专利名称：基于超声辅助金属增强荧光(samef)的生物分析的制作方法
技术领域：
本发明涉及金属增强检测系统以及用于增加所述检测系统的灵敏度和快速性的方法，更具体来说，涉及组合使用超声与金属增强的荧光或化学发光检测分析，以增加检测系统的速度和灵敏度。相关
背景技术：
使用生物分析法鉴定和定量蛋白质和其他生物分子，在生物医学和生物化学应用中是极为重要的H。荧光在大多数这样的应用中是主流技术，其中目标生物分子通过其荧光团标记的结合配偶体的荧光发射进行检测4’5。在平面表面上执行的基于荧光的生物分析一般灵敏度欠缺并需要昂贵的光学仪器6’7。此外，在这些分析中的生物识别事件固有地缓慢(几分钟至数小时)6’7。通过在这些分析中引入等离子体激元(plasmon)共振粒子(PSP)， 不使用尖端光学仪器即可改进基于荧光的分析的灵敏度8’9。灵敏度的提高可能是由荧光特征的增加和与PSP紧邻放置的荧光团的寿命降低所造成的，这种现象被称为金属增强荧光 (MEF)8a°。在基于MEF的生物分析中，将PSP(—般为银纳粒)沉积在平面表面上，并在PSP 上建立生物分析8。因为大多数生物分子的尺寸小于PSP (20-100nm)，因此荧光团位于其发射将由于它们与PSP的表面等离子体激元的相互作用而增加的距离内1(1。尽管基于荧光的生物分析的灵敏度通过MEF来解决，但生物分析的速度仍然是有待克服的巨大挑战。就此而言，一种将低功率微波加热与MEF相结合的被称为微波加速金属增强荧光(MAMEF)11的新技术，显示出将完成生物分析的时间减少到不到1分钟。在MAMEF 中，分析组分的低功率加热在主体(存在靶生物分子和荧光探针)与分析表面处的银纳粒 (存在捕获探针)之间产生温度梯度，其驱动靶生物分子和荧光探针朝向表面，并建立起生物分析“。微波加热步骤可以对每种分析组分分别进行，或者对于三组分DNA杂交分析 (3-piece DNA hybridization assay)来说在一步中进行12。然而，几个因素影响MAMEF技术的效率1)分析表面必须被改性以消除过度加热(特别是在使用小体积液体进行的分析中)"，2)具有多个锐角的大型分析平台13(例如高通量筛选孔)的加热需要较长加热时间， 这随后导致样品蒸发。在其中化学诱导的电子激发态的发光与金属化粒子或表面中的表面等离子体激元耦合的表面等离子体激元耦合化学发光(SPCC)中，系统的动力学取决于没有外部激发源即可出现的化学诱导电子激发态。但是，在化学发光系统中，检测受到化学发光反应或探针的量子效率以及反应物耗尽前的时间的限制。因此，增加反应物的运动对于增加化学发光反应的速度将是有利的。就此而言，对于适用于所有可商购分析平台而不牺牲样品的更通用的技术，仍存在需求。发明概述本发明提供了超声辅助金属增强荧光、发光和/或化学发光分析系统，所述系统使用低强度超声波，通过增加系统内分子的动力学运动，显著减少了分析时间。一方面，本发明涉及一种分析检测方法，所述方法包含提供导电金属材料；其中所述金属材料被成形为刚好连续的薄膜或粒子，包括纳米结构、岛状物或胶体；导入至少一种用于布置在导电金属材料附近的分子和/或荧光团，其中所述分子和/或荧光团能够发光，并通过接近到距金属材料约5nm到50nm范围内而增强；施加超声能量以引起包含分子的化学反应的动力学增加；以及测量从系统发出的光。上述方法可用于多种检测系统，包括但不限于免疫分析、杂交分析、共振能量转移分析、基于偏振/各向异性的分析、基于化学发光的分析、基于发光的分析和酶联免疫吸附分析。另一方面，本发明提供一种检测系统，所述系统包含位于容器内的导电金属材料，其中所述金属材料被造型成刚好连续的薄膜、粒子、 纳米结构、岛状物或胶体；至少一种用于布置在导电金属材料附近的生物分子，其中所述生物分子在被电磁源激发时能够发光，并通过与金属材料的预定接近度而增强；声能量源，其引起流体中至少靠近金属表面的生物分子的运动增加，从而增加包含生物分子的化学反应的动力学；以及测量从系统发出的光的测量装置。在本实施方案中，生物分子包含外来或固有的荧光发射组分，其当与UV到顶范围内的辐射接触时具有发射荧光的能力。优选，荧光发射组分是不干扰生物分子的化学反应的分子。另一方面，本发明涉及减少用于检测靶分子的金属增强荧光分析的检测时间的方法，所述方法包含向分析系统中使用的基材表面施加大量金属粒子；将捕获分子连接到金属粒子上，其中捕获分子对靶分子具有结合亲和性；导入怀疑包含靶分子的溶液；向分析系统施加声能，其时间足以增加分子向金属粒子的运动，从而与捕获分子
