专利名称：半定量化检测黄曲霉毒素b1的多检测线免疫层析试纸条及其制备方法
技术领域：
本发明属生物检测领域，具体涉及一种半定量化检测黄曲霉毒素Bl的多检测线 免疫层析试纸条及其制备方法。
背景技术：
黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌产生的次生代谢产物，是一种能引起 人畜各种损害的天然有毒化合物。在已经发现的黄曲霉毒素中黄曲霉毒素BKaflatoxin Bi，简称AFB1)是毒性最强的黄曲霉毒素，其毒性、致癌性和污染频率均居生物毒素的首 位。黄曲霉毒素污染食品及饲料后，会直接或间接进入人类食品链，威胁人类的健康 和生命安全，其危害程度与黄曲霉毒素的摄入量成正比。黄曲霉毒素Bl广泛存在于大米、 玉米、花生、芝麻、大豆、菜籽等农产品和鱼肉等食品中，为此世界各国都规定了食品及饲料 中黄曲霉毒素Bl的最大允许含量并将其作为强制性标准，因此加强对食品及饲料中黄曲 霉毒素尤其是黄曲霉毒素Bl的检测、特别是速测，以便及时了解和掌握食品及饲料的卫生 信息，对保障我国食品消费安全具有重要意义。现有技术中常用的黄曲霉毒素Bl检测技术主要有薄层层析法、精密仪器分析法、 免疫学分析法。近年来发展的免疫学分析法克服了前两者的缺点，具有特异性强、灵敏度 高、样品前处理简单、成本低、对实验人员和环境的污染危害小、适于现场批量检测等优点。 其中基于纳米金的免疫层析快速检测技术具有简便、快速、灵敏、适于现场检测的优点，具 有极大的应用价值和应用前景。但是，传统的黄曲霉毒素Bl免疫层析检测试纸条仅有一条 检测线，只能对样品中的黄曲霉毒素Bl进行定性检测，且灵敏度较低。所以研究建立针对 黄曲霉毒素Bl的多检测线免疫层析快速检测试纸条，从而实现对样品中的黄曲霉毒素Bl 高、中、低三个浓度含量的半定量检测，对监控食品和农产品中的黄曲霉毒素Bl具有重要 的意义和很高的应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种半定量化检测黄曲霉毒素Bl的多检测线 免疫层析试纸条及其制备方法。该半定量化检测黄曲霉毒素的多检测线免疫层析试纸条用 于半定量化检测黄曲霉毒素Bl，具有检测快速，操作简单，灵敏度高的特点。为解决本发明提出的技术问题所采用的技术方案为半定量化检测黄曲霉毒素Bl的多检测线免疫层析试纸条(见图1)，包括纸板，纸 板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接， 所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线、检测线I、 检测线II和检测线III，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述检测线I、检测线II和 检测线III分别包被有黄曲霉毒素Bl-牛血清白蛋白偶联物(AFBl-BSA)；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的黄曲霉毒素Bl单克隆抗体。按上述方案，所述的吸水垫长16-18_，宽2-4mm ；检测垫长25_30mm，宽2_4mm ；金 标垫长6-9mm，宽2_4mm ；样品垫长12_18mm，宽2_4mm，相邻各垫的交叠长度为l_3mm。按上述方案，所述的吸水垫为吸水纸。按上述方案，所述检测垫上检测线I、检测线II和检测线III距硝酸纤维素膜上沿 的距离分别为11 17mm、13 19mm、15 21mm，且每相邻两条检测线的间距最小为2mm ； 所述质控线与检测线I的距离为5 11mm。按上述方案，所述检测垫上每厘米检测线I、检测线II和检测线III上所需黄曲 霉毒素Bl-牛血清白蛋白偶联物(AFBl-BSA)的包被量分别为120 600ng，40 200ng和 20 IOOng ；每厘米质控线上所需兔抗鼠多克隆抗体的包被量为200 500ng。按上述方案，所述金标垫中所用的纳米金的粒径为15 20nm。按上述方案，所述金标垫上每厘米喷涂长度所需纳米金标记的黄曲霉毒素Bl单 克隆抗体的用量为60 216ng。半定量化检测黄曲霉毒素Bl的高灵敏度免疫层析试纸条的制备方法，包括以下 步骤(1)吸水垫的制备将吸水纸剪裁即得吸水垫；(2)检测垫的制备检测线的包被将市售黄曲霉毒素Bl-牛血清白蛋白偶联物(AFBl-BSA)配制成0. 1 0. 5mg/mL 的包被液A ；于距硝酸纤维素膜上沿11 17mm、13 19mm、15 21mm的位置，用点喷方式 将包被液A依次横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线I、检测线II和检测线III，且每 条检测线之间的间距至少为2mm，每厘米检测线I、检测线II和检测线III所需的黄曲霉毒 素Bl-牛血清白蛋白偶联物(AFBl-BSA)的包被量分别为120 600ng，40 200ng和20 IOOng,再于37 40°C条件下干燥8 20分钟；质控线的包被将兔抗鼠多克隆抗体配制成0. 4 0. 