专利名称：：涉及发光化合物的组合物、方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明公开而来涉及发光化合物的组合物、方法和试刑盒，具体而言，涉及一种检测荧光素酵的酶活性的方法.
背景技术：
：报道分子通常在生物、生化、免疫、细胞生物学和分子生物学领域中用于监测分子状态.例如，报道分子在分析中使用，其中报道分子的水平是由从与报道分子连接的特定启动子进行转录而引起的.报道分子分析可以用于研究生物学过程，包括基因表达、受体活性、转录因子、胞内信号传导、mRNA处理和蛋白质折叠。通常用于这种分析的报道分子的分析包括检测放射性同位素、酶活性、荧光或发光分析法。该技术一般由Akhavan-Tafti等在"BioluminescenceandChemiluminescence-FundamentalsandAppliedAspects*Proceedingsofthe8(hInternationalSymposiumonBioluminesceneandChemiluminescene"Cambridge,1994年9月,Campbel，Kricka,Stanley,JohnWileyandSons1994中讨论*在生物分析中的发光通常涉及发光(luminogenic)蛋白质的活性，用于分析体系中的发光蛋白质包括、但不限于Renilla荧光素醉，Oplophorus荧光素酶，Vargula(Cypridina)荧光素酶，Gaussia荧光素醉和水母蛋白.在发光反应中，发光蛋白质与适宜分子(称为发光体)之间的相互作用产生作为反应产物之一的光.可以检测在该反应中产生的光量(即光子的数目).这种检测可以用于定性地检测在样品中是否存在特定的物质。这种检测还可以用于定量地计算在反应中发光蛋白质和/或发光体的浓度。发光反应可以用于检测非常少量的特定分析物，该物质在分析中确认和检测。例如，发光反应可以用于检测和定量蛋白酶、脂酶、磷酶、过氣化酶、糖苷酶、各种代谢物例如ATP或NADH,和报道分子.发光反应还可以用于通过结合相互作用检测和定量分析物，例如通过抗体和核苷酸探针介导的那些，发光反应的另一个应用是生物发光共振能量转移(BRET),它能测定两个分子是否能互相结合或在细胞内共定位(Angers等，Proc.Natl.Acad,Sci.U.S.A.97(7):3684—9，2000).通常，发光反应可以用于检测在样品中存在的小于约1x10"摩尔、通常小于lxlO"摩尔的分析物.当使用发光检测分析物时，优选由与分析物的存在无关的反应产生的光极少或没有.例如，在通常用于Renilla荧光素酶的分析条件下，即使当发光蛋白质不存在时也通常能检测到光.与发光蛋白质的催化活性无关的发光称为自动发光.这种自动发光被认为是"背景"，因为它不提供关于体系的有用信息，而是对整个发光输出有贡献.自方法的有用性(即"信号")。如果噪音的幅度与实际信号的幅度相比是显著的，则这是成问題的。这种检测的不确定性可以通过信号(S)和背景(B)的幅度之比或信号/背景之比(S/B)来定量化.自动发光可以例如是由发光体的自发氣化作用引起，而且，向分析体系加入各种组分，例如类脂(特别是在临界胶束浓度或CMC之上)、疏水性蛋白质(特别是具有特定三维结构的那些)以及含有疏水性微环境的细胞或其它生物物质，可大大提高自动发光.一类显示自动发光性的发光体是水母水通道蛋白辅因子(coelenterazine).水母水通道蛋白辅因子与许多海生的荧光素醉相互作用，由于水母水通道蛋白辅因子氣化成各自的coelenteramide而产生光.如果该氧化作用通过发光蛋白质来促进，则光子与基质和蛋白质之间的相互作用对应，从而产生信号.水母水通道蛋白辅因子还可以对背景作出贡献，这是因为当处于溶液中时有自发发光氣化作用，即使当不存在发光蛋白质时也是如此.除了产生背景之外，这种不稳定性还会导致发光信号的寿命短.这导致需要在短时间内检测许多样品的发光，进而在总体分析中引入了不确定性.已经试图通过改进水母水通道蛋白辅因子的发光响应来研究对水母水通道蛋白辅因子的改进.受影响的水母水通道蛋白辅因子性能包括对钙离子(Ca")的敏感性(Shimomura等，Biochem.J.296:549-551，1993;Shimomura等，Biochem.J.261:913-920,1989);对过氣化物阴离子(02)的敏感性(Teranishi等，Anal.Biochem.249:37-43，1997);对于单独发光蛋白质的特异性(Inouye等，Biochem，Biophys.Res.Comm.233:349-53，1997);和细胞膜的渗透作用(Shimomura,Biochem.J.326:297-298，1997).通常，衍生物与天然水母水通道蛋白辅因子的区别在于与咪唑并哌唤核结构连接的取代基的性质。尽管在特定分析环境中有改进，但是没有报道这些改进的水母水通道蛋白辅因子能遊免自动发光的问题.所以，希望提供能直接或间接地用作发光体并能在常规使用条件下提供自动发光较少的组合物，这些组合物可以进一步显示相对于常规发光体而言提高的稳定性，还希望提供对不属于发光蛋白质的物质敏感的组合物。这种组合物与这些物质的相互作用能够将组合物转化成发光体.这种多功能组合物因此能提供一种通过发光方法分析非发光物质或过程的方式，
发明内容在本发明的一个方面，提供式(XII)的化合物在该化合物中，R'是H、烷基、杂烷基、芳基或-CH广C晶0R";R'是H、烷基、杂烷基或芳基；R'是H、烷基、杂烷基、芳基或-C^OR15;R'。是-H、-CH3、或-CH(CH丄；和R"、R14和R"独立地是酶可除去的基团；前提是R"、R"和R"不都是乙酰基.在本发明的另一个方面，提供式(XII)的化合物，其中IT是H、烷基、杂烷基、芳基或-CH广CAOR";W是H、坑基、杂烷基或芳基；R'是H、烷基、杂烷基、芳基或-C晶0R";R"是-H、-CH"或-CH(CH3)2;和R11、R"和R"独立地是酶可除去的基团。在22TC下含有F12培养基和10%胎牛血清的混合物中，该化合物的浓度在45分钟后降低小于50、在本发明的另一个方面，提供式an)的化合物，其中r是H、烷基、杂烷基、芳基或-CH广C晶0R";R8是H、烷基、杂烷基或芳基；R'是H、烷基、杂烷基或-C^OR'5;R'。是-H、-CH3、或-CH(CH^;和R11、R"和R"独立地是酶可除去的基团，除去至少一个酶可除去的基团提供了母体化合物(parentcompound)，和使在221C下含有F12培养基和10X胎牛血清的混合物中该化合物的浓度降低50X所需的时间大于使得在221C下在含有F12培养基和IOX胎牛血清的混合物中母体化合物的浓度降低50X所需的时间.在本发明的再一个方面，提供式(XIII)或(XIV)的化合物(XIII)(XIV)在该化合物中，IT是H、烷基、杂烷基、芳基或-CH2-C^0R";r是H、坑基、杂烷基或芳基；R"和R"独立地是-H、-OH、烷基、杂烷基、芳基或-0R";n是0、1或2;和R11、R"和R"独立地是酶可除去的基团.在本发明的另一个方面，提供在溶液中含有上述化合物之一的组合物.在本发明的另一个方面，提供受保护的发光体，它是修饰的水母水通道蛋白辅因子，其中烯醇基团已经被转化成含有酶可除去的基团的醋或鍵；所述酶可除去基团的除去提供了母体水母水通道蛋白辅因子.使得在22TC下含有Fl2培养基和10X胎牛血清的混合物中的修饰的水母水通道蛋白辅因子的浓度降低50S所需的时间大于使得在221C下在含有F12培养基和IOX胎牛血清的混合物中母体水母水通道蛋白辅因子的浓度降低50X所需的时间.在本发明的另一个方面，提供包含受保护的发光体和发光蛋白质的试刑盒，在本发明的另一个方面，提供包舍受保护的发光体和脱保护的酶(deprotectingenzyme)的试刑盒.