专利名称：一种在聚二甲基硅氧烷表面固定蛋白质的方法
技术领域：
本发明属于表面化学修饰技术领域，具体涉及一种在聚二甲基硅氧烷表面固定蛋白质的方法。
背景技术：
聚二甲基硅氧烷(PDMS)，俗称硅橡胶，是一种生物兼容性非常好的聚合物材料，是目前应用最广泛的微流控芯片加工材料之一。PDMS微流控芯片具有如下优点(1)制作成本低廉，制作过程方便快速，可批量生产；( 单体可低温聚合，对设备无特殊要求；(3)表面能低，容易与PDMS及其它材料如玻璃、其他高分子材料进行暂时性或永久性封合，而且在使用过程中，如果微管道堵塞，暂时封合的芯片可以拆开清洗后再封合使用，大大降低了使用成本；(4)生物兼容性好，无毒性；( 表面可进行多种化学处理；(6)低导电性。以 PDMS微流控芯片为平台进行免疫分析应用研究是简化和改善现有免疫检测方法性能的一个重要途径。通常微流控免疫分析法要求在微流控材料的表面固定蛋白质，现有的在相对惰性的PDMS表面固定蛋白质的方法包括(1)利用PDMS表面的本质的非特异性吸附现象， 进行固定蛋白质，(缺点是特异性差)；(2)利用等离子体处理PDMS表面，使其表面所产生的羟基进一步固定蛋白质(缺点是表面羟基寿命约为30秒，稳定性差，且需要实验者进行快速操作)；C3)利用紫外光激活PDMS表面或利用化学蒸镀(chemical vapor deposition) 方法，固定蛋白质(缺点是操作复杂)；(4)通过加生物素衍生化试剂进入未固化的PDMS前聚体中，直接利用特异性的生物素-抗生物素化学方法。相比之下，第四种方法具有特异性好、稳定、简单的优点，但缺点是只能直接固定抗生物素类的蛋白质，所能固定的蛋白质种类受到限制，并且掺杂固定在PDMS中的一个衍生化生物素分子最多只能连接一个抗生物素蛋白，导致固定的蛋白质量较少。因此，现有的在PDMS表面固定蛋白质的方法仍有待进一步的改进。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在PDMS表面固定蛋白质的方法，以克服现有的PDMS 表面固定蛋白质的方法或特异性差或不稳定或操作复杂或固定的蛋白质种类和数量有限的缺陷。该方法特异性高、稳定性好、操作简单、可固定各种蛋白质且固定蛋白质的数量多， 为后续的微流控芯片免疫分析检验奠定了基础。本发明提供一种在PDMS表面固定蛋白质的方法，首先将磷脂生物素加入到未固化的PDMS前聚体中，并涂布在一已固化的PDMS支撑层的表面，固化后在PDMS支撑层的表面形成一层生物素化的PDMS薄膜，接着依次用包含有β -D-十二烷基-N-麦芽糖的磷酸盐缓冲溶液(DPBS)、包含有抗生物素蛋白的磷酸盐缓冲溶液、包含有1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(MB)的3-巯基丙酸稳定的金纳米颗粒 (MPA-AuNPs)溶液浸泡所述PDMS薄膜表面，然后，用待固定蛋白质溶液浸泡所述PDMS膜表面，将待固定蛋白质固定在所述PDMS薄膜表面，最后用包含有牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲溶液浸泡所述PDMS薄膜表面，即可完成在PDMS表面固定蛋白质。进一步地，生物素化的PDMS薄膜的制备为在PDMS前聚体/正己烷溶液中加入 5mg/mL磷脂生物素的氯仿溶液，PDMS前聚体与正己烷的质量比为1 2，PDMS前聚体/正己烷溶液与磷脂生物素的质量比为Ig 0. Olmg-Ig 0.05mg，然后涂布在所述已固化的 PDMS支撑层表面，在70-80°C下固化20-40分钟，形成一层生物素化的PDMS薄膜。进一步地，β-d-十二烷基-n-麦芽糖的磷酸盐缓冲溶液中，β-d-十二烷基-n-麦芽糖的百分含量为0. 1-0. 2衬％，所述磷酸盐缓冲溶液的？!1为7.4、浓度为 10mmol/Lo进一步地，用β -D-十二烷基-N-麦芽糖的磷酸盐缓冲溶液浸泡所述PDMS薄膜表面的浸泡时间为5-20分钟。进一步地，用含抗生物素蛋白的磷酸盐缓冲溶液浸泡所述PDMS薄膜表面的浸泡时间为20-60分钟，所述含抗生物素蛋白的磷酸盐缓冲溶液中，抗生素蛋白的浓度为 100-300 μ g/mL0进一步地，所述包含有1-乙基-3- (3- 二甲氨基丙基)碳二亚胺和n-羟基丁二酰亚胺的mpa-aunps溶液的制备为将1-乙基-3- (3- 二甲氨基丙基)碳二亚胺和n-羟基丁二酰亚胺加入到mpa-aunps溶液中，孕育ih进一步地，用包含有1-乙基-3- (3- 二甲氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺的MPA-AuNPs溶液浸泡所述PDMS薄膜表面的浸泡时间为1_3小时。