6mg/mL的包被液B ；于距硝酸纤维素膜上检 测线I的距离为5 11mm，用点喷方式将包被液B横向包被于硝酸纤维素膜上，得到质控 线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为200 500ng，然后于37 40°C条 件下干燥8 20分钟；(3)样品垫的制备将玻璃纤维膜放入封闭液A中浸湿，取出，于37 40°C条件下干燥10 16小时， 得样品垫，然后置于干燥器中室温保存；(4)金标垫的制备用点喷方式将纳米金标记的黄曲霉毒素Bl单克隆抗体溶液横向喷涂于样品垫 上，每厘米喷涂长度所需纳米金标记的抗黄曲霉毒素Bl单克隆抗体的量为60 216ng，真 空冷冻干燥2 6h，即得金标垫，然后置于干燥器中室温保存；(5)半定量化检测黄曲霉毒素Bl的多检测线免疫层析试纸条的组装在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1 3mm，即得半定量化检测黄曲霉毒素Bl的多检测线免疫层析 试纸条(见图1和图2)。按上述方案，所述的包被液A为10 50mg市售黄曲霉毒素Bl-牛血清白蛋白偶 联物(AFBl-BSA)，1 2g牛血清白蛋白，1 2g蔗糖，0. 02 0. 05g叠氮化钠，0. 8g氯化 钠，0. 29g十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，0. 02g磷酸二氢钾，加水定容至IOOmL所得；所述的包被液B为50mg兔抗鼠多克隆抗体，0. 02 0. 05g叠氮化钠，0. 8g氯化钠， 0. 29g十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，0. 02g磷酸二氢钾，加水定容至IOOmL所得。按上述方案，所述的封闭液A为1 2g牛血清白蛋白，0. 1 0. 2mL曲拉通X-100， 0. 3g聚乙烯吡咯烷酮，2 5g蔗糖，0. 02 0. 05g叠氮化钠，0. 8g氯化钠，0. 29g十二水磷 酸氢二钠，0. 02g氯化钾，0. 02g磷酸二氢钾，加水定容至IOOmL所得。按上述方案，所述的纳米金标记的黄曲霉毒素Bl单克隆抗体溶液的制备方法为 量取50. OmL市售质量浓度为0. 01%纳米金溶液，调节纳米金溶液的pH值为5. 5 ；在搅拌 的状态下缓慢加入2mL的0. lmg/mL黄曲霉毒素Bl单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min ；加 入质量浓度为10%的牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为1%，继续搅拌 30min ；在4°C条件下放置2h后，1500r/min离心15min，吸出上清，弃沉淀；将吸出的上清液 12000r/min离心30min，弃上清液，加入50mL标记洗涤保存液，再12000r/min离心30min， 弃上清液，将得到的沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5. OmL浓缩物，置于4°C保存备用，其 中纳米金标记的黄曲霉毒素Bl单克隆抗体溶液的质量浓度为0. 04mg/mL ；所述的标记洗涤保存液为2. Og聚乙二醇-20000，0. 2g叠氮化钠，0. 1235克硼酸， 加水定容至IOOOmL, 0. 22 μ m滤膜过滤所得。如上所述的半定量化检测黄曲霉毒素Bl多检测线免疫层析试纸条的应用称取 已磨细的待测样品，加入体积浓度为60 80%的甲醇水溶液，待测样品和甲醇水溶液的质 量体积比为2g/mL，混勻，在50 60°C水浴下超声提取5 10分钟，静置5 10分钟，将 上层清液即提取液用水稀释2. 5倍，使稀释液中甲醇的终浓度为24 32%，再取100 μ L稀 释好的样品溶液做为检测液逐滴加入半定量化检测黄曲霉毒素Bl的多检测线免疫层析试 纸条的样品垫，其作为检测试纸条，同时取100 μ L水做为阴性对照液，逐滴加入另一半定 量化检测黄曲霉毒素Bl的多检测线免疫层析试纸条的样品垫，其作为对照试纸条，15分钟 后读取结果。结果评估(1)阳性待测样品检测试纸条的质控线显示出红色线条，而若三条检 测线中的检测线I颜色比对照试纸条稍浅，检测线II、检测线III颜色与对照试纸条基本 相同，则样品中的黄曲霉毒素Bl含量在0. 625 1. 25ng/g之间；若三条检测线中检测线I 不显色，检测线II、检测线III颜色与对照试纸条基本相同，则样品中的黄曲霉毒素Bl含量 为1. 25ng/g ；若三条检测线中检测线I不显色，检测线II颜色比对照试纸条浅，检测线III 颜色与对照试纸条基本相同，则样品中的黄曲霉毒素Bl含量在1. 25 2. 5ng/g之间；若试 纸条三条检测线的检测线I、检测线II不显色，检测线III颜色与对照试纸条基本相同，则 样品中的黄曲霉毒素Bl含量为2. 5ng/g ；若三条检测线中检测线I、II不显色，检测线III 颜色比对照试纸条稍浅，则样品中的黄曲霉毒素Bl含量在2.5 lOng/g之间；若三条检 测线均不显色，则样品中的黄曲霉毒素Bl含量不低于lOng/g。(2)阴性待测样品检测试 纸条的质控线显示出红色线条，三条检测线的颜色与对照试纸条的相应检测线的颜色均接近，为阴性结果，表明待测样品中的曲霉毒素Bl含量低于0.625ng/g。(3)无效无论待测 样品检测试纸条的检测线显示或不显示出红色线条，只要质控线不显示出红色线条，该试 纸条判为无效。