结合；导入对靶分子具有亲和性的荧光检测剂分子，其中荧光检测剂分子可以在施加声能之前、期间或之后加入；以激发荧光分子的频率施加电磁能；以及测量任何荧光信号。另一方面，本发明涉及金属增强的荧光传感的方法，所述方法包含向检测系统中使用的表面基材施加导电金属材料，其中所述表面包括玻璃、石英或聚合材料；
导入含有至少一种用于布置在导电金属表面附近的分子的溶液，其中所述分子能够发射荧光或能够与荧光发射分子结合；施加20至200kHz范围内的声能，以引起溶液中分子运动的增加，从而增加检测系统内发生的任何化学反应的动力学；使用电磁源激发分子，引起荧光发射；以及测量系统内的荧光发射。在所有实施方案中，金属材料可以包含银、金、铜、锌、镍、铁、钯、铝、钼或任何显示出等离子体激元发射的金属。金属材料可以采取金属岛、纳米结构、胶体、多孔基质、浸渗在玻璃或聚合物表面内的金属粒子和/或图案形状的金属表面的形式。图案形状包括含有金属的具有至少一个顶点的形状，其中所述形状包括但不限于三角形、正方形、长方形、梯形、多边形、椭圆形、长椭圆形或其组合。此外，通过放置具有带顶点区域的形状的金属结构、并将这些顶点区域定位成彼此邻近和在其间产生反应性区， 可以增强发射和反应性。制备其间的反应性区是用于放置与靶分子互补的固定化捕获分子。金属结构在制造成包含用于形成反应性区的顶点区域的几何形状时，可以放置在具有多个孔的分析系统上，其中反应性区包括所述孔，而且暴露于低强度超声增加了检测分析的反应性并缩短了其完成时间。表面基材可以由聚合材料、玻璃、纸、硝酸纤维素、其组合或为金属结构的放置提供足够稳定性的任何材料制成。另一方面，本发明提供了用于在样品中检测靶病原体的方法，所述方法包括提供系统，所述系统包含位于表面基材上的固定化金属材料，其中固定化金属材料上附有与靶病原体的已知DNA序列互补的固定化捕获DNA序列探针；以及与靶病原体的已知DNA序列互补的游离捕获DNA序列探针，其中游离捕获DNA序列探针上附有荧光团；将样品与固定化的捕获DNA序列探针相接触，其中靶病原体的DNA序列与固定化的捕获DNA序列探针结合；将靶病原体被结合的DNA序列与游离的捕获DNA序列探针相接触，其中游离的捕获DNA序列探针与靶病原体的DNA序列的结合导致荧光团定位到距固定化金属材料足以增强荧光发射的距离；向系统施加超声能量，其量足以增加靶病原体的任何DNA分子向固定化探针的移动，以增强游离的捕获DNA序列探针与靶病原体的DNA序列的结合，从而引起反应速度的增加；以及使用UV到顶范围的电磁能量辐照系统，以增加定位在距金属材料预定距离处的荧光团的荧光发射，其中辐照可以在施加超声能量之前、期间或之后进行。能够发射荧光和/或在被电磁能量激发后发光的生物分子包括但不限于荧光团、 发色团或发光团。能够发射荧光的化合物可以是固有荧光团或附有外来荧光团的化合物。另一方面，本发明涉及包含金属表面的生物分析系统，所述金属表面用于增强位于金属表面附近的基于化学发光的反应的效应，其中金属表面等离子体激元由化学发光物质的化学诱导的电子激发态和从其发出的辐射进行激发，提供增强的信号。表面等离子体激元耦合的化学发光信号可以包括非偏振、P"偏振和/或S-偏振的信号。另一方面，本发明涉及使用高通量筛选(HTQ的分析方法，所述方法包含提供在HTS系统中使用的包含大量孔的多孔板；将金属纳米结构导入孔中，导入至少一种用于布置在金属纳米结构附近的生物分子，其中所述生物分子能够通过电磁能量或化学反应激发而发光，并通过与金属纳米结构预定的接近度而增强；施加一定范围的声能以引起孔内运动的增加，从而增加包含生物分子的化学反应的动力学和/或加快检测时间的速度；以及测量从系统发出的光。