进一步地，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺在MPA-auni3s溶液中的最终浓度为0. lmol/L, N-羟基丁二酰亚胺在MPA-AuNPs溶液中的最终浓度为0. 4mol/L。进一步地，待固定蛋白质溶液为含有待固定蛋白质的磷酸盐缓冲溶液，其浸泡所述PDMS薄膜表面的温度为2-6°C，浸泡时间为6-Mh。进一步地，在用包含有1-乙基-3- (3- 二甲氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺的MPA-AuNPs溶液浸泡所述PDMS薄膜表面的操作、将待固定蛋白质固定在所述PDMS 薄膜表面的操作、以及用含有1 % BSA的磷酸盐缓冲溶液浸泡所述PDMS薄膜表面的操作后， 均采用lOmmol/L pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液冲洗PDMS薄膜表面。进一步地，所述包含有抗生物素蛋白的磷酸盐缓冲溶液中还包括有β-d-十二烷基-n-麦芽糖，所述包含有1 % bsa的磷酸盐缓冲溶液中还包括有β -d-十二烷基-n-麦芽糖，所述包含有待固定蛋白质的磷酸盐缓冲溶液中还包括有β -d-十二烷基-n-麦芽糖。本发明的方法首先将磷脂生物素加入到未固化的PDMS前聚体中，并涂布在已固化的PDMS支撑层的表面，固化后形成一层生物素化的PDMS薄膜；利用生物素-抗生物素蛋白、水溶性碳二亚胺化学以及3-巯基丙酸稳定的金纳米颗粒技术将蛋白质固定在PDMS表面；β -D-十二烷基-N-麦芽糖和牛血清白蛋白被分别用于封锁蛋白质在PDMS表面的非特异性吸附和在MPA-AuNPs表面处于激活状态的残余羧基基团。本发明所述的方法中，利用金纳米颗粒比表面积大、以及MPA-AuNPs表面含有多个羧基基团的特点，可将各种类蛋白质更多量地固定在PDMS表面，克服了现有的生物素衍生化PDMS方法仅能在PDMS表面固定抗生物素类蛋白质且固定的抗生物素类蛋白质量少的缺陷。与现有技术相比，本发明的有益效果是(1)本发明是在生物素化PDMS表面的基础上，利用生物素-抗生物素蛋白、水溶性碳二亚胺化学以及3-巯基丙酸稳定的金纳米颗粒(MPA-AuNPs)技术将蛋白质特异性固定在PDMS表面，特异性好，且可以固定各种类蛋白质；(2)本发明利用金纳米颗粒比表面积大的特点，可增加固定的蛋白质量，有效提高后续微流控免疫分析检验的灵敏度；(3)本发明利用生物素与抗生物素蛋白之间的强亲和作用以及抗生物素蛋白与 MPA-AuNPs、待固定蛋白质与MPA-AuNPs之间的共价键结合，将待固定蛋白牢固结合到PDMS 表面，具有良好的稳定性；(4)本发明的方法条件温和、操作方便。
图1为本发明的PDMS表面抗体蛋白固定示意图。图2A-B为PDMS薄膜表面的ATR4R(衰减全反射红外)光谱图。曲线1、2、3、4、5 分别代表本性的PDMS薄膜、用DPBS处理后的PDMS薄膜、用抗生物素蛋白链菌素的DPBS溶液处理的PDMS薄膜、用抗生物素蛋白链菌素的DPBS溶液处理的生物素化的PDMS薄膜(BSD 膜)、依次用MPA-AuNPs溶液和含apoBlOO抗体的DPBS溶液处理的BSD膜的ATR4R图谱。
具体实施例方式以下结合具体实例对本发明的一种在聚二甲基硅氧烷表面固定蛋白质的方法作进一步的详述。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明要求保护的范围。在以下实施例中，所采用的PDMS前聚体RTV 615购自Momentive公司(Albany， NY, USA)、憐月旨生物素(1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoet hanolamine-N-biotinyl, Bio-DOPE)购自 Avanti Polar Lipids 公司(Alabast er，AL，USA)、β-D-十二烷基-N-麦芽糖购自AppliChem公司(Ottoweg，Da rmstadt DE, Germany)、抗生物素蛋白链菌素购自 Sigma-Aldrich 公司(St. Louis, MO, USA) ,1-乙基-3-(3- 二甲氨基丙基)碳二亚胺购自 Sigma-Aldr ich 公司(St. Louis, MO, USA)、N-羟基丁二酰亚胺购自 Sigma-Aldrich 公司(St. Louis, MO, USA) ；3-巯基丙酸稳定的金纳米颗粒(MPA-AuNPS)参照文献合成 (Yonezawa, Τ. ；Kunitake, Τ. Colloids Surf. A，1999，149，193-199)；其余试剂均为市售产品。