该试纸条的工作原理为当样品溶液加入到试纸条下端的样品垫上后，样品溶液 通过毛细管作用沿试纸条向吸水垫方向移动，其移动至金标垫时，纳米金标记的黄曲霉毒 素Bl单克隆抗体被溶解。当样品中含有黄曲霉毒素Bl时，黄曲霉毒素Bl将和金标垫上的 纳米金标记的黄曲霉毒素Bl单克隆抗体结合并一同向上泳动，其到达固定着抗原的三条 检测线时，抗原将和黄曲霉毒素Bl竞争结合纳米金标记的黄曲霉毒素Bl单克隆抗体上有 限的抗原结合位点，样品中黄曲霉毒素Bl含量越高，检测线上的抗原能够结合的纳米金标 记的黄曲霉毒素Bl单克隆抗体将越少，形成的显色带越少、颜色越浅。当抗原所结合的纳 米金标记的黄曲霉毒素Bl单克隆抗体少于一定的数量时，检测线处将不会有红色线条出 现。无论样品中是否含有黄曲霉毒素Bi，未被检测线截获的纳米金标记的黄曲霉毒素Bl 单克隆抗体或纳米金标记的黄曲霉毒素Bl单克隆抗体与黄曲霉毒素Bl的结合物将继续移 动到质控线并与上面的第二抗体结合并被富集显色，所以不管样品中是否含有黄曲霉毒素 Bi，质控线都将显色。当样品中不含黄曲霉毒素Bl即为阴性时，试纸条出现四条红色条带， 即质控线和三条检测线均为红色；当样品中含有一定量黄曲霉毒素Bl即为阳性时，检测后 的试纸条上可能观察到以下6种情况(1)检测线I为浅红色，检测线II、检测线III均为 红色，质控线为红色；⑵检测线I不显色，检测线II、检测线III均为红色，质控线为红色； (3)检测线I不显色，检测线II为浅红色，检测线III为红色，质控线为红色；(4)检测线 I、检测线II均不显色，检测线III为红色，质控线为红色；(5)检测线I、检测线II均不显 色，检测线III为浅红色，质控线为红色；(6)检测线I、检测线II和检测线III均不显色， 质控线为红色；而质控线没有色带出现则表明该试纸条失效。本发明的有益效果(1)半定量化检测黄曲霉毒素Bi。本发明提供的半定量化检测黄曲霉毒素Bl的 多检测线免疫层析试纸条含有三条检测线，可对黄曲霉毒素Bl进行高、中、低三个浓度的 半定量化检测，实际应用价值大。(2)样品前处理方法简单。样品前处理 需要将磨细的待测样品加入甲醇超声提 取，静置，然后取上清液稀释后即可进行检测，整个样品前处理过程简单、快速。(3)操作简单。用该半定量化检测黄曲霉毒素Bl的多检测线免疫层析试纸进行检 测时只需将样品提取液逐滴加到试纸条的样品垫上即可，为一步式操作，不需要专业人员， 操作简单、方便。(4)检测过程不需要黄曲霉毒素Bl标准溶液做为阳性对照。本发明提供的试纸条 检测样品时不需要加黄曲霉毒素Bl标准溶液做为阳性对照，而只需用水做为阴性对照即 可，避免了黄曲霉毒素Bl的二次污染。(5)灵敏度高。本发明提供的半定量化多检测线免疫层析试纸条对样品中黄曲霉 毒素Bl的最低检测限为0. 625ng/g，其检测限值低于欧盟对食品中黄曲霉毒素Bl的最低限 量值要求。
图1为本发明提供的半定量化检测黄曲霉毒素Bl的多检测线免疫层析试纸条的 示意图。图中1纸板；2吸水垫；3检测垫；4金标垫；5样品垫；6质控线；7检测线I ；8检 测线II ；9检测线III。图2为本发明提供的半定量化检测黄曲霉毒素Bl的多检测线免疫层析试纸条的 侧视结构示意图。图中1纸板；2吸水垫；3检测垫；4金标垫；5样品垫。图3为实施例1的结果判定示意图。其中1对照试纸条；2检测试纸条；3质控 线；4检测线I ；5检测线II ；6检测线III。图4为实施例2的结果判定示意图。其中1对照试纸条；2检测试纸条；3质控 线；4检测线I ；5检测线II ；6检测线III。图5为实施例3的结果判定示意图。其中1对照试纸条；2检测试纸条；3质控 线；4检测线I ；5检测线II ；6检测线III。
具体实施例方式实施例1-3 半定量化检测黄曲霉毒素的高灵敏度免疫层析试纸的制备及应用下述实施例1-3中采用市售的黄曲霉毒素Bl单克隆抗体A9555，但并不局限于下述实 施例中使用的抗体。其他黄曲霉毒素Bl抗体同样适用，只是其检测灵敏度可能会存在差异。实施例1 半定量化检测黄曲霉毒素Bl的高灵敏度免疫层析试纸条的制备方法，包括以下 步骤(1)吸水垫的制备将吸水纸剪裁成长16mm宽3mm的规格，得吸水垫；(2)检测垫的制备检测线的包被将市售黄曲霉毒素Bl-牛血清白蛋白偶联物AFBl-BSA配制成0. lmg/mL的包被液 A，于距硝酸纤维素膜上沿13mm、15mm、17mm的位置，用点喷方式将包被液A依次横向包被于 硝酸纤维素膜上，得到检测线I、检测线II和检测线III，每厘米检测线I、检测线II和检 测线III上黄曲霉毒素Bl-牛血清白蛋白偶联物AFBl-BSA的包被量分别为120ng、40ng和 20ng,再于37°C条件下干燥8分钟；所述的包被液A为IOmg市售黄曲霉毒素Bl-牛血清白蛋白偶联物AFBl_BSA，2g 牛血清白蛋白，2g蔗糖，0. 02g叠氮化钠，0. 8g氯化钠，0. 29g十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化 钾，磷酸二氢钾0. 02g，加水定容至IOOmL所得。质控线的包被将兔抗鼠多克隆抗体配制成0. 4mg/mL的包被液B，于距检测线I的距离为5mm的 位置，用点喷方式将包被液B横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的 兔抗鼠多克隆抗体的包被量为200ng，然后于37°C条件下干燥8分钟；所述的包被液B为50mg兔抗鼠多克隆抗体，0. 02g叠氮化钠，0. 8g氯化钠，0. 29g 十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，磷酸二氢钾0. 02g，加水定容至IOOmL所得。所述的硝酸纤维素膜长25mm，宽3mm。