另一方面，本发明涉及用于检测样品中的靶分子的试剂盒，所述试剂盒包含容器，其包含沉积在由聚合或石英材料制成的基材上的一层固定化的金属粒子， 其中固定化探针与金属粒子相连，并且其中固定化探针对靶分子具有亲和性；对靶分子具有亲和性的荧光团，其中靶分子与固定化探针和荧光团二者的结合导致荧光团定位于距固定化金属粒子足以增强荧光发射的距离；以及用于增加系统中的运动的超声能量源和用于激发荧光团的能量源。另一方面，本发明涉及金属增强的化学发光传感的方法，所述方法包含向检测系统中使用的表面施加金属材料；导入包含至少一种用于布置在金属表面附近的生物分子的溶液，其中生物分子包含化学发光标记物；触发化学发光标记物以诱导化学电子激发态，由此产生金属表面等离子体激元， 并在触发化学发光标记物之前或期间向检测系统施加声能；以及测量化学发光信号。另一方面，本发明提供了用于在样品中检测靶病原体的方法，所述方法包含提供系统，所述系统包含金属表面，其中所述金属表面连接有与靶病原体的已知核酸序列互补的固定化的捕获核酸序列探针；以及与靶病原体的已知核酸序列互补的游离的捕获核酸序列探针，其中游离的捕获核酸序列探针上附有化学发光标记物；将样品与固定化的捕获核酸序列探针相接触，其中靶病原体的核酸序列与固定化的捕获核酸序列探针结合；向系统施加声能，其量能够增加系统内核酸的运动；将靶病原体被结合的核酸序列与游离的捕获核酸序列探针相接触以与其结合；导入与化学发光标记物化学反应的触发组分；测量化学发光信号强度，其中相对于不包含金属表面的系统来说信号增强。另一方面，本发明涉及用于测量荧光或化学发光信号的系统，所述系统包含位于表面基材上的大量金属化粒子；与金属化粒子相连或靠近金属化粒子的连接剂分子，用于结合或捕获测试样品中的目标分子；对目标分子具有亲和性的检测剂分子，其中检测剂分子包含荧光或化学发光标记物；与化学发光标记物进行化学反应以产生化学诱导的电子激发态的触发组分，或激发荧光标记物的电磁源；声能量源；以及用于测量表面等离子体激元耦合发射的测量装置。从后面的公开内容和所附的权利要求书，本发明的其他方面和优点将得到更充分的显现。附图简述
图1 (A)银岛膜(SIF)的吸收光谱随超声时间的变化，同一样品被超声总共30分钟(将500微升去离子水放置在样品顶部)，(B)在1分钟的超声之前(A)和之后(B)SIF 的原子力显微镜照片。反射镜板放置在距玻璃表面2cm处。图2 (A)涂在SIF上的FITC-HSA的荧光发射光谱随超声时间的变化，⑶在20分钟的超声之前和之后涂有FITC-HSA的SIF的真彩色(real-color)照片(这些样品使用空气流干燥)。在所有这些实验中，将500微升去离子水放置在样品顶部(白色虚线圆圈)。 反射镜板放置在距玻璃表面2cm处。图3 (A)在室温下(RT)或使用超声进行的模型蛋白分析的实验流程图，⑶金属增强荧光现象的草图，以及从SIF和玻璃发出的荧光的真彩色照片，在视觉上证实了 MEF的效用，(C)在RT和使用超声下在SIF和玻璃上进行的模型蛋白分析中使用的FITC-亲和素的荧光发射光谱，插图——在使用超声进行模型蛋白分析后SIF的真彩色照片，SIF显得没有被1分钟的超声所破坏，⑶对照实验，其中对应于⑶中显示的在SIF(I)和玻璃(3)进行的模型分析来说，从表面上省略了生物素化的BSA(B-BSA)。图4㈧使用超声(1分钟)在SIF(上图)和玻璃(下图)上进行的模型蛋白分析中使用的FITC-亲和素的荧光发射光谱，(B)室温下在SIF(上图)和玻璃(下图)上进行的同样的模型蛋白分析。图5室温下并使用超声(1分钟)在SIF和玻璃上进行的模型蛋白分析中，荧光发射强度(在520nm处)随所使用的FITC-亲和素的浓度的变化。图6 (A)用于在超声(总超声时间1分钟)之前、期间和之后对SIF和玻璃进行实时温度成像的实验流程，(B) 1分钟的超声之前和之后SIF和玻璃的热图像。玻璃载片的位置用实线(白色和黑色)标出。