所采用的旋转涂层仪器(型号WS-400-6NPP-LITE)购自Laurell Technologies Corporation 公司(North Wales，PA，USA)，采用的装备有 ATR(an attenuated total reflection，衰减全反射)部件的FTIR/R760红外光谱仪购自Nicolet公司(WI，USA).缩写和定义本文所用的PDMS是指聚二甲基硅氧烷。本文所用的MPA-AuNPs溶液是指用3_巯基丙酸(MPA)稳定的金纳米颗粒溶液。本文所用的BSA是指牛血清白蛋白。本文所用的PBS是指pH为7. 4、浓度为lOmmol/L的磷酸盐缓冲溶液。本文所用的DPBS是指含有β -D-十二烷基-N-麦芽糖的磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液的PH为7. 4、浓度为lOmmol/L。本文所用的EDC是指1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺。
本文所用的NHS是指N-羟基丁二酰亚胺。本文所用的BSD膜是指用抗生物素蛋白链菌素的DPBS溶液处理的生物素化的 PDMS薄膜。实施例1在本实例中，采用低密度脂蛋白apoB 100抗体mAb LDL-10/17 (购自Abcam公司 (Cambridge, MA, USA))为待固定蛋白，按照以下方法将待固定蛋白固定在PDMS表面，固定蛋白的示意图如图1所示(1)在60mmX60mm PDMS支撑层表面形成一层生物素化的PDMS薄膜。即在PDMS 前聚体/正己烷(质量比为1 2，PDMS前聚体/正己烷溶液的质量为Ig)溶液中加入10 微升5mg/mL磷脂生物素的氯仿溶液，随后涂层在PDMS支撑层表面，在80°C下固化20分钟， 形成一层生物素化的PDMS薄膜。(2)为了阻止蛋白质在生物素化的PDMS薄膜表面的非特异性吸附，用含有 0. Iwt % β -D-十二烷基-N-麦芽糖的lOmmol/L pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液(DPBS)浸泡生物素化的PDMS薄膜表面5分钟。(3)为了使抗生物素蛋白链菌素与生物素基团发生特异性结合，用200μ g/mL的抗生物素蛋白链菌素(sti^ptavidin)的DPBS溶液浸泡生物素化的PDMS薄膜表面30分钟， 随后用lOmmol/L pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗表面。(4)为了将3-巯基丙酸稳定的金纳米颗粒(MPA-AuNPS)固定在PDMS薄膜表面，首先激活MPA-AuNPS表面的羧基基团，即将1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和 N-羟基丁二酰亚胺(NHS)加入到MPA-AuNPS溶液中(EDC和NHS的最终浓度分别为0. Imol/ L和0. 4mol/L)，孕育1个小时；随后将嫁接有抗生物素蛋白链菌素的PDMS薄膜表面沉浸在该溶液中孕育2个小时，MPA-AuNPS纳米颗粒被固定在PDMS薄膜表面，之后用PBS冲洗 PDMS薄膜表面。(5)为了将低密度脂蛋白apoB 100抗体固定在PDMS薄膜表面，用含有该蛋白质的 DPBS溶液浸泡固定有金纳米颗粒的PDMS薄膜表面，过夜)，之后用PBS冲洗PDMS薄膜表面。(6)为了封锁残余在MPA-AuNPS表面的处于激活状态的羧基，用含有1 % BSA的 DPBS溶液浸泡固定有apoB 100抗体蛋白质的PDMS薄膜表面10分钟，之后用PBS冲洗PDMS 薄膜表面。即在PDMS表面完成了 apoB 100抗体蛋白质的固定。实施例2在本实例中，采用甲胎蛋白抗体(购自American Research Products公司 (Belmont, MA, USA))为待固定蛋白。(1)在60mmX60mm PDMS支撑层表面形成一层生物素化的PDMS薄膜。即在PDMS 前聚体/正己烷(质量比为1 2，PDMS前聚体/正己烷的质量为Ig)溶液中加入2微升 5mg/mL磷脂生物素的氯仿溶液，随后涂层在PDMS支撑层表面，在80°C下固化20分钟，形成一层生物素化的PDMS薄膜。(2)为了阻止蛋白质在生物素化的PDMS表面的非特异性吸附，用含有0.2wt% β -D-十二烷基-N-麦芽糖的lOmmol/L pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液(DPBS)浸泡生物素化的 PDMS表面5分钟。
