专利名称：自发性免疫性疾病特异性抗体和相关的自发性免疫性疾病诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗体技术领域，特别涉及疾病特异性抗体技术领域，具体是指一种自发性免疫性疾病特异性抗体和相关的自发性免疫性疾病诊断试剂盒。
背景技术：
生物医药行业，尤其是体外诊断试剂产业，利润空间大，能源消耗小，技术水平高， 是中国国家改革与发展委员会确定的政策扶持性行业，已经列入国家改革与发展委员会 2010年之前中国重点发展行业指导名录。各省政府等地方政府对该类项目，均列入关键技 术、重大项目进行扶持，在人力、财力上享受特别的优惠待遇。自身免疫性疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起 的疾病，如系统性红斑狼疮(SLE)，类风湿性关节炎(RA)，进行性系统性硬化症以及慢性淋 巴性甲状腺炎、甲状腺功能亢进等，发病机理不清，诊断指标繁多、特异性不强，导致其诊断 和治疗困难，是现代社会主要的致残性疾病之一，严重影响人类健康。因此，自身免疫性疾 病的诊断和治疗评估一直是临床上的研究热点和难点。目前，国内外市场上检测自发性免疫性疾病绝大部分应用自发性免疫性疾病相关 抗原，因此其敏感性和特异性均较低。因此，当前普遍应用的临床检测方法的特异性仅为 45%，灵敏性仅为68%。不能够高特异地、高灵敏度地对自发性免疫性疾病进行诊断评估、 对自发性免疫性疾病进行监测治疗、对自发性免疫性疾病进行预后判断，从而无法为医生 准确制定高度针对性的治疗方案提供依据，进而容易延误患者治疗时间，加重患者病情，给 患者带来额外的痛苦。因此，需要提供一种新的自发性免疫性疾病特异性抗体和相关的自发性免疫性疾 病诊断试剂盒，其能高特异地、高灵敏度地对自发性免疫性疾病进行诊断评估、对自发性免 疫性疾病进行监测治疗、对自发性免疫性疾病进行预后判断，为自发性免疫性疾病患者带 来福音。
发明内容
本发明的目的是克服了上述现有技术中的缺点，提供一种自发性免疫性疾病特异 性抗体和相关的自发性免疫性疾病诊断试剂盒，该自发性免疫性疾病特异性抗体能高特异 地、高灵敏度地对自发性免疫性疾病进行诊断评估、对自发性免疫性疾病进行监测治疗、对 自发性免疫性疾病进行预后判断，相关的自发性免疫性疾病诊断试剂盒具有高敏感性、高 特异性和高准确性的特点，为自发性免疫性疾病患者带来福音，适于大规模推广应用。为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了 一种自发性免疫性疾病特异性 抗体，其特点是，所述自发性免疫性疾病特异性抗体是AM-C5b9特异性抗体，所述AM-C5b9 特异性抗体是用AM-C5b9作为抗原制备的单克隆抗体或多克隆抗体。AM-C5b9是人自发性 免疫性疾病特异性蛋白质(或抗原)。
较佳地，所述单克隆抗体是用AM_C5b9抗原免疫小鼠后得到的，所述多克隆抗体 是用AM-C5b9免疫大兔后得到的。在本发明的第二方面，提供了一种上述的自发性免疫性疾病特异性抗体在制备自发性免疫性疾病诊断试剂盒中的用途。在本发明的第三方面，提供了上述的自发性免疫性疾病特异性抗体在诊断、检测 和/或监测自发性免疫性疾病中的用途。在本发明的第四方面，提供了一种自发性免疫性疾病诊断试剂盒，其特点是，包括 装有上述的自发性免疫性疾病特异性抗体的第一试剂容器和装有标记的抗自发性免疫性 疾病特异性抗体的二抗的第二试剂容器。较佳地，所述第二试剂容器装有辣根过氧化物酶标记的抗自发性免疫性疾病特异 性抗体的二抗。更佳地，所述自发性免疫性疾病诊断试剂盒还包括装有使辣根过氧化物酶显色的 显色剂的第三试剂容器。较佳地，所述自发性免疫性疾病诊断试剂盒还包括包被有作为捕获抗体的 AM-C5b9特异性抗体的ELISA板。