水的平均温度值从玻璃载片中间的白色虚线圆圈所显示的区域测量，(C)超声(1分钟)之前、期间和之后SIF和玻璃上的水的实时温度。超声分别以t = 5和65秒打开和关闭。图7在SIF上进行的荧光共振能量转移研究。供体(FITC)和受体(罗丹明B)分子与不同的亲和素分子结合，其随后与SIF表面上的生物素化BSA结合。供体与受体分子的摩尔比例为(A) 5 1，(B)I 5。图8显示了生物分子向结合基材的移动和混合。发明详述本发明涉及用于增加和检测荧光、非荧光化合物的荧光以及从化学发光反应发出的光的系统和方法，所述系统和方法通过使用低强度超声增加系统的动力学，从而增加化学或结合反应以增加检测系统的速度。
自从在1895年首次观察到超声引起的空化效应以来14，已发现超声在化学和物理过程中、尤其是在加速化学反应中的许多应用(即声化学)15。空化效应是指小气泡在液体中的快速形成和内爆，典型地在超声波频率低于IMHz时观察到16。气泡的内爆(对称空化)在液体中产生热点，且气泡内的温度能够达到超过5000K，内爆随后被周围的水分子以 IOltlK/秒的速率淬灭17。当气泡在比气泡大几个数量级的固体表面附近溃灭时，对称空化受到阻碍并发生了不对称的气泡溃灭I8。这随后导致形成了与表面垂直的液体微射流，其速度据估计达到lOOm/s18。液体微射流的形成和溃灭除了它们公知的清洁效应之外，还导致主体中液体的搅动。本发明涉及基于低强度超声和MEF的组合的新技术，被称为SAMEF。使用低强度超声导致生物分析时间(1分钟)与室温下进行的不使用超声的分析(30分钟)相比显著减少。此外，MEF部分通过增强荧光特征提供了生物分析灵敏度的增加。本文中使用的“荧光团或荧光分子”是指当物质被某种波长(激发波长)的辐射辐照时发出不同波长(发射波长)的电磁能量例如光的任何物质，并打算涵盖能够与样品中目标分析物特异性相互作用或反应、以提供一种或多种光学信号的化学或生物化学分子或其片段。此外，荧光团包括外来和固有荧光团两者。外来荧光团是指与另一种物质结合的荧光团。固有荧光团是指自身是荧光团的物质。示例性荧光团包括但不限于在本文引为参考的《分子探针目录》(Molecular Probes Catalogue)中列出的那些。代表性的荧光团包括但不限于Alexa Fluor 350、丹磺酰氯(DNS-C1)、5_(碘乙酰氨基)荧光素(5-IAF)；荧光素5-异硫氰酸酯(FITC)、四甲基罗丹明5_(和6_)异硫氰酸酯(TRITC)、6_丙烯酰-2-二甲基氨基萘(acrylodan)、7-硝基苯并-2-噁_1，3，-二唑-4-基氯化物(NBD-Cl)、溴化乙锭、萤黄、5-羧基罗丹明6G盐酸盐、丝丽胺罗丹明B磺酰氯、德克萨斯红""磺酰氯、B0DIPY 、萘胺磺酸包括但不限于1-苯胺萘-8-磺酸(ANS)和 6_(对甲苯胺基)萘-2-磺酸(TNS)、蒽基脂肪酸、DPH、十八碳四烯酸、TMA-DPH、芴基脂肪酸、荧光素-磷脂酰乙醇胺、德克萨斯红-磷脂酰乙醇胺、芘基-磷脂酰胆碱、芴基-磷脂酰胆碱、部花青MO、1- (3-磺酸根合丙基)-4- [- β - [2 [(二 -正丁基氨基)-0萘基]乙烯基] 吡啶鐺甜菜碱(Naphtyl Styryl) ,3,3' - 二丙基硫杂二羰花青(diS_C3-(5))、4_(对-二戊基氨基苯乙烯基)-1-甲基吡啶鐺(di-5-ASP)、Cy-31odo乙酰胺、Cy-5_N-羟基琥珀酰亚胺、Cy-7-异硫氰酸酯、罗丹明800、IR-125、噻唑橙、天青B、尼罗蓝、铝酞菁、Oxaxine 1、 4'，6-二咪基-2-苯基吲哚(DAPI) ,Hoechst 33342、T0T0、吖啶橙、乙锭同二聚体、N(乙氧羰基甲基)-6-甲氧基喹啉鐺(MQAE)、Fura-2、钙绿、羧基SNARF-6、BAPTA、香豆素、植物荧光素(phytofluor)、晕苯和金属配体络合物。代表性的固有荧光团包括但不限于具有芳环结构的有机化合物，包括但不限于 NADH、FAD、酪氨酸、色氨酸、嘌呤、嘧啶、脂类、脂肪酸、核酸、核苷酸、核苷、氨基酸、蛋白质、 肽类、DNA、RNA、糖类和维生素。其他适合的荧光团包括酶-辅因子、镧系元素、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白或其突变体和衍生物。还包括新的季氮杂环含硼酸化合物，包括