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(3)为了使抗生物素蛋白链菌素与生物素基团发生特异性结合，用200μ g/mL的抗生物素蛋白链菌素的DPBS溶液浸泡生物素化的PDMS表面30分钟，随后用lOmmol/L pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液(PBQ冲洗表面。(4)为了将MPA-AUNPS纳米颗粒固定在PDMS表面，首先激活MPA-AUNPS表面的羧基基团，即将1-乙基-3-(3- 二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS) 加入到3-巯基丙酸稳定的金纳米颗粒(MPA-AUNPS)溶液中(EDC和NHS的最终浓度分别为 0. lmol/L和0. 4mol/L)，孕育1个小时；随后将嫁接有抗生物素蛋白链菌素的PDMS表面沉浸在该溶液中孕育2个小时，MPA-AUNPS纳米颗粒被固定在PDMS表面，之后用PBS冲洗表(5)为了将甲胎蛋白抗体固定在PDMS表面，用含有该蛋白质的DPBS溶液浸泡固定有金纳米颗粒的PDMS表面，过夜)，之后用PBS冲洗表面。(6)为了封锁残余在MPA-AUNPS表面的处于激活状态的羧基，用含有1 % BSA的 DPBS溶液浸泡固定有甲胎蛋白抗体的PDMS表面10分钟，之后用PBS冲洗表面。即在PDMS 表面完成了甲胎蛋白抗体的固定。实施例3在本实例中，利用FTIR/R760红外光谱仪(装备有ATR部件)对实例1中的本性 PDMS薄膜以及修饰的PDMS薄膜进行了表征(图2A-2B)。本性的PDMS薄膜的光谱(曲线1) 在3386CHT1附近没有吸收峰，而经DPBS溶液处理的PDMS薄膜的光谱(曲线2)在3386CHT1 附近有一个明显的宽吸收峰，这表明具有许多羟基的非离子表面活性剂β-D-十二烷基-N-麦芽糖分子吸附到PDMS表面。同经DPBS溶液处理的PDMS薄膜相比，用含抗生物素蛋白链菌素的DPBS溶液处理的PDMS薄膜的光谱(曲线3)在3386CHT1附近没有明显的变化，这表明表面活性剂β -D-十二烷基-N-麦芽糖有效阻止了抗生物素蛋白链菌素在PDMS 表面的非特异性吸附。然而，用抗生物素蛋白链菌素的DPBS溶液修饰生物素化的PDMS薄膜时，其光谱(曲线4)强度在3386CHT1附近明显增大。由于氨基基团与羟基基团均在3386CHT1 附近有吸收，因此3386CHT1附近光谱吸收的明显增加可归功于抗生物素蛋白链菌素分子中的氨基基团，说明生物素基团被引进到PDMS表面且抗生物素蛋白链菌素利用生物素-抗生物素特异性反应结合在生物素化的PDMS表面。在此基础上，进一步用MPA-AuNPs和ApoB 100抗体蛋白进行修饰，所测得的光谱(曲线5)在3386CHT1附近有更大的增加，同时在 1650CHT1附近出现了一个新的吸收峰。MPA-AUNPS的放大效应增加了 3386CHT1附近的吸收， 即每一个MPA-AuNP可结合多个抗体蛋白，而每一个抗体蛋白至少含有一个羟基基团，这些羟基基团在3386CHT1附近产生了更大的吸收峰。在1650CHT1附近的新吸收峰(曲线5)与羰基基团(来自于残留的NHS和MPA-AuNP复合物以及固定于MPA-AuWs上抗体蛋白)有关。所有这些光谱变化表明抗体蛋白被特异性地固定在生物素化的PDMS薄膜表面。
权利要求
1.一种在聚二甲基硅氧烷(PDMS)表面固定蛋白质的方法，其特征在于，首先将磷脂生物素加入到未固化的PDMS前聚体中，并涂布在一已固化的PDMS支撑层表面，固化后在PDMS 支撑层表面形成一层生物素化的PDMS薄膜，接着依次用β -D-十二烷基-N-麦芽糖的磷酸盐缓冲溶液、包含有抗生物素蛋白的磷酸盐缓冲溶液、包含有1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺的3-巯基丙酸稳定的金纳米颗粒(MPA-AuNPs)溶液浸泡所述PDMS薄膜表面，然后，用待固定蛋白质溶液浸泡所述PDMS膜表面，将待固定蛋白质固定在所述PDMS薄膜表面，最后用包含有牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲溶液浸泡固定所述PDMS膜表面。