发光体和脱保护酶处于独立的容器中.在本发明的另一个方面，提供一种检测发光蛋白质的酶活性的方法，包括使发光蛋白质、脱保护的酶和受保护的发光体在溶液中接触以形成组合物；和检测由该组合物产生的光.在本发明的另一个方面，提供一种在包含荧光素醉的活细胞中产生发光的方法，该方法包括使溶液中的细胞与受保护的发光体接触.在本发明的另一个方面，提供一种检测非发光性酶的酶活性的方法，包括使非发光性酶与含有发光蛋白质和受保护的发光体的液体混合物接触以形成组合物；和检测由该组合物产生的光，具体实施例方式本发明提供通过化学方式改变发光体以获得具有比未改变的基质更高的稳定性的受保护发光体的方法.还提供能用作发光蛋白质的受保护发光体的各种组合物。受保护的发光体可以至少部分被转化成发光体，使得所得的基质与发光蛋白质相互作用.受保护的发光体提供了降低的自动发光，例如在培养基中，且不会相似地降低在细胞内的发光蛋白质依赖性发光.这种效应通过提高信号/背景之比帮助增加分析灵敏度.本发明的组合物用于各种分析应用中，对于使用培养的细胞的现场应用，这些组合物可以提供发光体和发光蛋白质的共定位.这些組合物可以用于检测和定量发光分析物，这些分析物可以是基质或蛋白质.这些组合物可以进一步用于检测和定量用于将受保护发光体转化成发光体的酶.现场检测还包括基因报告基因(reporter)的分析，例如多重报告基因，其中至少一个报告基因使用发光体.对于在有机体内的体内应用，共定位可以用于提供研究细胞生长.用于非发光性酶的受保护发光体的特异性可以用于检测在特定器官、组织或细胞类型中的发光分析物，或用于检測其中的非发光性酶.对于体外应用，可以检测各种物质和随时间的进程.这些分析包括例如发光蛋白质的表达，分析物的浓度，和用于将受保护发光体转化成发光体的非发光性酶的表达.基质用于本发明的发光体包括称为水母水通道蛋白辅因子的一类化合物，术语水母水通道蛋白辅因子定义为具有咪唑并哝唤结构的分子，其特征在于当与给定的发光蛋白质在溶液中接触时能发光。已经知道水母水通道蛋白辅因子当与各种发光蛋白质作用时能发光，特别是海生的荧光素酶.海生的荧光素酶的例子包括Renilla荧光素酶，水母蛋白，Gaussia荧光素醉，0plophorus荧光素醉和Cypridina荧光素酶.水母水通道蛋白辅因子的例子是下面的结构I-Ill:(I)(")(川)其中R'、R2、IT和R4独立地是H、烷基、杂烷基、芳基或其组合.f和R'可以独立地是H、0H、烷基、杂烷基、芳基或其组合.对于结构II，n可以是0、1或2，优选是1.优选R'A-CH2-C6H5、-CH2—C6H4OH、-CH2-C6H4P、CH(CH3)CH2CH3或萘基(结构IV-A),优选R2是-CH广C晶、-(CH2)3NHC(-N)NH2、-CH2C6H(结构IV-B)或-CH2C5H,(结构IV-C)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>优选R3是-C晶0H、一C晶跳、-C6H5、-C晶F或吲哚基(结构V),<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>(V)优选^是H、CH]或CH(CH])2,优选R5和W独立地是H或0H,在这里使用的"烷基"是含有1-20、优选1-15个碳原子的烃链，可以是直链、支链的或环状的；例如-CH3、-CH2(CH2)nCH3、-(CH2)nCH(CH3)2、_(CH2)nC(CH3)3(其中n是整数)，金刚烷基，和结构IV-B和IV-C。"杂烷基"是还舍有一个或多个杂原子例如0、N、S和卤素的烷基；例如-(CH2)n-0-(CH2),CH3、-(CH2)n-C(=0)-N(CH3)2、-(CH2)3NHC(-N)NH2和-(CH丄-C(-0)OH，其中n和m是整数。"杂环"是含有2-30个碳原子和至少一个杂原子(0、N或S)的烃，使得形成含有该杂原子的环。该环可以是饱和的、部分不饱和的或芳族的，可以是被取代的。该环可以是单-、双-或多环的.例子包括吖咬、苯并噢唑啉、苯并咪唑、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并噱唑、苯并疏代苯基、呼唑、噌啉、呋喃、咪唑、1H-吲唑、吲哚、异吲哚、异喹啉、异噻唑、吗啉、喝唑(即1，2，3-喝二唑)、吩嗪、吩嚷嗪、吩哺唤、2，3-二氮杂萘、哌嗪、蝶啶、嘌呤、吡嗪、吡唑、哒嗪、吡啶、嘧啶、吡咯、喹唑啉、喹啉、喹喔啉、噻唑、1，3，4-噻二唑、噱汾、1，3，5-三唤、三唑(即1，2，3-三唑)等，"芳基"是含有6-30个碳原子和至少一个芳族碳环基团的烃，任选地具有含有杂原子例如0、N或S和卤素的取代基；例如-C晶(苯基)、-C6,、-C6H4-C6H5、-C9H7、-C6H4OCH3、-C6H4NH2、-C6H,SH、哉-。5和萘基.水母水通道蛋白辅因子包括天然水母水通道蛋白辅因子和修饰的水母水通道蛋白辅因子，可从PROMEGACORPORATION(Madison,WI)和从MOLECULARPROBES,INC(Eugene,OR)获得，水母水通道蛋白辅因子也可以合成，例如Shimomura等在Biochem.J261:913-20，1989;Inouye等，Biochem，Biophys.Res.Co,.233:349-53，1997;和Teranishi等，Anal.Bioche迈.249:37-43，1997中所迷。天然水母水通道蛋白辅因子和修饰的水母水通道蛋白辅因子统称为"水母水通道蛋白辅因子"，并用作发光蛋白质的发光体。这些发光体的具体例子包括基于在下表A中列出的结构I的那些，以及基于在下表B中列出的结构II和III的那些.具有结构VI的水母水通道蛋白辅因子统称为"水母水通道蛋白辅因子"，结构VII统称为"水母水通道蛋白辅因子-h"，结构VIII统称为"二脱氣基水母水通道蛋白辅因子"，分别对应于表A中的笫1、2和3列.<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>水母水通道蛋白辅因子可以用作各种发光蛋白质的发光体.影响这一相互作用的因素包括发光蛋白质的性质和周围环境的特性.例如，发光蛋白质例如Renilla或Oplophorus荧光素酶或水母蛋白与水母水通道蛋白辅因子在氧气和至少痕量辅因子Ca"的存在下的相互作用将产生光.水母水通道蛋白辅因子在该过程中被氧化成其相应的Coelenteramide，如下所示，(VI)来自这些相互作用的光可以检测，和在一些体系中与蛋白质的量、水母水通道蛋白辅因子和/或涉及的辅因子相关。发光检测通常是通过将从具有给定表面积的样品发出的光的强度积分来进行，用于检测发光的仪器包括发光计、电荷耦合设备(CCD)和光电倍增管.受保护的发光体受保护的发光体能提高发光分析的应用性。"受保护的发光体"定义为已经被修饰使得它不再与发光蛋白质相互作用而发光的水母水通道蛋白辅因子。如果修饰方式是向水母水通道蛋白辅因子中引入酶可除去的基团，则受保护的发光体与适宜的酶发生相互作用，产生能发光的活性水母水通道蛋白辅因子.能将受保护的水母水通道蛋白辅因子转化成发光体的酵优选是非发光性酶。所有上述水母水通道蛋白辅因子可以被转化成受保护的发光体。术语"基团"是指化合物的任何部分。一般而言，这种衍生作用涉及官能团例如苯盼(-C晶OH)、羰基(>O0)和苯胺(_C6H4NH2)基团转化成对其环境不太活泼的基团。因为官能团的正常反应性被酶可除去基团的存在所抑制，所以酶可除去的基团可以称为保护基团。可能的保护基团包括酯，它能通过与酯酶的相互作用而除去，可能的保护基团还包括磷酰基，它能通过与磷酸酶(包括磷酸二酯酶和碱性磷酸醉)的相互作用而除去.