(3)样品垫的制备将玻璃纤维膜剪裁成长15mm宽3mm的规格，放入封闭液A中浸湿，于37°C条件下 干燥10小时，得样品垫，然后置于干燥器中室温保存；所述的封闭液A为2g牛血清白蛋白，0. ImL曲拉通X_100，0. 3g聚乙烯吡咯烷酮， 2. 5g蔗糖，0. 02g叠氮化钠，0. 8g氯化钠，0. 29g十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，磷酸二氢 钾0. 02g，加水定容至IOOmL所得。(4)金标垫的制备将样品垫剪裁成长8mm宽3mm的规格，用点喷方式将纳米金标记的黄曲霉毒素Bl 单克隆抗体溶液横向喷涂于该样品垫上，每厘米喷涂长度所需纳米金标记的黄曲霉毒素Bl 单克隆抗体的量为192ng，真空冷冻干燥6h即得金标垫，然后置于干燥器中室温保存；所述质量浓度为0. 04mg/mL的纳米金标记的黄曲霉毒素Bl单克隆抗体溶液的制 备方法为量取50. OmL市售质量浓度为0. 01%的纳米金溶液，用0. lmol/L碳酸钾水溶液 调节纳米金溶液的PH值为5. 5 ；在搅拌的状态下缓慢加入2mL的0. lmg/mL黄曲霉毒素Bl 单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min;加入10%牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终 浓度为1 %，继续搅拌30min ；在4°C条件下放置2h后，1500r/min离心15min，吸出上清， 弃沉淀；将吸出的上清液12000r/min离心30min，弃上清液，加入50mL标记洗涤保存液， 再12000r/min离心30min，弃上清液，将得到的沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5. OmL浓 缩物，置于4°C保存备用，其中纳米金标记的黄曲霉毒素Bl单克隆抗体溶液的质量浓度为 0. 04mg/mL ；所述纳米金溶液中纳米金的粒径为15nm ；所述的0. lmol/L碳酸钾溶液为13. 8g碳酸钾溶于纯水定容至IOOOmL, 0. 22 μ m 滤膜过滤所得；所述的0. lmg/mL黄曲霉毒素Bl单克隆抗体水溶液为Img市售黄曲霉毒 素Bl单克隆抗体加水定容至IOmL所得；所述的10%牛血清白蛋白水溶液为10g牛血清 白蛋白加水定容至100mL，0. 22 μ m滤膜过滤所得；所述的标记洗涤保存液为2. Og聚乙二 醇-20000，0. 2g叠氮化钠，0. 1235g硼酸，加水定容至IOOOmL, 0. 22 μ m滤膜过滤所得。(5)半定量化检测黄曲霉毒素Bl的多检测线免疫层析试纸条的组装在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连 接处交叠连接，交叠长度为1mm，即得黄曲霉毒素Bl的多检测线免疫层析试纸条(见图1和 图2)。上述制备得到的半定量化检测黄曲霉毒素Bl多检测线免疫层析快速检测试纸条 的应用，方法如下称取已磨细的1#至6#的待测样品，分别加入体积浓度为60 80%的 甲醇水溶液，待测样品和甲醇水溶液的质量体积比为2g/mL，混勻，在50°C水浴下超声提取 8分钟，静置10分钟，将提取液即上层清液用水稀释2. 5倍，使稀释液中甲醇的终浓度为 32%，再取100 μ L稀释好的样品溶液做为检测液逐滴加入半定量化检测黄曲霉毒素Bl的 多检测线免疫层析试纸条(作检测试纸条)的样品垫，同时取100 μ L水做为阴性对照液， 逐滴加入另一半定量化检测黄曲霉毒素Bl的多检测线免疫层析试纸条(作对照试纸条) 的样品垫，15分钟后读取结果。结果评估1#待测样品检测试纸条的质控线显示出红色线条，而试纸条三条检测 线中的检测线I颜色比对照试纸条稍浅，检测线II、检测线III颜色与对照试纸条基本相同，则为阳性结果，表明样品中的黄曲霉毒素Bl含量在0. 625 1. 25ng/g之间，见图3_1 ；2#待测样品检测试纸条的质控线显示出红色线条，而试纸条三条检测线中检测线 I不显色，检测线Π、ΙΙΙ颜色与对照试纸条基本相同，则为阳性结果，表明样品中的黄曲霉 毒素Bl含量为1. 25ng/g，见图3-2 ；3#待测样品检测试纸条的质控线显示出红色线条，而试纸条三条检测线中检测线 I不显色，检测线II颜色比对照试纸条浅，检测线III颜色与对照试纸条基本相同，则为阳 性结果，表明样品中的黄曲霉毒素Bl含量在1. 25 2. 5ng/g之间，见图3_3 ；4#待测样品检测试纸条的质控线显示出红色线条，而试纸条三条检测线的检测线 I、检测线II不显色，检测线III颜色与对照试纸条基本相同，则为阳性结果，表明样品中的 黄曲霉毒素Bl含量为2. 5ng/g，见图3-4 ；5#待测样品检测试纸条的质控线显示出红色线条，而试纸条三条检测线中检测线 I、II不显色，检测线III颜色比对照试纸条稍浅，则为阳性结果，表明样品中的黄曲霉毒素 Bl含量在2. 