权利要求
1.一种减少用于检测靶分子的金属增强荧光分析的检测时间的方法，所述方法包含 向分析系统中使用的基材表面施加大量金属粒子；将捕获分子与金属粒子连接，其中捕获分子对靶分子具有结合亲和性； 导入怀疑包含靶分子的溶液；向分析系统施加声能，施加声能的时间足以增加分子向金属粒子的运动，从而与捕获分子结合；导入对靶分子具有亲和性的荧光检测剂分子，其中荧光检测剂分子能够在施加声能之前、期间或之后加入；以激发荧光分子的频率施加电磁能；以及测量任何荧光信号。
2.权利要求1的方法，其中表面基材是玻璃、石英或聚合材料。
3.权利要求1的方法，其中施加声能30秒至90秒。
4.权利要求1的方法，其中投送的声能在20kHz至60kHz范围内。
5.权利要求1的方法，其中金属粒子是纳米结构、岛状物或胶体。
6.权利要求1的方法，其中金属粒子包含银、金、铜、锌、镍、铁、铝、钯或钼。
7.权利要求1的方法，其中金属粒子具有带有至少一个顶点的形状，其中所述形状包括但不限于三角形、正方形、长方形、梯形、多边形、椭圆形、长椭圆形或其组合。
8.权利要求1的方法，其中荧光分子定位于距金属粒子约IOnm至约30nm。
9.权利要求1的方法，其中荧光检测剂分子包含生物分子，并且其中所述生物分子对靶分子具有亲和性。
10.权利要求9的方法，其中捕获分子、靶分子和荧光检测剂分子包含DNA序列。
11.权利要求1的方法，其中辐照可以在施加声能之前、期间或之后进行。
12.用于检测样品中的靶病原体的方法，所述方法包含 提供系统，所述系统包含位于表面基材上的固定化金属材料，其中固定化金属材料上附着有与靶病原体的已知 DNA序列互补的固定化的捕获DNA序列探针；以及与靶病原体的已知DNA序列互补的游离的捕获DNA序列探针，其中游离的捕获DNA序列探针上附着有荧光团；将样品与固定化的捕获DNA序列探针相接触，其中靶病原体的DNA序列与固定化的捕获DNA序列探针结合；将靶病原体与固定化的捕获DNA序列探针结合的DNA序列与游离的捕获DNA序列探针相接触，其中游离的捕获DNA序列探针与靶病原体的DNA序列的结合导致荧光团定位到距固定化金属材料足以增强荧光发射的距离；向系统施加超声能量，施加超声能量的量足以增加靶病原体的任何DNA向固定化探针的移动，以增强游离的捕获DNA序列探针与靶病原体的DNA序列的结合，从而引起反应速度的增加；以及使用UV到顶范围内的电磁能量辐照系统，以增加定位在距金属材料预定距离处的荧光团的荧光发射。
13.权利要求12的方法，其中施加超声能量30秒至90秒。
14.权利要求12的方法，其中投送的超声能量在20kHz至60kHz范围内。
15.权利要求12的方法，其中金属材料是纳米结构、岛状物或胶体。
16.权利要求12的方法，其中金属材料包含银、金、铜、锌、镍、铁、铝、钯或钼。
17.权利要求12的方法，其中荧光团定位于距金属材料约IOnm至约30nm。
18.一种用于测量荧光信号的系统，所述系统包含 位于表面基材上的大量金属化粒子；与金属化粒子相连的连接剂分子，用于结合或捕获测试样品中的目标分子； 对测试样品中的目标分子具有亲和性的检测剂分子，其中检测剂分子包含荧光标记用于诱导荧光标记物进入电子激发态的电磁能量源； 声能量源；以及用于测量荧光发射的检测装置。
全文摘要
本发明提供了超声辅助金属增强荧光、发光和/或化学发光分析系统，所述系统使用低强度超声波，通过增加系统内分子的动力学运动，显著减少了分析时间。
文档编号G01N33/483GK102308211SQ200980144339
公开日2012年1月4日 申请日期2009年9月11日 优先权日2008年9月11日
发明者克里斯·D·戈德斯 申请人:马里兰大学,巴尔的摩县