可能的保护基团还包括葡糖基，它能通过与糖苷酶、a-D-半乳糖苷、p-D-半乳糖苷、a-D-葡糖苷、D-葡糖苷、ot-D-甘露糖苷、p-D-甘露糖苷、P-D-呋喃果糖苷和P-D-葡糖苷酸的相互作用而除去.本领域技术人员将能认识到其它可用于本发明的酶可除去基团，酶与酶可除去基团之间的相互作用例如描述在美国专利5831102以及Tsien，R.Y.Nature,290:527-28，1981.'Redden,P丄等，IntJPharm，180:15卜60，1999;和Annaert，P等，Pha函ceutRes，14:492-96,1997中，酶可除去的基团可以设计成使得它们只能通过与特定醉的作用而除去.例如，特定的脂肪酸可以用作酶可除去的基团，和仅仅特定的酯酶将这些受保护的发光体转化成发光体.可以使用具有高位阻的保护基团，例如叔丁基.这种保护基团可以用于屏蔽能对体积大的位阻醋起作用的新型酯酶，氨基酸也可以用作保护基团.受保护的发光体可以进一步通过用与保护基团连接的氮原子取代烯醇氣原子来进一步修饰.这种保护基团然后可以用蛋白酶除去，随后将受保护的发光体水解成烯醇/羰基，从而提供发光体.这些酶可除去的基团优选是醇官能团的衍生物，在水母水通道蛋白辅因子中的羰基官能团的情况下，衍生作用可以涉及将羰基转化成烯醇基团(-C-C-0H),水母水通道蛋白辅因子的羰基和烯酵形式可以是在溶液中的动态平衡，使得总是有一定比例的处于烯醇形式的基质.烯醇的幾基(-0H)可以衍生，经由用跣化刑形成醋的衍生作用在下面示意性地说明。具有结构VI的水母水通道蛋白辅因子含有两个盼基和一个羰基，任何这些基团的组合可以受保护.用醚保护基团进行的衍生反应可以例如通过用烷基化剂例如乙酰氣基甲基溴处理水母水通道蛋白辅因子来进行.用酯保护基团进行的衍生可以例如通过用酰化刑例如乙酰酸酐或乙酰氯处理水母水通道蛋白辅因子来进行。这些衍生作用是在碱性条件下进行，即pH为7-14.在这些条件下，酚羟基以及咪唑啉稱氧(imidazoloneoxygen)都可以反应形成相应的酯或醢.认为咪唑稱氣当处于烯醇形式时发生反应.保护/脱保护方法以及各种保护基团的例子描述在"ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis"中，Greene,Wuts编辑，JohnWileyandSons,纽约，1991.衍生方法的一个例子是从水母水通道蛋白辅因子VI合成受保护的发光体IX.受保护的发光体IX也称为三乙酰基-水母水通道蛋白辅因子，这是因为存在三个乙酰基保护基团.已经报道了具有结构IX的化合物用作中间体以试图形成天然水母水通道蛋白辅因子VI的结构(Inoue等，TetrahedronLetters31:2685-2688(1977)).预期受保护的发光体IX将具有比其它受保护发光体稍低的稳定性，这是考虑到由乙跣基衍生的烯醇基团的易反应性.对于给定的保护基团，衍生的烯醇比类似衍生的纷更易反应.这种烯醇衍生物的增加的反应能力允许烯醇衍生物进行选择性水解以再次提供咪唑啉稱的羰基.这类化合物称为部分受保护的物质，因为一部分官能团受保护，而另一部分则不受保护.这些部分受保护的物质可以用于生物学分析，或它们可以进一步与不同的酰化剂或烷基化剂反应形成不对称的化合物，即具有多于一种保护基团的化合物.适宜保护基团的选择取决于所考虑的细胞类型和所需的水解速率。选摔性水解可以例如如Inoue等，TetrahedronLetters31:2685-2688(1977)中所述进行.这表示在下面的反应路线中，其中将三乙酰基-水母水通道蛋白辅因子(IX)选择性水解成二乙跣基-水母水通道蛋白辅因子(X)和随后形成不对称的受保护发光体(XI).结构ni-xiv显示了在羰基上具有保护基的受保护发光体。(x")(x川)(xiv)R7、R8、R'和R'。可以独立地是H、烷基、杂烷基、芳基或其组合,R"和R"可以独立地是-0R"、H、0H、烷基、杂烷基、芳基或其组合，对于结构XIII，n可以是0、l或2，优选是l.优选，R'是如对于R'所述的含义或是-CH「C晶OR".优选，W是如对于R2所述的含义，和R'。是如对于R4所述的含义.优选，R'是如对于^所述的含义或是-C6H40R15.R11、R"、R"和R"—起表示为IT,是保护基团，可以独立地是各种保护基团的任何一种.优选，这些物质与其相应的氣原子一起是酸、醋或其组合.例如，保护基团可以是乙酰基(Rp=-C(=0)-CH3)、丁酰基(RP--C(-0)-C3H7)、乙酰氣基甲基(Rp=-CH广O-C(-0)-CH3)、丙酰氧基甲基(IT--CH2-0-CH))-C2H5)、丁酰氣基甲基(-CH广O-C(=0)_C3H7)、新戊酰氣基甲基(Rp=-CH广O-C(-0)-C(CH3)3)或叔丁酰基(Rp=-C(-0)-C(CH3)3),受保护发光体的具体例子包括三乙酰基-水母水通道蛋白辅因子(IX)、三丁酰基-水母水通道蛋白辅因子(XV)、二乙酰基-水母水通道蛋白辅因子-h(XVI)、乙酰氧基甲基二乙酰基-水母水通道蛋白辅因子(XVII)、乙酜氧基甲基乙酰基-水母水通道蛋白辅因子-h(XVIII)、新戊酰氧基甲基-水母水通道蛋白辅因子-h(XIX)和乙耽氣基甲基-二脱氧基水母水通道蛋白辅因子(XX)'(xv")(xv"i)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>当受保护的发光体与适宜的脱保护醉相互作用时，保护基团被除去，恢复了初始官能团.对于酯和瞇保护基团，脱保护酶可以例如是任何水解酶，包括酯酶。对于水母水通道蛋白辅因子，在其脱保护形式中具有羰基官能团(即羰基)使得与发光蛋白质发生发光相互作用，发光蛋白质包括Renilla荧光素酶，0plophorus荧光素酵，Cypridina荧光素酶和水母蛋白。受保护的发光体可以仅仅需要在羰基位置被脱保护而转化成发光体。但是，保护基团在纷羟基上的存在可能仍然阻碍或防止发光相互作用。受保护发光体的性能受保护的发光体显示在正常使用条件下比其相应发光体更高的稳定性.水母水通道蛋白辅因子通常在溶剂化时、特别是在具有中性pH以上的水溶液(例如细胞培养基)中是不稳定的，这种不稳定性导致自动发光。自动发光为体系中的检测背景作出贡献，降低了检测的灵敏度.而且，这种不稳定性会引起信号的持续时间较短.这种持续时间通过信号的半衰期来定量，半衰期定义为信号衰减到其初始幅度一半时所需的时间，对于受保护发光体和发光体而言，"稳定性"定义为特定化合物在特定环境中的半衰期。半衰期为化合物浓度减低到其初始浓度一半时所需的时间.特定化合物的存在和/或浓度可以通过各种本领域技术人员公知的技术来检测，这些技术包括例如核磁共振谦(NMR)和高效液相色谦(HPLC).优选，稳定性通过首先将受保护发光体或发光体与含水混合物混合以得到初始浓度来检测.所述含水混合物优选是在22TC下含有10%胎牛血清的F12培养基。然后按照特定时间间隔从该混合物中取出小份样品，通过HPLC检测化合物的浓度.测量浓度降低到初始浓度的50X所需的时间是半衰期.较长的半表期对应于更稳定的化合物.本发明的受保护发光体比其相应的发光体更稳定.在对比稳定性的过程中，发光体称为受保护发光体的"母体化合物"，这是因为所有酶可除去的基团已经被除去，受保护发光体的其它"母体化合物"是部分脱保护的衍生物.也就是说，母体化合物包括其中至少一个酶可除去基团已被除去的受保护发光体.例如，化合物VI和X都是化合物IX的母体化合物.受保护发光体的显著稳定性提供了对发光分析的各种改进.例如，受保护的发光体在与发光蛋白质接触时不会发光，而是必须先与适宜的脱保护酶发生相互作用。因此，受保护的发光体可以在发光蛋白质的附近被转化成发光体.不如受保护发光体稳定的发光体免受去稳定化的影响(即自动发光)，这是因为该发光体不是处于其活性形式，直到与脱保护酶发生相互作用为止.如果将脱保护酶限定到细胞或有机体中的特定区域，则可以仅仅在该区域中检测发光。