5 10ng/g之间，见图3-5 ；6#待测样品检测试纸条的质控线显示出红色线条，而试纸条三条检测线均不显 色，则为阳性结果，表明样品中的黄曲霉毒素Bl含量不低于lOng/g，见图3-6。实施例2 半定量化检测黄曲霉毒素Bl的高灵敏度免疫层析试纸条的制备方法，包括以下 步骤(1)吸水垫的制备 将吸水纸剪裁成长17mm宽2mm的规格，得吸水垫；(2)检测垫的制备检测线的包被将市售黄曲霉毒素Bl-牛血清白蛋白偶联物AFBl-BSA配制成0. 25mg/mL的包被 液A，于距硝酸纤维素膜上沿15mm、17mm、19mm的位置，用点喷方式将包被液A依次横向包被 于硝酸纤维素膜上，即得检测线I、检测线II和检测线III，每厘米检测线I、检测线II和检 测线III所需黄曲霉毒素Bl-牛血清白蛋白偶联物的包被量分别为300ng、100ng和50ng， 再于38°C条件下干燥10分钟；所述的包被液A为25mg市售黄曲霉毒素Bl-牛血清白蛋白偶联物AFB1-BSA，Ig 牛血清白蛋白，2g蔗糖，0. 03g叠氮化钠，0. 8g氯化钠，0. 29g十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化 钾，磷酸二氢钾0. 02g，加水定容至IOOmL所得；质控线的包被将兔抗鼠多克隆抗体配制成0. 5mg/mL的包被液B，于距检测线I的距离为7mm的 位置，用点喷方式将包被液B横向包被于硝酸纤维素膜上，得到质控线，每厘米质控线所需 兔抗鼠多克隆抗体的包被量为300ng，，然后于38°C条件下干燥15分钟；所述的包被液B为50mg兔抗鼠多克隆抗体，0. 03g叠氮化钠，0. 8g氯化钠，0. 29g 十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，磷酸二氢钾0. 02g，加水定容至IOOmL所得；硝酸纤维素膜长28mm，宽2mm。(3)样品垫的制备将玻璃纤维膜剪裁成长16mm宽2mm的规格，放入封闭液A中浸湿，取出，于38°C条件下干燥12小时，得样品垫，然后置于干燥器中室温保存；所述的封闭液A为1 2g牛血清白蛋白，0. 1 0. 2mL曲拉通X_100，0. 3g聚乙 烯吡咯烷酮，2 5g蔗糖，0. 02 0. 05g叠氮化钠，0. 8g氯化钠，0. 29g十二水磷酸氢二钠， 0. 02g氯化钾，磷酸二氢钾0. 02g，加水定容至IOOmL所得；(4)金标垫的制备将样品垫剪裁成长6mm宽2mm的规格，用点喷方式将纳米金标记的黄曲霉毒素Bl 单克隆抗体溶液横向喷涂于样品垫上，每厘米喷涂长度所需纳米金标记的黄曲霉毒素Bl 单克隆抗体的量为120ng，真空冷冻干燥5h，即得金标垫，然后置于干燥器中室温保存；所述的纳米金标记的黄曲霉毒素Bl单克隆抗体溶液的制备方法为量取50. OmL 市售质量浓度为0. 01%的纳米金溶液，用0. lmol/L碳酸钾水溶液调节纳米金溶液的pH值 为5. 5 ；在搅拌的状态下缓慢加入2mL的0. lmg/mL黄曲霉毒素Bl单克隆抗体水溶液，继 续搅拌30min ；加入10 %牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终浓度为1 %，继续搅拌 30min ；在4°C条件下放置2h后，1500r/min离心15min，吸出上清，弃沉淀；将吸出的上清液 12000r/min离心30min，弃上清液，加入50mL标记洗涤保存液，再12000r/min离心30min， 弃上清液，将得到的沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5. OmL浓缩物，置于4°C保存备用，其 中纳米金标记的黄曲霉毒素Bl单克隆抗体溶液；所述纳米金溶液中纳米金的粒径为18nm ；所述的0. lmol/L碳酸钾水溶液为13. 8g碳酸钾溶于纯水定容至IOOOmL, 0. 22 μ m 滤膜过滤所得；所述的0. lmg/mL黄曲霉毒素Bl单克隆抗体水溶液为lmg市售黄曲霉毒 素Bl单克隆抗体加水定容至IOmL所得；所述的10%牛血清白蛋白水溶液为10g牛血清 白蛋白加水定容至100mL，0. 22 μ m滤膜过滤所得；所述的标记洗涤保存液为2. Og聚乙二 醇-20000，0. 2g叠氮化钠，0. 1235克硼酸，加水定容至1000mL，0. 22 μ m滤膜过滤所得。(5)半定量化检测黄曲霉毒素Bl的多检测线免疫层析试纸条的组装在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连 接处交叠连接，交叠长度为2mm，即得半定量化检测黄曲霉毒素Bl的多检测线免疫层析试 纸条(见图1和图2)。半定量化检测黄曲霉毒素Bl多检测线免疫层析快速检测试纸条的应用，方法如 下称取已磨细待测样品，加入体积浓度为60 80%的甲醇水溶液，待测样品和甲醇水溶 液的质量体积比为2g/mL，混勻，在50°C水浴下超声提取5分钟，静置5分钟，将上层清液即 提取液用水稀释2. 5倍，使稀释液中甲醇的终浓度为28%，再取100 μ L稀释好的样品溶液 做为检测液逐滴加入半定量化检测黄曲霉毒素Bl的多检测线免疫层析试纸条(作检测试 纸条)的样品垫，同时取IOOyL水做为阴性对照液，逐滴加入另一半定量化检测黄曲霉毒 素Bl的多检测线免疫层析试纸条(作对照试纸条)的样品垫，15分钟后读取结果。结果评估待测样品检测试纸条的质控线显示出红色线条，三条检测线的颜色与 对照试纸条的相应检测线的颜色均接近，据此判定此为阴性结果，见图4，这表明待测样品 中的曲霉毒素Bl含量低于0. 625ng/g。实施例3:半定量化检测黄曲霉毒素Bl的高灵敏度免疫层析试纸条的制备方法，包括以下 步骤