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，生物素化的PDMS薄膜的制备为在PDMS 前聚体/正己烷溶液中加入5mg/mL磷脂生物素的氯仿溶液，PDMS前聚体与正己烷的质量比为1 2，PDMS前聚体/正己烷溶液与磷脂生物素的质量比为Ig 0. Olmg-Ig 0. 05mg, 然后涂覆在所述已固化好的PDMS支撑层表面，在70-80°C下固化20-40分钟，在PDMS支撑层上形成一层生物素化的PDMS薄膜。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，β-D-十二烷基-N-麦芽糖的磷酸盐缓冲溶液中，β -D-十二烷基-N-麦芽糖的百分含量为0. 1-0. 2wt%，所述磷酸盐缓冲溶液的pH 为7. 4、浓度为lOmmol/L，用β -D-十二烷基-N-麦芽糖的磷酸盐缓冲溶液浸泡所述PDMS 薄膜表面的浸泡时间为5-20分钟。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用含抗生物素蛋白的磷酸盐缓冲溶液浸泡所述PDMS薄膜表面的浸泡时间为20-60分钟，所述含抗生物素蛋白的磷酸盐缓冲溶液中，抗生素蛋白的浓度为100-300 μ g/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述包含有1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺的MPA-AuNPs溶液的制备为将1_乙基_3_ (3- 二甲氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺加入到MPA-AuNPs溶液中，孕育1_池。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，用包含有1-乙基-3-(3- 二甲氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺的MPA-AuNPs溶液浸泡所述PDMS薄膜表面的浸泡时间为1-3小时。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺在MPA-AuNPs溶液中的最终浓度为0. lmol/L, N-羟基丁二酰亚胺在MPA-AuNPs溶液中的最终浓度为0. 4mol/L。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，待固定蛋白质溶液为含有待固定蛋白质的磷酸盐缓冲溶液，其浸泡所述PDMS薄膜表面的温度为2-6°C，浸泡时间为6-24h。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在用包含有1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺的MPA-AuNPs溶液浸泡所述PDMS薄膜表面的操作、将待固定蛋白质固定在所述PDMS薄膜表面的操作、以及用含有BSA的磷酸盐缓冲溶液浸泡所述PDMS薄膜表面的操作后，均采用lOmmol/L pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液冲洗PDMS薄膜表面。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述包含有抗生物素蛋白的磷酸盐缓冲溶液中还包括有β -D-十二烷基-N-麦芽糖，所述包含有BSA的磷酸盐缓冲溶液中还包括有β -D-十二烷基-N-麦芽糖，所述包含有待固定蛋白质的磷酸盐缓冲溶液中还包括有β-D-十二烷基-N-麦芽糖。
全文摘要
本发明提供一种在聚二甲基硅氧烷表面固定蛋白质的方法，该方法首先在已固化的聚二甲基硅氧烷表面制备一层生物素化的聚二甲基硅氧烷薄膜；利用生物素-抗生物素蛋白、水溶性碳二亚胺化学以及3-巯基丙酸稳定的金纳米颗粒技术将蛋白质固定在聚二甲基硅氧烷表面；β-D-十二烷基-N-麦芽糖和牛血清白蛋白被分别用于封锁蛋白质在聚二甲基硅氧烷表面的非特异性吸附和在3-巯基丙酸稳定的金纳米颗粒表面处于激活状态的残余羧基基团。本发明的方法中，基于一个3-巯基丙酸稳定的金纳米颗粒表面含有多个羧基基团，可结合多个待固定蛋白质分子，将更多待固定蛋白质固定在聚二甲基硅氧烷表面，能有效提高后续ELISA检验的灵敏度。
文档编号G01N33/531GK102243242SQ20111009500
公开日2011年11月16日 申请日期2011年4月15日 优先权日2011年4月15日
发明者刘宝红, 吴会灵, 杨芃原, 纪季, 范国荣, 陈肇娜 申请人:中国人民解放军第二军医大学