受保护的发光体在发光分析中的应用可以提供许多其它优点，包括提高分析的信号/背景之比和改进发光信号的稳定性.分析体外在本发明的具体实施方案中，受保护的发光体可以用作分析试剂。使用荧光素酶的分析是本领域公知的。这些分析特别用于分析生物机制，例如基因表达和调节。通常，细胞与编码荧光素酶的核酸转染，然后分解生产蛋白质提取物.荧光素酶在蛋白质提取物中的存在通过添加试剂(包括基质)来检测.在优选实施方案中，受保护的发光体在包括Renilla荧光素酶的分析中使用。Renilla荧光素酶可以是在分析中使用的唯一发光蛋白质(Srikantha等，J.Bacteriol，178(1):121-9，1996;LiuandEscher,Gene237(1):153-9，1999)可以与一种或多种其它发光蛋白质一起存在(Skarpidi等，Blood96(1):321-6，2000;Parsons等，Anal.Biochem.281(2):187-92，2000;Stables等，J.Recept.SignalTransduct.Res.19(H):395—410，1999;Grentzmann等，RNA4(4):479-86，1998)，或可以是融合蛋白质与另一种发光蛋白质的一部分(Liu等，Luminescence15(1):45-9，2000),在一些实施方案中，受保护的发光体用于这样的分析中，其中脱保护酶在添加分析试剂之前就存在于样品中.这种分析可以用于检测脱保护酶在样品中的存在的方法中.例如，Renilla荧光素酶和受保护发光体可以加入样品中。如果脱保护酶存在于样品中，则受保护发光体将被活化，并可以达到荧光素酶而产生光，如果脱保护酶不存在，则受保护的发光体保持不能达到荧光素酶，从而不能产生光.这些分析还可用于检测脱保护酶在样品中的相对浓度，在另一个实施方案中，脱保护酶包含在分析试刑中.例如，在包含甲虫和Renilla荧光素酶的双重荧光素酶分析中，ATP、荧光素和受保护的发光体可以先加入样品中.甲虫荧光素酶将利用ATP和荧光素，并检测产生的光。随后加入脱保护酶.脱保护酶通过从烯醇/羰基基团除去至少一个保护基而活化了水母水通道蛋白辅因子.因此，基质具有能参与水母水通道蛋白辅因子-ReniUa荧光素酶的发光相互作用的羰基，并检测产生的光.在另一个实施方案中，使用甲虫和Renilla荧光素酶，这些分析用于检测或定量样品中的细胞.因为甲虫荧光素酶取决于ATP的活性，所以它用于检测样品中的ATP.这种依赖性已经被利用来用甲虫荧光素酶产生ATP分析、细胞检测分析和细胞活性分析.使用具有受保护的发光体的单一双重荧光素酶分析，可以检测在ATP和脱保护酶在样品中的存在.分析现场本发明的化合物特别用于分析细胞的现场方法.使用荧光素醉进行细胞现场分析的方法是本领域公知的，参见美国专利5998204.本发明的受保护发光体需要除去保护基团而成为荧光素酶的基质.但是，一旦除去了保护基团，这些化合物可以立即用作荧光素酶的基质.因此，可以通过现场成像测定脱保护酶在细胞中的位置.这可以通过使表达荧光素酶例如Renilla荧光素酶的细胞与受保护发光体接触来进行.无论能使受保护发光体脱保护的酶位于细胞中的何处位置，都将发光.这种发光可以通过成像系统检测到.受保护发光体也用于分析报道基因表达.用于将受保护发光体转化成发光体所要求的脱保护酶的生产受到许多因素的影响.因为脱保护酶的存在和量可以通过使用受保护发光体来检测，所以可以研究这种酶的表达。使用生物发光共振能转移(BRET)，可以检测两个分子是否能互相结合或者共定位在细胞中(Angers等，Proc.Nat1.Acad.Sci.U.S.A97(7):3684-9，2000)。BRET涉及使用两个生物发光分子或者一个生物发光分子和一个荧光分子.选择这些分子，使得给体的发射波长处于受体的激发范围中。此外，两个分子的激发和发射范围应该最小程度地重叠。当分子彼此接近时，给体的激发导致能量转移到受体而不是发射光。然后，受体发射出光形式的转移能量.因此，当分子彼此接近时，从给体检测的光弱，而从受体检测的光强。当分子不是彼此接近时，从给体检测的光强，而从受体检测的光弱(PCT出版物W099/66324),通过将给体与笫一种蛋白质结合并将受体与第二种蛋白质结合，两种蛋白质之间的相互作用可以通过BRBT检测来测定.(Angers等，2000),在优选的实施方案中，给体是Renilla荧光素酶，受体是绿色荧光蛋白质.当受保护的发光体在这些分析中使用时，分析的准确性大大提高，这是因为由发光体的去稳定化所产生的光减少。生化过程的分析不限于体外或现场环境，而是可以扩展到体内研究.受保护的发光体在体内发光分析中的应用对本领域技术人员而言是显然的.试剂盒本发明的一个重要方面包括包含本发明的受保护发光体的试刑盒.试刑盒可以用于基本上任何其中使用发光体的分析，包括在这里详细描述的优选方法。在优选的实施方案中，用于特定分析的基本试刑由试刑盒提供。这些试刑可以包括硖脲或硫脲衍生物、一种或多种緩冲水溶液和酶.试剂还可以包括DMSO和/或醇以帮助溶解受保护发光体.各试刑可以具有其自身的容器，或几种试刑可以预先混合并一起包装在容器中.在特定的实施方案中，试刑盒包含编码荧光素酶的基因。在另一个实施方案中，提供荧光素酶蛋白质本身。化合物本发明还提供式xn、xni和xiv的新型化合物.对于化合物xn，R'是-CH广C^0C(-0)CH3和R'是-C晶0C(-0)CH,，R'。是H,W是-CH2-C6H5，则R"不是-C(-0)CH3.优选，本发明提供式XII、XIII和XIV的新型化合物，其进一步具有在22t:下含有F12培养基和10、胎牛血清的混合物中的半衰期为至少45分钟，优选，式xn、xin和xiv的受保护发光体比其母体化合物更稳定，这通过化合物在含水环境中的半袭期来测定.具体而言，本发明提供式xv、xvi、xvn、xviii、xix和n的新型化合物。实施例所有溶剂和试剂从FISHERSCIENTIFIC获得，但下述情况除外.Mathew緩冲剂按照以下方式形成，从SIGMACHEMICALS获得pH为7.4的lOOmM辨酸钾緩冲液；500mM氯化钠；ImM的乙二胺四乙酸(EDTA);和O.lXw:v明胶型A(75-100Bloom),Ham的F12培养基和胎牛血清是从LIFETECHNOLOGIES获得，兔酯酶是从SIGMACHEMICALS获得，Renilla荧光素酶是从C服MICONCORP.获得,实施例1在此实施例中，具有三个乙酰基保护基团的受保护发光体是从具有结构VI的水母水通道蛋白辅因子合成.向化合物VI(STOPANDGLOSUBSTRATE,P醒EGACORPORATION)(500mg;1,2mM)在无水他咬(20ml)中的溶液中加入乙酸酐(1.lml;UmM)，使反应保持在惰性气氛和室温下.l小时之后，向反应中加入30ml二氯甲烷，然后加入80ml水.该混合物搅拌5分钟，然后分离各层.有机层蒸发至干，然后如下用柱色详法提纯.常规相硅胶(20g)溶解在二氣甲烷中，然后装入适宜尺寸的玻璃柱中。提取的反应混合物溶解在最小量的二氣甲烷中，并加入柱顶部。采用逐步梯度，开始是在二氯甲烷中的1%乙酸乙酯(EtOAc)，增加极性直至所需的化合物洗脱出来(二氯甲烷中的10XEtOAc).收集所有HPLC提纯的级分(>95X),蒸发至干，获得410mg的纯化合物IX.实施例2在此实施例中，具有三个丁酰基保护基团的受保护发光体是从具有结构VI的水母水通道蛋白辅因子合成.向化合物VI(300mg;0.7mM)在无水吡啶(30ml)中的溶液中加入丁酸肝(1.Ug;7mM)，使反应保持在惰性气氛和室温下.l小时之后，将反应混合物置于真空中以便除去溶剂，直至形成浆液.向浆液中加入30ml二氯甲烷，然后加入80ml水.该混合物搅拌5分钟，然后分离各层.