免疫原“倍硫磷-牛血清白蛋白偶联物”。将所得倍硫磷免疫原分装于若干1mL离心管中，于-20℃冰箱中存放备用。所合成的倍硫磷免疫原保存期限为3年。
倍硫磷包被抗原“倍硫磷-卵清蛋白偶联物”的合成方法为(1)倍硫磷包被半抗原6-(甲氧基(-(甲硫基)苯氧基)硫代磷酰胺基)己酸(分子式C15H24NO4PS2，结构式 )的合成采用YooJung Kim等人发表在学术刊物《Analytica Chimia Acta》上的方法合成化合物6-(甲氧基(4-(甲硫基)苯氧基)硫代磷酰胺基)己酸，该化合物被我们用作倍硫磷包被半抗原。Yoo Jung Kim等人发表的含有上述化合物合成方法的研究论文在《AnalyticaChimiaActa》上的具体位置为2003年第475卷第85至96页。
(2)倍硫磷包被抗原“倍硫磷-卵清蛋白偶联物”的合成反应瓶中加入倍硫磷半抗原6-(甲氧基(4-(甲硫基)苯氧基)硫代磷酰胺基)己酸0.035g和N-羟基琥珀酰亚胺0.013g，再加入N，N-二甲基甲酰胺0.3mL溶解；称取0.031g N，N-二甲基碳二亚胺，用0.3mLN，N-二甲基甲酰胺溶解，并滴加到反应瓶中；反应在磁力搅拌下室内温度进行4小时。将反应液置透析袋内，于0.2mol/L pH6.8的磷酸缓冲液中4℃搅拌透析，每4小时换一次透析液，共透析60小时。透析结束后，透析袋中的白色乳状液即为倍硫磷包被抗原“倍硫磷-卵清蛋白偶联物”。将所得倍硫磷包被抗原分装于若干1mL离心管中，于-20℃冰箱中存放备用。所合成的倍硫磷包被抗原保存期限为3年。
实施例1河水样品中检测倍硫磷残留倍硫磷多克隆抗体制备采用倍硫磷人工抗原的免疫原“倍硫磷-牛血清白蛋白偶联物”，常规免疫方法免疫新西兰白兔，制备得到抗倍硫磷的兔抗血清即为倍硫磷多克隆抗体，具体操作方法参照刘凤权等人的研究论文《定量测定甲胺磷残留的间接竞争ELISA的建立和初步应用》，该文刊登在《农业生物技术学报》1998年第六卷第二期第140至146页。
倍硫磷ELISA反应体系主要条件“倍硫磷-卵清蛋白偶联物”包被物1.2μg/ml在微量分析板中每孔加50μl，倍硫磷抗血清稀释16000倍作为工作浓度，1％明胶作封闭物，抗原抗体反应液磷酸盐-吐温缓冲液中甲醇含量为5％、pH值为7.4、离子强度为0.15mol/L，微量分析板中每孔50μl。
待测样品准备河水样品量取河水1L，加入倍硫磷标准品净重2μg，配制成2ppb的液体样品。
采用倍硫磷ELISA检测方法对以上样品进行检测，操作如下(1)包被“倍硫磷-卵清蛋白偶联物”作为包被物，1.2μg/mL在微量分析板中每孔加50μL，4℃冰箱过夜，倒净，以常规洗涤缓冲液磷酸盐-吐温缓冲液洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；(2)封闭1％明胶作封闭物，微量分析板每孔100μL，37℃反应2小时，倒净，以常规洗涤缓冲液磷酸盐-吐温缓冲液洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；(3)加抗体及抗体与待测样品的混合液取待测样品200μL加到800μL反应基质中配制成待测液，稀释8000倍的倍硫磷抗血清与待测液和空白基质液等体积充分混合，后以每孔50μL加到微量分析板中，37℃反应1小时，倒净，以常规洗涤缓冲液磷酸盐-吐温缓冲液洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；(4)加酶标二抗用pH7.4、0.15mol/L的磷酸盐-吐温缓冲液将商品化的HRP-羊抗兔IgG稀释2000倍，微量分析板每孔加50μL，37℃反应1小时，倒净，以常规洗涤缓冲液磷酸盐-吐温缓冲液洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干。
(5)显色微量分析板每孔加50μL的四甲基联苯胺底物溶液，37℃显色反应10分钟(6)终止反应并读数加2mol/L的硫酸，微量分析板每孔加25μL终止显色反应，酶联仪上450nm处读出吸光值，空白基质作阳性对照，Bo＝0.822，待测样品吸光值B＝0.314。
(7)数据处理计算出结合率B/Bo＝61.9％，代入公式1Logit(B/Bo)＝Ln[(B/Bo)/(1-B/Bo)]公式1得到Logit(B/Bo)＝-0.4798代入如下检测方程Logit(B/Bo)＝-0.7575LogC-1.4928公式2其中C为微量分析板孔中测得的倍硫磷浓度，求得C＝0.046ppb。待测样品中倍硫磷残留量(以浓度X表示)可通过公式3求得X＝20×2C 公式3求得待测样本倍硫磷残留量浓度X＝1.84ppb，结果与实际浓度相当。
实施例2桃果实样品中检测倍硫磷残留倍硫磷ELISA反应体系主要条件同实施例1。
待测样品准备桃果实样品称取100g切碎的桃果实，加入倍硫磷净重2μg，配制成20ppb的固体样品。