在本发明的第五方面，提供了上述的自发性免疫性疾病诊断试剂盒在诊断、检测 和/或监测自发性免疫性疾病中的用途。本发明的有益效果在于1、本发明开发了一个新的自发性免疫性疾病特异标记蛋白质(AM_C5b9)，本发明 的标记的自发性免疫性疾病特异性抗体可以与其结合，再通过检测标记可以，特异地、高灵 敏度地对自发性免疫性疾病进行诊断评估、对自发性免疫性疾病进行监测治疗、对自发性 免疫性疾病进行预后判断，为自发性免疫性疾病患者带来福音，适于大规模推广应用。2、本发明以自发性免疫性疾病特异性抗体(AM_C5b9特异性抗体)为基础，开发出 以人自发性免疫性疾病特异性抗原AM-C5b9为靶标的两种试剂盒——AM-5b9-E免疫分析 法(诊断血样试验)试剂盒和AM-5b9-IHC组织化学法(预测的组织学变化试验)试剂盒， 能够特异地、高灵敏度地对自发性免疫性疾病进行诊断评估、对自发性免疫性疾病进行监 测治疗、对自发性免疫性疾病进行预后判断，为自发性免疫性疾病患者带来福音，且使用方 便，快速灵敏准确，适于大规模推广应用。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，获得一种自发性免疫性疾病特异性抗体即 AM-C5b9特异性抗体，该AM-C5b9特异性抗体对人AM_C5b9具有优异的特异性结合作用，从 而AM-C5b9成为新的自发性免疫性疾病特异标记蛋白质。在此基础上完成了本发明。为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的 实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1自发性免疫性疾病特异性抗体即AM_C5b9特异性抗体的制备1. 1自发性免疫性疾病特异蛋白质AM_C5b9的分离
自发性免疫性疾病特异蛋白质AM_C5b9的分离方法可以参照文献(Kolb WP andMulIer-Eberhard HJ. The membrane attack mechanism of complement. Isolation and subunitcomposition of the C5b-9complex. J Exp Med. 1975 ；141 724-735)白勺力夕去/人入 自发性免疫性疾病病人血中分离。1. 2AM-C5b9特异性抗体的制备将上述分离的自发性免疫性疾病特异蛋白质AM_C5b9免疫小鼠获得AM_C5b9单克隆抗体；将上述分离的自发性免疫性疾病特异蛋白质AM-C5b9免疫大兔获得AM-C5b9多克 隆抗体。实施例2AM-5b9_IHC组织化学法(预测的组织学变化试验)试剂盒的制备和使用2. 1以实施例1获得的AM_C5b9单克隆抗体为一抗，将AM_C5b9单克隆抗体 为抗原免疫大兔获得多克隆二抗，并对多克隆二抗进行辣根过氧化物酶标记，形成一种 AM-5b9-IHC组织化学法(预测的组织学变化试验)试剂盒。ROC分析本试剂盒的敏感性和特异性60份病人血淋巴细胞样本，包括35个SLE 病人、25个RA病人。所有临床病人均经过活检证实，双盲随机取样。当被检测样品达到90% 的敏感度时，其特异性达到75% ；而当其敏感度达到95%时，其特异性达到86%左右。2. 2 以实施例1获得的AM-C5b9多克隆抗体为一抗，将AM-C5b9多克隆抗体为抗原免疫大兔获 得多克隆二抗，并对多克隆二抗进行辣根过氧化物酶标记，形成另一种AM-5b9-IHC组织化 学法(预测的组织学变化试验)试剂盒。ROC分析本试剂盒的敏感性和特异性60份病人血淋巴细胞样本，包括35个SLE 病人、25个RA病人。所有临床病人均经过活检证实，双盲随机取样。