有机层蒸发至干，然后如下用柱色谱法提纯.常规相硅胶(20g)溶解在二氣甲烷中的2XEtOAc中，然后装入适宜尺寸的玻璃柱中。提取的反应混合物溶解在最小量的二氯甲烷中，并加入柱顶部，流动相是恒溶刑成分的，所有所需的化合物用在二氯甲烷中的EtOAc洗脱出来.收集所有HPLC提纯的级分(〉95X)，蒸发至干，获得225mg的纯化合物XV.实施例3在此实施例中，合成具有结构VII的水母水通道蛋白辅因子.合成过程是Inoue等报道的改进方法(Inoue和Kakoi，Heterocycles48(8)，1669(1998))向2-氨基-3-苄基-5(4-羟基苯基)吡嗪(2g，7.2mM)在二甲苯(80ml)中的溶液中一次加入所有的苯基丙粥酸(8.3g;50.5mM)，将反应混合物加热回流(130-140TC)l小时，然后冷却到室温.将混合物减压蒸发成黑色固体泡沫体.将泡沫体在300g的N.P.硅胶用二氯甲烷中的甲醇逐步梯度进行色谱分离.所需的产物用二氯甲烷中的5X甲醇洗脱，获得2g化合物Vn，通过HPLC提纯到80X纯度，重复进行色语分离，获得900mg的化合物VI1("水母水通道蛋白辅因子-h"，HPLC提纯〉95X)，是棕色固体.实施例4在此实施例中，具有两个乙酜基保护基团的受保护发光体是从具有结构VII的水母水通道蛋白辅因子合成.向化合物VII(300mg;0.74mM)在无水吡咬(lSml)中的溶液中加入乙酸肝(lml;llmM)，使反应保持在惰性气氛和室温下。l小时之后，将反应混合物蒸发成粘性浆液，然后如下用柱色谦法提纯该粘性浆液.常規相硅胶(40g)溶解在EtOAc和庚烷的1:3混合物烷中，然后装入适宜尺寸的玻璃柱中，将浆液溶解在最小量的二氯甲烷中，并加入柱顶部。流动相是恒溶刑成分的，所有所需的化合物用1:3的EtOAc/庚垸洗脱.收集所有HPLC提纯的级分095X),蒸发至干，获得170mg的纯化合物XVI.实施例5在此实施例中，具有一个乙酰基保护基团(在纷基上)的受保护发光体是从实施例4的受保护发光体(XVI)合成.将化合物XVI在吡啶和二氦甲烷的l:1混合物中的1X溶液冷却到Or.向该溶液中，滴加入预先冷却的1X甲醇氨溶液。氨溶液的体积等于用于溶解XVI的吡啶/二氣甲烷混合物的体积。在反应几分钟后，用HPLC检测样品，确定脱保护的完成程度.通过HPLC测得形成新的峰，它比原料的极性更强(即在C18硅胶上更容易洗脱)，但比化合物VI的亲油性更强(即在C18硅胶上更晚洗脱出来)。一旦通过HPLC检测不到化合物XVI，将反应混合物蒸发至干，然后如下用柱色谦法提纯.常规相硅胶按照硅胶化合物=75:1的比例溶解在EtOAc和庚烷的1:2混合物中，流动相是呈步进梯度的，通过增加EtOAc的浓度来提高溶剂体系的极性，直至洗脱出所有所需的化合物.收集所有HPLC提纯的级分(>95^)，浓缩获得纯化合物XXI。化合物XXI具有结构I,其中Rl--CH2-C6H5;R2--CH-C6H5;R3--C6H4—0-C(-0)-CH3;和R4-H,化合物XXI因此具有脱保护的烯醇/羰基，其可以被保护以提供不对称的受保护发光体.例如，与乙酸溴甲醋的反应将获得受保护的发光体XVIII.实施例6在此实施例中，具有两个乙酰基保护基团(在盼基上)和一个乙跣氣基甲基保护基团的受保护发光体是从实施例1中合成的受保护发光体(IX)合成，向化合物IX在无水吡啶中的1X溶液中加入NaH(5.0当量)，使该溶液在惰性气氛和室温下搅拌。IO分钟之后，将乙酸溴甲酯(5.0当量)滴加入该混合物中，将该反应混合物于室温再搅拌30分钟.向反应中加入二氯甲烷，其体积是吡啶体积的两倍，然后加入水，其体积等于吡啶的体积。将该混合物再搅拌5分钟，然后分离各层.有机层蒸发至干.该物质可以使用常规相硅胶用EtOAc/庚烷作为流动相进行柱色谦法提纯，获得化合物xvn.实施例7在此实施例中，具有结构xix的受保护发光体是从具有结构ni的水母水通道蛋白辅因子使用Aungst等(PharmaceuticalResearch,12(5)，763(1995))的改进方法合成。向KI(0.122g;0.74mM)、碳酸钟(O.031g;0.44mM)和新戊酸氯甲酯(1.lg，7.3mM)在无水DMF(3ml)中的混合物中加入化合物VII(0.3g，0.73mM)，将该反应于室温在惰性气氛下搅拌过夜.通过HPLC分析，显示化合物VII完全被消耗，出现了与化合物XIX相关的极性较弱的峰.DMF在减压下蒸发.将固体溶解在二氯甲烷中，在50gN.P硅胶上进行色详提纯，获得255mg的化合物XIX(98V用HPLC提纯)。实施例8在此实施例中，具有结构VIII的水母水通道蛋白辅因子("二脱氣基水母水通道蛋白辅因子")是从2-氨基-3-苄基-5-苯基吡嗪和2-乙酰氧基-3-笨基丙烯醛合成.化合物2-氨基-3-苄基-5-苯基吡嗪是根据前面描述的方法制备(Kishi,Y等，Tet.Lett,2747(1972);Cormier,M等，Biochemistry,18(11)，2204(1979);Hirano,T等，Tetrahedron53(38)12903-12916(1997)).化合物2-乙酰氣基-3-苯基丙烯醛是如下合成'向苯基丙嗣酸("g，l"mM)在无水吡啶(250ml)中的溶液中加入乙酸酐(UOml).将溶液在情性气氛下搅拌过夜，通过薄层色谦(TLC)使用在二氯甲烷中的IOX甲醇进行监控.吡啶在减压下蒸发，所得的浆液溶解在二氯甲烷(700ml)中，并用200inl份的0.1N盐酸水溶液洗涤3次.有机相用疏酸钠干燥，并过滤，滤液在减压下浓缩，得到粘性琥珀色浆液，该浆液在N.P硅胶上用二氯甲烷进行色谱提纯，获得24g的2-乙酰氣基-3-苯基丙烯酸.将该乙酸烯醇酯中间体溶解在150mlTHF中，并冷却到O匸.然后在搅拌下滴加入草耽氯(51ml，580mM)，并将该溶液于OC再搅拌20分钟.滴加入二甲基甲酜胺(DMF)(7.5ml),然后将该溶液于OX:搅拌4小时，在减压下浓缩，用甲苯共蒸发两次，得到酰氯。将该酰氣中间体(14.5g，87mM)溶解在200迈1的二氯甲烷/THF的1:l混合物中，将该'溶液冷却到-70TC，滴加入LiAl(OtBu)3H(152ml,152mM)，同时保持反应温度低于-70iC.LiAl(OtBuhH的添加完成之后，于-70t:继续搅拌2小时.除去冷却浴，加入盐酸水溶液(2N，100ml)，将反应加热到室温.该混合物萃取入500ml瞇中，组合的有机相用硤酸钠干燥，并过滤.滤液进行减压浓缩，得到粘性油，用N.P,硅胶(250g)和在己烷中的乙酸乙酯梯度通过柱色谱提纯.所需的化合物在庚烷中的lOi乙酸乙酯中洗脱出来，得到13.5g的2-乙酰氣基-3-苯基丙烯醛，是琥珀色的油(80X产率，在'HNMR中的醛单峰位于9ppm,ms.-189),二脱氧基水母水通道蛋白辅因子是从2-氨基-3-节基-5-苯基吡唤和2-乙酰氧基-3-苯基丙烯醛根据Kishi等描述的方法制备(Tet.Lett.，1972),其中有以下改进，向2-氨基-3-爷基-5-苯基吡嗪(2g，8.lmM)在乙醇(125ml)中的溶液中一次加入2-乙酰氣基-3-苯基丙烯醛(3g，16.2mM)。通过向该溶液中通入氮气将该溶液脱氣30分钟。加入浓盐酸水溶液Mml),反应加热回流18小时。在冷却到室温之后，过滤收集浅灰色沉淀物，用40ml乙醇洗涤，真空干燥，获得1,28g的化合物VIII，即二脱氧基水母水通道蛋白辅因子(80X产率).化合物VIII因此具有脱保护的烯醇/羰基，其受到保护以提供受保护的发光体.例如，与乙酸溴甲酯的反应将获得受保护的发光体XX.体外分析实施例9-各种受保护发光体的稳定性水母水通道蛋白辅因子或受保护发光体的样品以约3mM的浓度溶解在甲醇中.这些储备溶液稀释到在FU培养基；PU培养基+10X胎牛血清；或F12培养基+0.OlVTween20中至lpM.