(1)吸水垫的制备将吸水纸剪裁成长18mm，宽4mm的规格，得吸水垫；(2)检测垫的制备检测线的包被将黄曲霉毒素Bl-牛血清白蛋白偶联物AFBl-BSA配制成0. 5mg/mL的包被液A，于 距硝酸纤维素膜上沿17mm、19mm、21mm的位置，用点喷方式将包被液A依次横向包被得到检 测线I、检测线II和检测线III，每厘米检测线I、检测线II和检测线III所需的黄曲霉毒 素Bl-牛血清白蛋白偶联物的包被量分别为600ng、200ng和lOOng，再于39°C条件下干燥 10分钟；所述的包被液A为50mg市售黄曲霉毒素Bl-牛血清白蛋白偶联物AFB1-BSA，1. 5g 牛血清白蛋白，1. 5g蔗糖，0. 02g叠氮化钠，0. 8g氯化钠，0. 29g十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯 化钾，磷酸二氢钾0. 02g，加水定容至IOOmL所得；质控线的包被将兔抗鼠多克隆抗体配制成0. 6mg/mL的包被液B，于距检测线I的距离为9mm的 位置，用点喷方式将包被液B横向包被于硝酸纤维素膜上，得到质控线，每厘米质控线所需 的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为500ng，然后于39°C条件下干燥10分钟；所述的包被液B为50mg兔抗鼠多克隆抗体，0. 02g叠氮化钠，0. 8g氯化钠，0. 29g 十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，磷酸二氢钾0. 02g，加水定容至IOOmL所得；所述的硝酸纤维素膜长30mm，宽4mm(3)样品垫的制备将玻璃纤维膜剪裁成长17mm，宽4mm的规格，放入封闭液A中浸湿，于39°C条件下 干燥10小时，得样品垫，然后置于干燥器中室温保存；所述的封闭液A为1.5g牛血清白蛋白，0. 15mL曲拉通X_100，0. 3g聚乙烯吡咯烷 酮，4g蔗糖，0. 02g叠氮化钠，0. 8g氯化钠，0. 29g十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，磷酸二 氢钾0. 02g，加水定容至IOOmL所得；(4)金标垫的制备将样品垫剪裁成长6mm，宽4mm的规格，用点喷方式将纳米金标记的黄曲霉毒素Bl 单克隆抗体溶液横向喷于该样品垫上，每厘米喷涂长度所需纳米金标记的黄曲霉毒素Bl 单克隆抗体的量为72ng，真空冷冻干燥2h，即得金标垫，然后置于干燥器中室温保存；所述纳米金溶液中纳米金的粒径为20nm ；所述的纳米金标记的黄曲霉毒素Bl单克隆抗体溶液的制备方法为量取50. OmL 市售0. 01%纳米金溶液，用0. lmol/L碳酸钾水溶液调节纳米金溶液的PH值为5. 5 ；在搅拌 的状态下缓慢加入2mL的0. lmg/mL黄曲霉毒素Bl单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min ；加 入10 %牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终浓度为1 %，继续搅拌30min ；在4°C条件 下放置2h后，1500r/min离心15min，吸出上清，弃沉淀；将吸出的上清液12，OOOr/min离心 30min,弃上清液，加入50mL标记洗涤保存液，再12，000r/min离心30min，弃上清液，将得到 的沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5. OmL浓缩物，置于4°C保存备用，其中纳米金标记的 黄曲霉毒素Bl单克隆抗体溶液；所述的0. lmol/L碳酸钾水溶液为13. 8g碳酸钾溶于纯水定容至IOOOmL, 0. 22 μ m滤膜过滤所得；所述的0. lmg/mL黄曲霉毒素Bl单克隆抗体水溶液为Img市售黄曲霉毒 素Bl单克隆抗体加水定容至IOmL所得；所述的10%牛血清白蛋白水溶液为10g牛血清 白蛋白加水定容至100mL，0. 22 μ m滤膜过滤所得；所述的标记洗涤保存液为2. Og聚乙二 醇-20000,0. 2g叠氮化钠，0. 1235g硼酸，加水定容至IOOOmL, 0. 22 μ m滤膜过滤所得；(5)半定量化检测黄曲霉毒素Bl的多检测线免疫层析试纸条的组装在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连 接处交叠连接，交叠长度为2mm，即得半定量化检测黄曲霉毒素Bl的多检测线免疫层析试 纸条(见图2)。半定量化检测黄曲霉毒素Bl多检测线免疫层析快速检测试纸条的应用，方法如 下称取已磨细1#和2#待测样品，分别加入体积浓度为60 80%的甲醇水溶液，待测样 品和甲醇水溶液的质量体积比为2g/mL，混勻，在60°C水浴下超声提取8分钟，静置8分钟， 将提取液即上层清液用水稀释2. 5倍，使稀释液中甲醇的终浓度为24%，再取100 μ L稀释 好的样品溶液做为检测液逐滴加入半定量化检测黄曲霉毒素Bl的多检测线免疫层析试纸 条(作检测试纸条)的样品垫，同时取IOOyL水做为阴性对照液，逐滴加入另一半定量化 检测黄曲霉毒素Bl的多检测线免疫层析试纸条(作对照试纸条)的样品垫，15分钟后读取 结果。结果评估1#待测样品检测试纸条的检测线显示红色线条，而质控线不显示红色 线条，则据此判定该检测试纸条的结果无效，见图5-1 ;2#待测样品检测试纸条的检测线 不显示红色线条，而质控线亦不显示红色线条，则据此判定该检测试纸条的结果无效，见图 5-2。