当被检测样品达到 85%的敏感度时，其特异性达到68% ；而当其敏感度达到90%时，其特异性达到80%左右。 实施例3AM-5b9-E免疫分析法(诊断血样试验)试剂盒的制备和使用3. 1以实施例1获得的AM_C5b9单克隆抗体为一抗，将AM_C5b9单克隆抗体为抗原 免疫大兔获得多克隆二抗，并对多克隆二抗进行辣根过氧化物酶标记，将AM-C5b9单克隆 抗体作为捕获抗体包埋在ELISA板上，形成一种AM-5b9-E免疫分析法(诊断血样试验)试 剂盒。ROC分析(需要指出分析采用的方法，因此，在实施例2中同样补充了“R0C分析”) 本试剂盒的敏感性和特异性60份病人血清样本，包括35个SLE病人、25个RA病人。所有 临床病人均经过活检证实，双盲随机取样。当被检测样品达到88. 2%的敏感度时，其特异性 达到68. 2% ；而当其敏感度达到86%时，其特异性达到80%左右。与常用检测特异抗原方法相比，采用本试剂盒在检测60病人血清中的自发性免 疫性疾病特异抗原(AM-C5b9)时敏感度较高，一般在85-95%之间。而在2.5-10纳克/ 毫升的总特异抗原灰色区，当敏感度达到88%时，采用本试剂盒检测的方法的特异性达到 70%。在测定60病人血清样本中病人血清中的自发性免疫性疾病特异抗原(AM-C5b9)与 AM-C5b9单克隆抗体达到> 10纳克/毫升时，其敏感度接近100%。3. 2以实施例1获得的AM_C5b9多克隆抗体为一抗，将AM_C5b9多克隆抗体为抗原 免疫大兔获得多克隆二抗，并对多克隆二抗进行辣根过氧化物酶标记，将AM-C5b9多克隆 抗体作为捕获抗体包埋在ELISA板上，形成另一种AM-5b9-E免疫分析法(诊断血样试验) 试齐U盒。
ROC分析本试剂盒的敏感性和特异性60份病人血清样本，包括35个SLE病人、25 个RA病人。所有临床病人均经过活检证实，双盲随机取样。当被检测样品达到75%的敏感 度时，其特异性达到58% ；而当其敏感度达到90%时，其特异性达到70%左右。AM-5b9-E免疫分析法(诊断血样试验)试剂盒和AM_5b9_IHC组织化学法(预测 的组织学变化试验)试剂盒，这两种试剂盒是基于同一生物靶标的不同免疫学检测技术。 新一代检测自发性免疫性疾病特异抗原的基本原理是捕获抗体(AM-C5b9特异性抗体) 能特异地识别病人血清样品或组织样品中的自发性免疫性疾病特异抗原AM-C5b9，当加入 被标记上的抗AM-C5b9特异性抗体的二抗时，只有血清样品中自发性免疫性疾病特异抗原 AM-C5b9才能被二抗检测到。而自发性免疫性疾病特异抗原AM-C5b9的高含量与自发性免 疫性疾病病人密切相关。这是新一代检测方法的核心成分。采用本发明显著提高了自发性免疫性疾病检测的特异性和灵敏度，特异性从45% 左右提高到70%左右，灵敏度从68%左右提高到92%左右。本发明的试剂盒具有高敏感 性，高特异性和高准确性，可作为病人普查检测用和疗效追踪诊断用。新开发的诊断产品采 用优先筛选的抗体，应用于免疫夹心法的抗体协调配对。由于这些抗体具有较高的亲和性 和特异性，能最大限度的减少与检测样品中的其它分子的交叉反应。自发性免疫性疾病特异抗原(AM_C5b9)是本发明人经过多年的研究开发发现的 一种高特异性、高灵敏度地诊断和评估多种自身免疫疾病的生物靶标。本发明以人自发 性免疫性疾病特异性抗原(AM-C5b9)为生物靶标，发了新一代自发性免疫性疾病特异抗原 (AM-C5b9)的检测自发性免疫性疾病检测试剂盒，包括AM-5b9-E免疫分析试剂盒(诊断血 样试验)和AM-5b9-IHC组织化学试剂盒(预测的组织学变化试验)，对自发性免疫性疾病 进行诊断评估；对自发性免疫性疾病进行监测治疗；对自发性免疫性疾病进行预后判断。在临床上，新型诊断技术可对自发性免疫性疾病做出预示、监测、治疗，这对医生 制定治疗方案非常重要。