在不同时间提取样品，用HPLC检测保留在样品中的化合物的量(水母水通道蛋白辅因子或受保护发光体)。在各溶液中的化合物的半衰期通过用吸收率的log值对时间作图获得的线性函数进行回归分析来确定.然后计算化合物浓度降低到初始浓度的50X所需的时间.表c<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>现场分析在这些实施例中，发光体和受保护发光体的性能在各种培养的细胞中现场检测.细胞暂时地或稳定地与编码Renilla荧光素酶的质粒子转染.在与水母水通道蛋白辅因子(VI或VII)接触的细胞或受保护的发光体(IX、XV或XVI)之间比较发光。通过检测随着时间的发光和比较其中不存在细胞情况下的发光.证明了和与未修饰的水母水通道蛋白辅因子接触的细胞相比，细胞与受保护发光体的接触导致通常较少的发光，具有较长的半衰期和较高的信号/背景之比。中国田鼠的卵巢(CH0)细胞保持在Ham的含有IOX胎牛血清(FBS)的F-12培养基中。HeLa和293细胞保持在含有IOS胎小牛血清(FCS)的DMEM培养基中.所有细胞系在5"02存在下于"1C生长.细胞暂时性地与15pg的pUC19或pRL-控制质粒(PROMEGACORPORATION,E6271)在7.5x1()5细胞/10cm板的浓度下用Tfx-20(PROMEGACORPORATION,E2391)或TransFast"转染剂(PROMEGACORPORATION,E2431)进行转染，第二天，收集转染物，分到白色DYNEX96孔型发光计板的48个孔中.CHO细胞也独立地用pHRL-控制和pPGKNeo(用于克隆选择的质粒表达Neomycin基因)使用TransFastTM试剂进行稳定性转染。在500pg/mlNeomycin(PROMEGACORP.)的克隆选择之后，使用在完全F12培养基中的水母水通道蛋白辅因子选择用于Renilla荧光素酶活性的稳定克隆.如此制备的细胞然后进行各种分析，用于这些分析的反应緩冲刑使用DMEM或F12培养基用FBS或FCS(10体积X)制备.然后加入水母水通道蛋白辅因子VI、水母水通道蛋白辅因子VII或受保护发光体IX、XV或XVI之一达到60pM的浓度。这些緩冲刑然后用于在下列分析中进行发光检测.用ORION发光计检测发光.实施例10-活细胞分析，随着信号/背景之比增加在转染之后的24或48小时之后，从细胞中吸出培养基.细胞用100p1/孔的IX磷酸盐緩冲的盐水洗涤.通过half-logs将含有VI或IX的反应緩冲刑滴入完全的培养基中，并将这些溶液加入空孔中和含有已转染的细胞的孔中，在替换培养基之后5分钟检测发光.立即在初始检测之后，加入TERGITOLNP-9(SIGMACHEMICALS)到最终浓度为1、样品混合约15秒，以1秒/孔将发光积分.在将TergitolNP-9加入含有氷母水通道蛋白辅因子VI或VII的样品中之后，从细胞样品检测的发光增加.在将TergitolNP-9加入含有水母水通道蛋白辅因子IX、XV或XVI或XIX的样品中之后，从细胞样品检测的发光几乎降低到自动发光的水平。对于仅含有培养基和血清的样品测得的发光作为自动发光.发光与自动发光之比作为信号/背景之比(S/B).被pHRLCMV，E6271转染的CH0细胞的结果列在表D中。表D化合物/参比化合物的比率化合物参比化合物自动发光发光S/NIXVI0.21.59.1XVVI0.20,73，9XVIVI0.41.13.4XVIVII0.91.41.7XIXVII0.20.3217实施例ll-自动发光的对比CHO细胞在用合成Renilla荧光素酶基因在CMV启动子(PR0MEGA，目录)控制下稳定地转染之后，在5%0)2的存在下在37TC下在含有10XFBS的F12培养基中生长.将细胞种在96孔板的3行(A-C行)中，并静置过夜生长.将水母水通道蛋白辅因子VI或乙跣氧基甲基二乙酰基水母水通道蛋白辅因子XVII在Fl2培养基+10XFBS中稀释到60pM.含有水母水通道蛋白辅因子XVII的F12用于代替A行中的培养基，并加入E行的空孔中(检测自动发光)，含有水母水通道蛋白辅因子的F12用于代替C行中的培养基，并加入G行的空孔中.B行用于确保在水母水通道蛋白辅因子或乙酰氣基甲基二乙酰基水母水通道蛋白辅因子不存在下不产生发光。在3小时内，每10分钟检测在该板上的孔中的发光，并绘制各化合物的发光(发光蛋白质依赖性发光)和自动发光(非发光蛋白质依赖性发光，从不含细胞的孔检测)随时间变化的曲线。发光随时间变化的情况在图1中显示。信号/背景之比表示在图2中.实施例12-半衰期短的基因报告分子该实施例显示了阻隔两部分蛋白质合成通路的作用.嘌呤審素和环己酰亚胺都能抑制蛋白质合成，但它们以不同的方式在通路中的不同点进行。在体外，酶的强度将降低超过IOO倍，在22"C下的半衰期为3-5分钟。CHO细胞在用合成人化Renilla荧光素酶基因在CMV启动子(Promega，目录)控制下稳定地转染，并在5XC02的存在下在37匸下在含有IOX胎牛血清的F12培养基中在96孔板中生长。将一系列l2-16个板仅仅种在A行，并静置以过夜生长.除去该培养基，并用含有600pM的POM水母水通道蛋白辅因子-h(XIX)的F12培养基+10XFBS代替.检测在一个板上的细胞的发光，将所有板放回培育器中.每1小时检测在一个板上的细胞的发光，进行1、2和3小时的后培养基替换.也在大约3.5小时的后培养基替代下检测发光.将嘌呤霉素和环己酰亚胺加入每个板上的一半孔中，将这些板放回培育器中，此时作为时刻0.在时刻0，检测在一个板上的细胞的发光.以5分钟的间隔，将这些板放回培育器中，取出新板，并检测发光。这种循环每5分钟重复进行，直至变化速度降低.此时，除去单板，并检测其发光.然后将该板立即放回培育器中.这种循环每15分钟重复进行。在所有这些板中检测的发光平均为"未处理的细胞"(不暴露于蛋白质抑制剂的那些)和"经过处理的细胞"(暴露于环己酰亚胺或噪呤霉素的那些).数据显示在图3中，其中显示每次归一化到未处理的细胞的平均发光(同时检测)的发光。对于未处理的细胞的绝对发光保持从时刻0保持不变，直至分析结束.实施例13-用于从水母水通道蛋白辅因子衍生物与水母水通道蛋白辅因子母体化合物的发光的定位的分析.A.P0M-h(XIX)与水母水通道蛋白辅因子-h(VII)将CH0hRL25细胞(它表达焚光素酶)(4.5ml的(7.5^105个细胞)/(板/5x1(T个细胞/ml)再悬浮在5.5ml的培养基中，并加入96孔板中，第二天，吸出细胞，用100p1的PBS洗涤，然后再次吸出.然后将不含基质(背景)的100p1的培养基(F12)加入不含细胞的孔中.然后用0RI0N发光计(BERT冊0LD)以1秒/孔读取这些孔的数据(表E;Bkg).类似地，将含有100mM的POM-h或水母水通道蛋白辅因子-h的100m1部分的培养基放入含有细胞的孔中或仅置于孔中.然后立即(水母水通道蛋白辅因子)和在IO分钟后添加(POM-h)之后用ORION发光计(BERTHH0LD)以1秒/孔读取这些孔的数据(表E;Subs)。然后，向每个孔中加入0.5m1的提纯的Renilla荧光素酶(3.96xl(TM/反应(Chemicon).然后以1秒/孔读取所有孔的数据(表B;RL).表E<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>使用表达荧光素酶的CHOhRL25细胞获得的上述数据证明了P0M-h在从外部向培养基中添加荧光素酶之前和之后都被转化成发光体(19584对35349)，表明该基质迅速在细胞内定位.