权利要求
半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条，其特征在于包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线、检测线I、检测线II和检测线III，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述检测线I、检测线II和检测线III分别包被有黄曲霉毒素B1 牛血清白蛋白偶联物；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的半定量化检测黄曲霉毒素Bl的多检测线免疫层析试纸条， 其特征在于所述的吸水垫长16 18mm，宽2 4mm ；检测垫长25 30mm，宽2 4mm ；金 标垫长6 9mm，宽2 4mm ；样品垫长12 18mm，宽2 4mm，相邻各垫的交叠长度为1 3mm ο
3.根据权利要求1或2所述的半定量化检测黄曲霉毒素Bl的多检测线免疫层析试纸 条，其特征在于所述检测垫上检测线I、检测线II和检测线III距硝酸纤维素膜上沿的距 离分别为11 17mm、13 19mm、15 21mm，且每相邻两条检测线的间距最小为2mm ；所述 质控线与检测线I的距离为5 11mm。
4.根据权利要求1或2所述的半定量化检测黄曲霉毒素Bl的多检测线免疫层析试纸 条，其特征在于所述检测垫上每厘米检测线I、检测线II和检测线III上所需黄曲霉毒素 Bl-牛血清白蛋白偶联物的包被量分别为120 600ng，40 200ng和20 IOOng ；每厘米 质控线上所需兔抗鼠多克隆抗体的包被量为200 500ng。
5.根据权利要求1或2所述的半定量化检测黄曲霉毒素Bl的多检测线免疫层析试纸 条，其特征在于所述金标垫中所用的纳米金的粒径为15 20nm ；所述金标垫上每厘米喷 涂长度所需纳米金标记的黄曲霉毒素Bl单克隆抗体的用量为60 216ng。
6.根据权利要求1或2所述的半定量化检测黄曲霉毒素Bl的高灵敏度免疫层析试纸 条的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)吸水垫的制备将吸水纸剪裁即得吸水垫；(2)检测垫的制备检测线的包被将市售黄曲霉毒素Bl-牛血清白蛋白偶联物配制成0. 1 0. 5mg/mL的包被液A ；于距 硝酸纤维素膜上沿11 17mm、13 19mm、15 21mm的位置，用点喷方式将包被液A依次 横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线I、检测线II和检测线III，且每条检测线之间的 间距至少为2mm，每厘米检测线I、检测线II和检测线III所需的黄曲霉毒素Bl-牛血清 白蛋白偶联物(AFBl-BSA)的包被量分别为120 600ng，40 200ng和20 lOOng，再于 37 40°C条件下干燥8 20分钟；质控线的包被将兔抗鼠多克隆抗体配制成0. 4 0. 6mg/mL的包被液B ；于距硝酸纤维素膜上检测线 I的距离为5 11mm，用点喷方式将包被液B横向包被于硝酸纤维素膜上，得到质控线，每 厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为200 500ng，然后于37 40°C条件下干 燥8 20分钟；(3)样品垫的制备将玻璃纤维膜放入封闭液A中浸湿，取出，于37 40°C条件下干燥10 16小时，得样 品垫，然后置于干燥器中室温保存；(4)金标垫的制备用点喷方式将纳米金标记的黄曲霉毒素Bl单克隆抗体溶液横向喷涂于样品垫上，每 厘米喷涂长度所需纳米金标记的抗黄曲霉毒素Bl单克隆抗体的量为60 216ng，真空冷冻 干燥2 6h，即得金标垫，然后置于干燥器中室温保存；(5)半定量化检测黄曲霉毒素Bl的多检测线免疫层析试纸条的组装在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处 交叠连接，交叠长度为1 3mm，即得半定量化检测黄曲霉毒素Bl的多检测线免疫层析试纸^^ ο
7.根据权利要求6所述的半定量化检测黄曲霉毒素Bl的高灵敏度免疫层析试纸条的 制备方法，其特征在于所述的包被液A为10 50mg市售黄曲霉毒素Bl-牛血清白蛋白偶 联物(AFB1-BSA)，1 2g牛血清白蛋白，1 2g蔗糖，0. 02 0. 05g叠氮化钠，0. 8g氯化 钠，0. 29g十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，0. 02g磷酸二氢钾，加水定容至IOOmL所得；所述的包被液B为50mg兔抗鼠多克隆抗体，0. 02 0. 05g叠氮化钠，0. 8g氯化钠， 0. 29g十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，0. 02g磷酸二氢钾，加水定容至IOOmL所得。
