专利名称：一种用于肝癌早期诊断的蛋白质指纹图谱模型的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用飞行质谱技术检测人肝癌血清，以获得血清肿瘤标志物的方法，为肝癌的早期诊断提供实验基础。
背景技术：
肝癌(liver cancer)是死亡率仅次于胃癌、食道癌的第三大常见恶性肿瘤，肝癌起病常隐匿，多在肝病随访中或体检普查中应用AFP及B型超检查偶然发现肝癌。此时病人既无症状，体格检查亦缺乏肿瘤本身的体征，此期称之为亚临床期。早期症状肝癌从第一个癌细胞形成发展到有自觉症状，大约需要2年时间，在此期间，病人可无任何症状或体征，少数病人会出现食欲减退，上腹闷胀、乏力等，有些病人可能轻度肝肿大。肝癌一旦出现症状，而来就诊者其病程大多已进入中晚期。中、晚期症状肝癌的典型症状和体征一般出现于中、晚期，主要有肝痛、乏力、消瘦、黄疸、腹水等。临床上一般采取西医的手术、放化疗与中药结合疗法，但晚期患者因癌细胞扩散而治愈率较低，因此做到肝癌的早期发现、早期诊断、早期治疗具有非常重要的意义。近年来，蛋白质组学已成为检测和筛查肿瘤标志物的重要手段之一。表面加强激光解析电极一飞行时间质谱技术是最近几年发展起来的一种新的蛋白质组学研究方法， 它能够直接从未处理的生物样品获取蛋白质组图谱。基于此技术开发的蛋白质芯片可以非特异性或特异性地结合各种蛋白质，并在质谱仪中受到激光轰击，各种结合蛋白质会被激发而形成气化离子，根据不同电离子在电场中飞行的时间长短，形成强弱不同的质谱峰，进而形成图谱用于分析。近年来该技术在差异表达蛋白质组、蛋白质相互作用及疾病检测方面得到了广泛的应用，尤其适合于多肽及低分子量蛋白质谱分析。该技术在寻找前列腺、膀胱、乳腺等疾病的诊断标记物方面已经取得了较大进展。
发明内容
本发明利用Bio-Rad公司的蛋白质飞行时间质谱仪系统，检测早期肝癌和健康人血清的蛋白质谱，利用软件分析肝癌与正常人血清对照蛋白质组的差异，发表肝癌相关的蛋白质谱，并构建诊断模型，用于诊断早期肝癌。本发明将早期肝癌和健康人血清分别利用Bio-Rad公司蛋白质芯片检测，得到数据利用该公司的Biosystems软件的Biomarker wizard功能，分别对肝癌和正常组样品的蛋白质波谱进行比较，得出特异的蛋白质图谱，再根据统计分析发现肝癌与正常组有统计学显著差异(P < 10-e5)的蛋白质峰，并使用MathWorks公司的Matlab 2009a软件对肝癌与对照组差异显著特异蛋白质进行分析，采用三倍交叉证实的方法抽样，重复抽样1000 次，得到1000个决策树。从中选出交叉证实正确率最高的20个决策树对盲法筛选组进行归类预测，建立了肝癌与正常人蛋白质指纹图谱模型。利用该指纹质谱模型，将受检人血清中相应的蛋白质的质荷比与本发明指纹图谱模型逐一进行比对，可为早期肝癌诊断提供辅助指导。
指纹质谱模型的检测方法如下1.血清标本制备肝癌患者术前血和正常对照外周静脉血采集后立即放入4°C冰箱。检测时，融解冰冻血清，离心，取血清样品加缓冲液，振摇。2.平衡芯片将醋酸钠溶液加入芯片的加样孔中，平衡芯片2次，每次5min。3.血清样品稀释取血清样品，加入尿素，振荡30min，加入醋酸钠溶液中，混勻稀释。4.芯片上样取稀释后的血清样品加入平衡好的芯片加样孔，置芯片于摇床孵育90min。5.样品洗脱取醋酸钠溶液加入芯片加样孔，洗脱2次，每次5min。取去离子水冲洗芯片。6.芯片和蛋白质结合反应取能量吸收剂加入芯片加样孔，待自然挥发后再重复加吸收剂一次。7.芯片检测将芯片置于蛋白芯片阅读机中，用加有标准蛋白质的芯片校正仪器。设置芯片阅读仪参数，用CipheEgen Pmteinchip 3. 1. 1软件收集数据。其中纵坐标为蛋白质相对含量， 横坐标为蛋白质质荷比(M/Z)。经过临床试用，20个决策树模型可以较好地区分早期肝癌和正常对照，预测准确率为85%。