相比之下，在相似的条件下，与后添加外源荧光素酶相比，在添加外源荧光素酶之前水母水通道蛋白辅因子-h具有较低的发光(39342对331381)，表明该基质可以在细胞内部以及外部使用，不需要含有醋酶的复合物，这些数据进一步证明在仅仅培养基(含极少的醋醉)中，P0M-h具有与含hRL25细胞的培养基相比更低的发光(3641对35349)，表明该水母水通道蛋白辅因子衍生物必须先在其被荧光素酶转化成发光体之前被酯酶转化。相比之下，水母水通道蛋白辅因子-h显示与仅仅用培养基和用含hRL25细胞的培养基相当的结果(278467对331381)，表明在与外源荧光素酶反应之前没有必要有细胞介导的转化，B.三乙酰基水母水通道蛋白辅因子(IX)与水母水通道蛋白辅因子(VI)将未转染的CH0(并不自然产生荧光素酶)和CHOhRL25细胞(它表达荧光素酶)(4.5ml的(7.5x105个细胞)/(板/5x10'个细胞/ml)再悬浮在5.5ml的培养基中，并加入96孔板中.第二天，吸出细胞，用100m1的PBS洗涂，然后再次吸出。然后将不含基质(背景)的100p1培养基(P12)加入不含细胞的孔中.然后用ORION发光计(BERTHHOLD)以1秒/孔读取这些孔的数据(表F;Bkg).类似地，将含有lOOyM的水母水通道蛋白辅因子或三乙酰基水母水通道蛋白辅因子的100nl部分的培养基放入含有细胞的孔中或仅置于孔中，然后立即(水母水通道蛋白辅因子)和在4分钟后添加之后用(三乙酰基水母水通道蛋白辅因子)0RI0N发光计(BERTHH0LD)以l秒/孔读取这些孔的数据(表F;Subs).然后，向每个孔中加入0.5m1的提纯的Renilla荧光素酶(3.96xl(TM/反应(Chemicon)。然后以1秒/孔读取所有孔的数据(表F;RL).表FBkgSubs(RLU)RL(RLU)hRL2+三乙酰基水母水通道蛋白辅因子(IX)23224353229111hRL2+水母水通道蛋白辅因子(VI)23139842110008374CH0+三乙酰基水母水通道蛋白辅因子(IX)238648910CH0+水母水通道蛋白辅因子(VI)236253119301474图1实施例11中各化合物的发光(发光蛋白质依赖性发光)和自动发光(非发光蛋白质依赖性发光)随时间变化的曲线。图2实施例11中各化合物的发光(发光蛋白质依赖性发光)的信号噪音比随时间变化的曲线。图3实施例12中归一化的细胞的的发光(相对于未处理的)随时间变化的曲线。权利要求1、式(XII)的化合物其中，R7是H、烷基、杂烷基、芳基或-CH2-C6H4OR14；R8是H、烷基、杂烷基或芳基；R9是H、烷基、杂烷基、芳基或-C6H4OR15；R10是-H、-CH3、或-CH(CH3)2；和R11、R14和R15独立地是酶可除去的基团；前提是R11、R14和R15不都是乙酰基。2、权利要求1的化合物，其中R7是一CH广C6Hs、萘基、-CH2—"H4OH、-CH2—C6H4Fi^-CH2-CJ4OR";R'是-CH2-C6H5、-CH2-C6H、-(^广(:5119或-(CH2)3NHC(-NH)NH2;和R'是苯基、吲咮基、-C6H4OH、—C6H4NH2、-C6H4F或-(^IU)R'5.3、权利要求l的化合物，其中R'1、R"和R'5是醋。4、权利要求1的化合物，其中R"是乙酰基；和R"和R"独立地是丁酰基、乙酰氧基甲基、丙耽氣基甲基、丁酰氣基甲基或新戊酰氣基甲基.5、权利要求1的化合物，其中R"是丁酜基、乙耽氧基甲基、丙酰氣基甲基、丁酰氣基甲基或新戊酰氣基甲基；和R"和R"独立地是乙酰基、丁酰基、乙酰氣基甲基、丙酰氣基甲基、丁酰氧基甲基或新戊酰氧基甲基.6、式(XII)的化合物，其中IT是H、烷基、杂烷基、芳基或-CH2-C晶0R";R'是H、烷基、杂烷基或芳基；R9是H、烷基、杂烷基、芳基或-C晶0R";IT是-H、-CH,、或-CH(CH3)2;和R"、R"和R"独立地是酶可除去的基团，和其中在22"C下含有F12培养基和IOX胎牛血清的混合物中，该化合物的浓度在45分钟后降低小于50%,7、权利要求6的化合物，其中R7是一CH广C6H5、萘基、-CH2-C6H4OH、-CH2-C6H4Fi^-CH2-C6H40R14;R'是-CH广C^、-CH2-C6H,,、-CH广C5H,或-(CH2)3NHC(-NH)NH2;和R'是苯基、吲哚基、-C晶OH、-C6H4NH2、-C6H4F或-C晶OR15,8、权利要求6的化合物，其中R11、R"和R"是酯.9、权利要求6的化合物，其中R11、R"和R"独立地是乙酰基、丁酰基、乙酰氣基甲基、丙酰氣基甲基、丁酰氣基甲基或新戊酰氣基甲基.10、式(XII)的化合物，其中R'是H、烷基、杂烷基、芳基或-CH2-C晶0R";Ri是H、烷基、杂烷基或芳基；R'是H、烷基、杂烷基、芳基或-C晶0R";1T是-H、-CH3、或-CH(CH])2;和R"、R"和R"独立地是酶可除去的基团，和其中除去至少一个酶可除去的基团提供了母体化合物；和其中使得在221C下含有Pl2培养基和IOX胎牛血清的混合物中该化合物的浓度降低50X所需的时间大于使得在22TC下含有Fl2培养基和10%胎牛血清的混合物中母体化合物的浓度降低5OX所需的时间.11、权利要求10的化合物，其中除去至少两个醉可除去的基团，提供母体化合物.12、权利要求10的化合物，其中除去所有酶可除去的基团，提供母体化合物。13、权利要求10的化合物，其中R7是-CH广"H5、萘基、—CH广C6H4OH、一CH广CJ^F或-CH广C6H40R";Re是-CH广CJl5、一CH广C6Hh、-CH广C5H,或-(CH2)3NHC(=NH)NH2;和R'是苯基、吲哚基、-C晶OH、-C6H4NH2、-C晶F或-CaU)R"'14、权利要求10的化合物，其中R"、R"和R"是酯.15、权利要求10的化合物，其中R"、R"和R"独立地是乙酰基、丁醜基、乙酰氣基甲基、丙酰氣基甲基、丁酰氧基甲基或新戊酰氣基甲基.16、式(XIII)或(XIV)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>丁酰基甲基.其中，R'是H、烷基、杂烷基、芳基或-CH广C晶0lT;R'是H、烷基、杂烷基或芳基；R"和R"独立地是-H、-0H、烷基、杂烷基、芳基或-OR";n是0、1或2;和R11、R"和R"独立地是酶可除去的基团.17、权利要求16的化合物，其中R'是-CH广C6H5、萘基、-CH2-C6H4OH、-CH2-C6H4F或一012-(:6114011";和R'是-CH广C^、-CH2-C6Hh、-012-(:5119或-(CH2)3NHC(=NH)NH2.18、权利要求16的化合物，其中R11、R"和R"是酯.19.权利要求16的化合物，其中R"、R"和R"独立地是乙酰基、乙酰氣基甲基、丙酰氧基甲基、丁跣氣基甲基或新戊酰氣基20.权利要求16的化合物，其中n是l.21.一种组合物，含有在溶液中的权利要求1所述化合物，22.权利要求21的组合物，其中该溶液是水溶液。23.权利要求21的组合物，其中该溶液包含DMSO或醇.24.一种组合物，含有在溶液中的权利要求6所述化合物.25.权利要求24的组合物，其中该溶液是水溶液.26.权利要求24的组合物，其中该溶液包含DMSO或醇.27.一种组合物，含有在溶液中的权利要求IO所述化合物.28.权利要求27的组合物，其中该溶液是水溶液.29.权利要求27的组合物，其中该溶液包含DMSO或醇.30.一种组合物，含有在溶液中的权利要求16所述化合物.31、权利要求30的组合物，其中该溶液是水溶液.32、权利要求30的组合物，其中该溶液包含DMSO或醇.33、一种受保护的发光体，它是修饰的水母水通道蛋白辅因子，其中烯醇基团已经被转化成含有酶可除去的基团的酯或瞇；所述酶可除去基团的除去提供了母体水母水通道蛋白辅因子；和其中使得在22TC下含有Fl2培养基和IOX胎牛血清的混合物中修饰水母水通道蛋白辅因子的浓度降低50N所需的时间大于使得在221C下含有F12培养基和10%胎牛血清的混合物中母体水母水通道蛋白辅因子的浓度降低5OX所需的时间.34、一种试刑盒，包含受保护的发光体；和发光蛋白质。