而且为医生提供了一个可随时观察病人对治疗反应的可靠工具。 另外，本发明的特有优势不但被检测自发性免疫性疾病研究市场普遍接受，也深受中国检 测自发性免疫性疾病临床研究和应用领域的普遍关注。由于对新的自发性免疫性疾病生物 标志的研究的认识，类似本发明的产品目前在市场尚未出现。相对于现有的临床诊断方法，采用本发明，特异性、敏感性和准确性有了巨大的提 高，能够准确地对中国每年800以上的患者进行准确的诊断和治疗评估。因此本项目具有 显著的社会价值、经济效益和技术先进性，符合国家和地方的产业扶持政策。综上，本发明的自发性免疫性疾病特异性抗体能高特异地、高灵敏度地对自发性 免疫性疾病进行诊断评估、对自发性免疫性疾病进行监测治疗、对自发性免疫性疾病进行 预后判断，相关的自发性免疫性疾病诊断试剂盒具有高敏感性、高特异性和高准确性的特 点，为自发性免疫性疾病患者带来福音，适于大规模推广应用。在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图
应被认为是说明性的 而非限制性的。
权利要求
一种自发性免疫性疾病特异性抗体，其特征在于，所述自发性免疫性疾病特异性抗体是AM-C5b9特异性抗体，所述AM-C5b9特异性抗体是用AM-C5b9作为抗原制备的单克隆抗体或多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的自发性免疫性疾病特异性抗体，其特征在于，所述单克隆抗 体是用AM-C5b9抗原免疫小鼠后得到的，所述多克隆抗体是用AM-C5b9免疫大兔后得到的。
3.根据权利要求1所述的自发性免疫性疾病特异性抗体在制备自发性免疫性疾病诊 断试剂盒中的用途。
4.根据权利要求1所述的自发性免疫性疾病特异性抗体在诊断、检测和/或监测自发 性免疫性疾病中的用途。
5.一种自发性免疫性疾病诊断试剂盒，其特征在于，包括装有根据权利要求1所述的 自发性免疫性疾病特异性抗体的第一试剂容器和装有标记的抗自发性免疫性疾病特异性 抗体的二抗的第二试剂容器。
6.根据权利要求5所述的自发性免疫性疾病诊断试剂盒，其特征在于，所述第二试剂 容器装有辣根过氧化物酶标记的抗自发性免疫性疾病特异性抗体的二抗。
7.根据权利要求6所述的自发性免疫性疾病诊断试剂盒，其特征在于，所述自发性免 疫性疾病诊断试剂盒还包括装有使辣根过氧化物酶显色的显色剂的第三试剂容器。
8.根据权利要求5所述的自发性免疫性疾病诊断试剂盒，其特征在于，所述自发性免 疫性疾病诊断试剂盒还包括包被有作为捕获抗体的AM-C5b9特异性抗体的ELISA板。
9.根据权利要求5-8任一所述的自发性免疫性疾病诊断试剂盒在诊断、检测和/或监 测自发性免疫性疾病中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种自发性免疫性疾病特异性抗体，其是AM-C5b9特异性抗体，AM-C5b9特异性抗体是用AM-C5b9作为抗原制备的单克隆抗体或多克隆抗体，较佳地，单克隆抗体是用AM-C5b9抗原免疫小鼠后得到的，多克隆抗体是用AM-C5b9免疫大兔后得到的，还提供了相关的自发性免疫性疾病诊断试剂盒和在诊断、检测和/或监测自发性免疫性疾病中的用途，本发明的自发性免疫性疾病特异性抗体能高特异地、高灵敏度地对自发性免疫性疾病进行诊断评估、对自发性免疫性疾病进行监测治疗、对自发性免疫性疾病进行预后判断，相关的自发性免疫性疾病诊断试剂盒具有高敏感性、高特异性和高准确性的特点，为自发性免疫性疾病患者带来福音，适于大规模推广应用。
文档编号G01N33/543GK101839910SQ20101016950
公开日2010年9月22日 申请日期2010年5月7日 优先权日2010年5月7日
发明者刘东旭 申请人:刘东旭