图1指纹质谱模型的检测方法流程。
具体实施例方式1.材料1. 1检测血清
取受试者静脉血5ml，在4度冰箱中静置2小时后离心(4000rpm，5min).取血清， 置低温冰箱(负80度)或液氮保存，备用。1. 2所需主要试剂与仪器乙酸钠、乙腈、三氟乙酸、白芥子酸(SPA)均购自上海化学试剂公司。CMW蛋白芯片和蛋白质芯片阅读机(PBS II型)购自美国Bio-Rad公司。2.方法2. 1平衡芯片取200ul 50mmol/L pH 4. 0的醋酸钠(NaAc)溶液加入芯片的加样孔中，平衡芯片2次，每次5min。2. 2血清样品稀释取 6ul 血清样品，加入 12ul 9mmol/L 尿素，振荡 30min，加入 222ul 50mmol/L pH 为3. 0的NaAc溶液中，混勻稀释。2.3.芯片上样取稀释后的血清样品200ul/孔加入平衡好的芯片加样孔，置芯片于摇床孵育90mino2. 4.样品洗脱取50mmol/L pH 4. 0的NaAc溶液200ul/孔加入芯片加样孔，洗脱2次，每次5min。 取300ul/孔的去离子水冲洗芯片。2.5.芯片和蛋白质结合反应取能量吸收剂SPA(含饱和白芥子酸溶液与质量分数50%乙腈和0. 15%三氟乙酸)0. 5ul/孔加入芯片加样孔，待自然挥发后再重复加SPA —次。2. 6.芯片检测将芯片置于蛋白芯片阅读机中，用加有AU-in_0ne标准蛋白质的NP20芯片校正仪器至0. 1 %范围内。芯片阅读仪参数设置激光强度150，检测灵敏度7，优化范围1984. 2 9921 u，最高分子量49605u，芯片上的每个点采集130次。用CipheEgen Proteinchip 3. 1. 1软件收集数据。其中纵坐标为蛋白质相对含量，横坐标为蛋白质质荷比(M/Z)。将分析得到的受检者的血清蛋白波谱根据指纹质谱模型(图1)中特异蛋白质质荷比进行比较， 以判断受检者是否患有肝癌(见实施实例)。实验实例取受检者血清，经检验得到其血清蛋白图谱，按肝癌与正常组鉴别的蛋白质指纹质谱模型，运用20个决策树来对受检者进行预测，结果显示20个模型中有1个(5%)决策树预测结果认为该样本是病例组，19个(95% )认为是对照组，投票结果以多数为准，即把受检者归为病例组，即早期肝癌病人。如果20个决策树有大于50%的决策树将受检者归为对照组，则该受检者为正常人。以上是对本发明的描述而非限定，基于本发明思想的其它实施方式，均在本发明的保护范围之中。
权利要求
1.用于肝癌早期诊断的蛋白质指纹图谱模型，其特征在于由蛋白质芯片飞行时间质谱仪系统检测的血清蛋白质图谱经过软件统计分析得到肝癌患者多个特异蛋白质的质荷比m/z，利用这些差异m/z构建了 20个决策树，决策树分别采用了 m/z4476，m/zll812, m/ z4095, m/z2819, m/z6198, m/z3361, m/z3361, m/z3377, m/z5639, m/z4820, m/z4259, m/ zll812, m/z8699。
全文摘要
本发明涉及医学诊断技术领域，是一种可以用于早期肝癌诊断的蛋白质指纹图谱模型。本发明用蛋白质芯片飞行时间质谱系统，检测正常人及早期肝癌病人的外周血清样品，找出与肝癌患者差异显著的特异蛋白质峰，根据各蛋白质峰的质荷比(m/z)，采用决策树算法，得到拥有20个决策树的蛋白质指纹图谱模型。只要将检测人血清中相应的蛋白质的m/z与本发明的模型进行分析，依据决策树少数服从多数的原则，就可以初步用于肝癌诊断。其预测准确率为85％。
文档编号G01N27/62GK102323325SQ20101056167
公开日2012年1月18日 申请日期2010年11月25日 优先权日2010年11月25日
发明者曾华宗 申请人:上海聚类生物科技有限公司