35、权利要求34的试剂盒，进一步含有与发光体独立的脱保护酶。36、权利要求34的试刑盒，其中受保护的发光体和发光蛋白质处于独立的容器中.37、权利要求34的试剂盒，其中受保护的发光体和发光蛋白质处于同一容器中。38、一种试剂盒，包含受保护的发光体；和脱保护酶；其中发光体和脱保护酶处于独立的容器中.39、一种检测发光蛋白质的酶活性的方法，包括使发光蛋白质、脱保护酶和受保护发光体在溶液中接触以形成组合物；和检测由该组合物产生的光.40、权利要求39的方法，其中发光蛋白质是Renilla荧光素酶.41、权利要求39的方法，其中受保护发光体是式(XII)的化合物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中R7是H、烷基、杂烷基、芳基或-CH「C晶0R";R'是H、烷基、杂烷基或芳基；R'是H、烷基、杂烷基、芳基或-C晶0R";R'。是-H、-CH3、或-CH(CH丄；和R11、R"和R"独立地是酶可除去的基团.42、权利要求41的方法，其中R7是-CH2-"H5、萘基、-CH2_C6H,OH、-CH2—或一CH2-C6^0R";R8A-CH2-C6H5、-CH2-C6H"、-CH2-C5H9或-(CH2)3NHC(-NH)NH2;和R'是苯基、吲哚基、-C晶OH、-C6H4NH2、-C晶F或-C晶OR15，43、权利要求41的方法，其中R11、R"和R"是酯，44、权利要求41的方法，其中R'1、R"和R"独立地是乙酰基、丁酰基、乙酰氧基甲基、丙酰氧基甲基、丁跣氧基甲基或新戊醜氧基甲基.45、权利要求39的方法，其中受保护发光体是式(XIII)或(nV)的化合物(xm);<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中，r是H、烷基、杂烷基、芳基或-CH广C晶0R";R'是H、烷基、杂烷基或芳基；R"和R"独立地是-H、-OH、烷基、杂烷基、芳基或-0R";n是0、1或2;和R"、R"和R"独立地是酶可除去的基团。46、权利要求45的方法，其中R7是-CH广C6H5、萘基、—CH2-C6^OH、-CH2-C6H4F或一CH广C6H40R";和R'是一CH广CJ1"—CH广C6Hh、-CH广CsH,或-(CH2)3NHC(-NH)NH247、权利要求45的方法，其中R11、R"和R"是醋。48、权利要求45的方法，其中R11、R"和R"独立地是乙酰基、丁酰基、乙酰氣基甲基、丙酰氣基甲基、丁酰氣基甲基或新戊跣氣基甲基，49、权利要求45的方法，其中n是l.50、权利要求39的方法，其中组合物包括细胞。51、权利要求39的方法，其中组合物包括含有脱保护酶的细胞.52、权利要求51的方法，其中检测从该组合物产生的光，指出脱保护酶在细胞中的位置。53、权利要求39的方法，其中组合物包括细胞裂解物.54、权利要求39的方法，其中脱保护酶是酯酶.55、权利要求39的方法，其中该溶液是水溶液.56、权利要求39的方法，其中该溶液包含DMSO.57、权利要求39的方法，其中受保护发光体是修饰的水母水通道蛋白辅因子；其中烯醇基团已经被转化成含有酶可除去基团的酴或酸.58、一种在包含荧光素酶的活细胞中产生发光的方法，包括使溶液中的细胞与受保护的发光体接触.59、权利要求58的方法，其中受保护发光体是修饰的水母水通道蛋白辅因子；其中烯醇基团已经被转化成含有酶可除去基团的酯或瞇，60、权利要求58的方法，其中受保护发光体是式(XII)的化合其中r是H、烷基、杂烷基、芳基或-CH2-CJU)R";R'是H、烷基、杂烷基或芳基；R'是H、烷基、杂烷基、芳基或-C晶0R";R"是-H、-CH]、或-CH(CH丄；和R"、R"和R"独立地是酶可除去的基团。61、权利要求58的方法，其中受保护发光体是式(XIII)或(XIV)的化合物:(X川);R"ON、》N(XIV);其中，烷基、杂烷基、芳基或-CH广CA0R";R'是H、烷基、杂烷基或芳基；R"和R"独立地是-H、-OH、烷基、杂烷基、芳基或-OR";n是0、1或2;和R"、R"和R"独立地是酶可除去的基团。62、一种检测非发光性酶的酶活性的方法，包括使非发光性酶与含有发光蛋白质和受保护发光体的液体混合物接触以形成组合物；和检测由该组合物产生的光.63、权利要求62的方法，其中受保护发光体是修饰的水母水通道蛋白辅因子；其中烯醇基团已经被转化成含有由非发光性酶可除去的基团的酯或酸，64、权利要求62的方法，其中受保护发光体是式(XII)的化合10其中R'是H、烷基、杂烷基、芳基或-CH广C^OR";R'是H、烷基、杂烷基或芳基；R'是H、烷基、杂烷基、芳基或-CJU)R";R'。是-H、-CH3、或-CH(CH丄；和R"、R"和R"独立地是酶可除去的基团，这些基团可通过非发光性酶除去.65、权利要求62的方法，其中受保护发光体是式(XIII)或(XIV)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>(XIV);其中，IT是H、烷基、杂烷基、芳基或-CH广C晶OR";R'是H、烷基、杂烷基或芳基；R"和R"独立地是-H、-OH、烷基、杂烷基、芳基或-0R";n是0、1或2;和R"、R"和R"独立地是酶可除去的基团，这些基团可通过非发光性酶除去.66、权利要求34的试刑盒，进一步包含DMSO或醇或其混合物.67、权利要求38的试剂盒，进一步在同一容器中包含DMS0或醉或其混合物作为受保护发光体.68、权利要求1的化合物，其中R11、R"和R"独立地选自含有l-20个碳原子的烷基和含有1-20个碳原子的杂烷基.69、权利要求1的化合物，其中R11、R"和R"独立地选自含有l-l5个碳原子的烷基和含有1-15个碳原子的杂烷基.70、权利要求1的化合物，其中R'1、R"和R"独立地是含有l-20个碳原子的杂烷基，和含有酯基和醚基中的至少一个.71、权利要求10的化合物，其中R"、R"和R"独立地选自含有1-20个碳原子的烷基和含有1-20个碳原子的杂烷基.72、权利要求10的化合物，其中R"、R"和R"独立地是含有1-20个碳原子的杂烷基，和含有酯基和醚基中的至少一个.73、权利要求16的化合物，其中R"、R"和R"独立地选自含有1-20个碳原子的烷基和含有1-20个碳原子的杂烷基.74、权利要求16的化合物，其中R'1、R"和R"独立地是含有1-20个碳原子的杂烷基，和含有酯基和酸基中的至少一个。75、权利要求41的方法，其中R11、R"和R"独立地选自含有1-20个破原子的烷基和含有1-20个碳原子的杂烷基.76、权利要求41的方法，其中R11、R"和R"独立地是含有1-20个碳原子的杂烷基，和含有酯基和瞇基中的至少一个。77、权利要求45的方法，其中R11、R"和R"独立地选自含有1-20个碳原子的烷基和含有1-20个碳原子的杂烷基.78、权利要求45的方法，其中R11、R"和R"独立地是含有l-20个碳原子的杂烷基，和含有酯基和醚基中的至少一个。全文摘要涉及发光化合物的组合物、方法和试剂盒。一种检测荧光素酶的酶活性的方法，包括使发光蛋白质例如荧光素酶与受保护发光体接触以形成组合物；和检测由该组合物产生的光。与相应的未修饰的水母水通道蛋白辅因子相比，受保护发光体提供了提高的稳定性和改进的信号/背景之比。文档编号G01N33/58GK101440089SQ20081016940公开日2009年5月27日申请日期2002年11月1日优先权日2001年11月2日发明者D·克劳伯特,E·哈金斯,K·伍德,M·斯库里亚申请人:普罗美加公司