采用倍硫磷ELISA检测方法对以上样品进行检测，操作如下步骤(1)、(2)同实施例1。
(3)加抗体及抗体与待测样品的混合液称取待测样品0.1g，用0.2ml甲醇浸泡1小时左右，取100μL加到900μL反应基质中配制成待测液，稀释8000倍的倍硫磷抗血清与待测液和空白基质液等体积充分混合，后以每孔50μL加到微量分析板中，37℃反应1小时，倒净，以常规洗涤缓冲液磷酸盐-吐温缓冲液洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；步骤(4)、(5)、(6)同实施例1；(7)数据处理计算出结合率B/Bo＝23.2％，代入公式1Logit(B/Bo)＝Ln[(B/Bo)/(1-B/Bo)]公式1得到Logit(B/Bo)＝-1.1971代入如下检测方程Logit(B/Bo)＝-0.7575LogC-1.4928公式2其中C为微量分析板孔中测得的倍硫磷浓度，求得C＝0.41ppb。待测样品中倍硫磷残留量(以浓度X表示)可通过公式3求得X＝20×2C 公式3求得待测样本倍硫磷残留量浓度X＝16.4ppb，与实际浓度基本接近。
权利要求
1.农药倍硫磷残留量的免疫检测方法，包括(1)倍硫磷多克隆抗体制备采用倍硫磷人工抗原的免疫原“倍硫磷-牛血清白蛋白偶联物”，常规免疫方法免疫新西兰白兔，制备得到抗倍硫磷的兔抗血清即为倍硫磷多克隆抗体；(2)包被采用倍硫磷人工抗原的包被抗原“倍硫磷-卵清蛋白偶联物”1.2μg/mL在微量分析板中每孔加50μL，4℃冰箱过夜，倒净，以常规洗涤缓冲液磷酸盐-吐温缓冲液洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；(3)封闭1％明胶作封闭物，微量分析板每孔100μL，37℃反应1小时，倒净，以常规洗涤缓冲液磷酸盐-吐温缓冲液洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；(4)加抗体及抗体与待测样品的混合液用稀释8000倍的倍硫磷抗血清与待测样品和空白抗原抗体反应液磷酸盐-吐温缓冲液等体积充分混合，后以每孔50μl加到微量分析板中，37℃反应1小时，倒净，以常规洗涤缓冲液磷酸盐-吐温缓冲液洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；(5)加酶标二抗用pH7.4、0.15mol/L的常规洗涤缓冲液磷酸盐-吐温缓冲液将商品化的HRP-羊抗兔IgG稀释2000倍，微量分析板每孔加50μL，37℃反应1小时，倒净，以常规洗涤缓冲液磷酸盐-吐温缓冲液洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；(6)显色微量分析板每孔加50μL的四甲基联苯胺底物溶液，37℃显色反应10分钟(7)终止反应并读数加2mol/L的硫酸，微量分析板每孔加25μL终止显色反应，酶联仪上450nm处读出吸光值，空白基质作阳性对照吸光值Bo，待测样品吸光值B；(8)数据处理计算出结合率B/Bo及Logit(B/Bo)，Logit(B/Bo)＝Ln[(B/Bo)/(1-B/Bo)]公式1代入如下检测方程(公式2可由倍硫磷标准系列浓度的竞争曲线进行校正。)Logit(B/Bo)＝-0.7575LogC-1.4928 公式2其中C为微量分析板孔中测得的倍硫磷浓度，通过公式1和公式2可以求得；X＝n×2C，n为反应前样品被稀释的倍数 公式3通过公式3求得待测样品中以浓度X表示的倍硫磷残留量。
2.根据权利要求1所述的农药倍硫磷残留量ELISA检测方法，其特征在于以“倍硫磷-牛血清白蛋白偶联物”作为免疫原制备倍硫磷抗体，以“倍硫磷-卵清蛋白偶联物”作为包被抗原，抗原抗体反应液磷酸盐-吐温缓冲液中甲醇含量体积比为5％、pH值为7.4、离子强度为0.15mol/L，微量分析板中每孔50μL。
全文摘要
本发明涉及农药倍硫磷残留免疫检测方法，属于生物技术领域。农药倍硫磷残留ELISA检测方法中，以“倍硫磷－牛血清白蛋白偶联物”作为免疫原制备倍硫磷抗血清即倍硫磷多克隆抗体，其检测方程为Logit(B/Bo)＝－0.7575LogC－1.4928(其中B为样品孔吸光值，Bo为阳性对照吸光值，C为板孔中测出的倍硫磷浓度)，检测条件为倍硫磷包被抗原“倍硫磷－卵清蛋白偶联物”1.2μg/ml在微量分析板中每孔加50μl，倍硫磷抗血清稀释16000倍作为工作浓度，1％明胶作封闭物，抗原抗体反应液磷酸盐－吐温缓冲液中甲醇含量为5％、pH值为7.4、离子强度为0.15mol/L。本方法具较强的特异性、灵敏性及稳定性，为倍硫磷超微量检测提供了快速、灵敏、准确的技术方法。
文档编号G01N33/543GK101038288SQ20071002137
公开日2007年9月19日 申请日期2007年4月10日 优先权日2007年4月10日
发明者刘凤权, 张奇, 胡白石 申请人:南京农业大学