8.根据权利要求6所述的半定量化检测黄曲霉毒素Bl的高灵敏度免疫层析试纸条 的制备方法，其特征在于所述的封闭液A为1 2g牛血清白蛋白，0. 1 0. 2mL曲拉通 X-100,0. 3g聚乙烯吡咯烷酮，2 5g蔗糖，0. 02 0. 05g叠氮化钠，0. 8g氯化钠，0. 29g十二 水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，0. 02g磷酸二氢钾，加水定容至IOOmL所得。
9.根据权利要求6所述的半定量化检测黄曲霉毒素Bl的高灵敏度免疫层析试纸条 的制备方法，其特征在于所述的纳米金标记的黄曲霉毒素Bl单克隆抗体溶液的制备方法 为量取50. OmL市售质量浓度为0. 01%纳米金溶液，调节纳米金溶液的pH值为5. 5 ；在搅 拌的状态下缓慢加入2mL的0. lmg/mL黄曲霉毒素Bl单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min ； 加入质量浓度为10%的牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为1%，继续搅 拌30min ；在4°C条件下放置2h后，1500r/min离心15min，吸出上清，弃沉淀；将吸出的上 清液12000r/min离心30min，弃上清液，加入50mL标记洗涤保存液，再12000r/min离心 30min，弃上清液，将得到的沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5. OmL浓缩物，置于4°C保存 备用，其中纳米金标记的黄曲霉毒素Bl单克隆抗体溶液的质量浓度为0. 04mg/mL ；所述的标记洗涤保存液为2. Og聚乙二醇-20000，0. 2g叠氮化钠，0. 1235克硼酸，加水 定容至IOOOmL, 0. 22 μ m滤膜过滤所得。
10.一种根据权利要求1或2所述的半定量化检测黄曲霉毒素Bl的高灵敏度免疫层 析试纸条的应用，其特征在于称取已磨细的待测样品，加入体积浓度为60 80%的甲醇 水溶液，待测样品和甲醇水溶液的质量体积比为2g/mL，混勻，在50 60°C水浴下超声提取 5 10分钟，静置5 10分钟，将上层清液即提取液用水稀释2. 5倍，使稀释液中甲醇的终 浓度为24 32%，再取100 μ L稀释好的样品溶液做为检测液逐滴加入半定量化检测黄曲 霉毒素Bl的多检测线免疫层析试纸条的样品垫，其作为检测试纸条，同时取100μ L水做为 阴性对照液，逐滴加入另一半定量化检测黄曲霉毒素Bl的多检测线免疫层析试纸条的样 品垫，其作为对照试纸条，15分钟后读取结果；结果评估(1)阳性待测样品检测试纸条的质控线显示出红色线条，而若三条检测线 中的检测线I颜色比对照试纸条稍浅，检测线II、检测线III颜色与对照试纸条基本相同， 则样品中的黄曲霉毒素Bl含量在0. 625 1. 25ng/g之间；若三条检测线中检测线I不显 色，检测线II、检测线III颜色与对照试纸条基本相同，则样品中的黄曲霉毒素Bl含量为 1. 25ng/g ；若三条检测线中检测线I不显色，检测线II颜色比对照试纸条浅，检测线III颜 色与对照试纸条基本相同，则样品中的黄曲霉毒素Bl含量在1. 25 2. 5ng/g之间；若试 纸条三条检测线的检测线I、检测线II不显色，检测线III颜色与对照试纸条基本相同，则 样品中的黄曲霉毒素Bl含量为2. 5ng/g ；若三条检测线中检测线I、II不显色，检测线III 颜色比对照试纸条稍浅，则样品中的黄曲霉毒素Bl含量在2.5 lOng/g之间；若三条检 测线均不显色，则样品中的黄曲霉毒素Bl含量不低于lOng/g。(2)阴性待测样品检测试 纸条的质控线显示出红色线条，三条检测线的颜色与对照试纸条的相应检测线的颜色均接 近，为阴性结果，表明待测样品中的曲霉毒素Bl含量低于0.625ng/g。(3)无效无论待测 样品检测试纸条的检测线显示或不显示出红色线条，只要质控线不显示出红色线条，该试 纸条判为无效。
全文摘要
本发明属生物检测领域。半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条，包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线、检测线I、检测线II和检测线III，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述检测线I、检测线II和检测线III分别包被有黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体。该试纸条用于半定量化检测黄曲霉毒素B1，具有检测快速，操作简单，灵敏度高的特点。
文档编号G01N33/558GK101900728SQ20101024509
公开日2010年12月1日 申请日期2010年8月5日 优先权日2010年8月5日
发明者丁小霞, 姜俊, 张奇, 张文, 张道宏, 李培武, 陈小媚 申请人:中国农业科学院油料作物研究所