黄曲霉毒素B₁的荧光增敏剂及其运用的制作方法

专利名称：黄曲霉毒素B₁的荧光增敏剂及其运用的制作方法
技术领域：
本发明涉及化学领域的含量分析领域，特别涉及黄曲霉毒素B1的荧光检测。
背景技术：
黄曲霉毒素B1于1993年被世界卫生组织(WTO)的癌症研究机构划定为I类致癌物，对人类健康危害极大。我国相关的限量标准已经过多次修订(20 μ g/kg)，但是相对于国际上所制定的限量标准(WH0/FA0规定为15 μ g/kg, EU规定为2 μ g/kg)，仍然明显偏高，因此亟需研究AFB1衍生试剂以提高检测灵敏度。目前常用强氧化剂三氟乙酸和卤族元素及衍生物等，但存在需加热、稳定性差、试剂有腐蚀性，保存寿命短等不足，研究安全而稳定的新型荧光增强剂，提高光学系统灵敏度成为研究黄曲霉毒素检测技术的重要发展方向。β -⑶是超分子化学最重要的主体，利用β -⑶及其衍生物和多类客体分子形成超分子体系过程荧光强度发生变化的特性，将其作为荧光增敏试剂的研究和应用越来越多，但β-CD是否适用于作黄曲霉毒素B1的荧光增敏剂还有待提高。另外，在食品安全高灵敏度检测技术的开发领域，缺乏利用β "CDs三元络合反应进行荧光增强作用的探索与研究。

发明内容
本发明的目的之一在于提供一种荧光增敏剂，该荧光增敏剂可以显著提高黄曲霉毒素B1荧光检测时的强度。为实现上述目的，本发明的技术方案为
黄曲霉毒素B1的荧光增敏剂，所述黄曲霉毒素B1的荧光增敏剂由所述环糊精或/ 和β -环糊精衍生物与含有Hg2+的溶液组成，所述β -环糊精或/和β -环糊精衍生物与 Hg2+摩尔比为1-10:1。进一步，所述β-环糊精与含有Hg2+的溶液的摩尔浓度均为O.Olmol/L，所述 β-环糊精与含有Hg2+的溶液的体积比为4:1。进一步，所述β-环糊精衍生物为β-环糊精、2，4_ 二甲基-β-环糊精、羟丙基- β -环糊精、羟乙基- β -环糊精和甲基- β -环糊精中的一种或多种混合。本发明的目的之二在于提供一种黄曲霉毒素B1三元络合物，该三元络合物对荧光的吸收量与黄曲霉毒素B1 二元络合物相比，显著提高。为实现上述目的，本发明的技术方案
含有所述的黄曲霉毒素B1的荧光增敏剂的黄曲霉毒素B1待测溶液。
进一步，所述黄曲霉毒素B1待测溶液为含有黄曲霉毒素B1的荧光增敏剂的甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇的体积百分数为20-70%。进一步，所述甲醇水溶液中甲醇的体积百分数为50%。进一步，所述β-环糊精或/和β-环糊精衍生物与黄曲霉毒素&的摩尔比为大于或等于300 :1，所述Hg2+与黄曲霉毒素B1的摩尔比为大于或等于300 :1。本发明的目的之三在于提供一种检测所述黄曲霉毒素B1待测溶液含量的方法，该方法灵敏度高。为实现上述目的，本发明的技术方案为
检测所述的黄曲霉毒素B1待测溶液含量的方法，将所述黄曲霉毒素B1待测溶液在最大激发波长为360-370nm，最大发射波长为432-445nm的条件下测量荧光强度，并计算黄曲霉
毒素B1的含量。进一步，所述黄曲霉毒素B1待测溶液的配制为在黄曲霉毒素B1的甲醇水溶液中依次加入配方量的含有Hg2+的溶液、β-环糊精或/和β-环糊精衍生物溶液，混合均勻， 得黄曲霉素B1待测溶液。本发明的有益效果在于黄曲霉毒素&的荧光增敏剂的荧光强度显著增强，当溶剂中甲醇比例为50%，Hg2+、β -⑶与AFB1反应摩尔比均大于300 1时，荧光增强倍数最大， 可达到15倍，显著高于国标及报道中的各种衍生试剂。将黄曲霉毒素B1的荧光增敏剂作为新型荧光增强剂，替代国标中传统衍生试剂，提高检测灵敏度，建立了高灵敏度、快速测定AFB1W荧光分析法。AFB1浓度在0. 1-40 μ g/L范围内与体系荧光强度呈线性关系，相关系数R为0. 9998，检出限为0. 08 μ g/L,回收率为90%_100% ；与国标方法及速测方法比对分析，检测准确度均无显著性差异。
具体实施例方式本发明中涉及的主要仪器和试剂如下
日立F-2500荧光分光光度仪；岛津UV-2450紫外分光光度计；NYART-I型AFB1定量荧光速测仪(华夏科创有限公司)；分析天平；纯水发生器。AFB1 (IO6Pg/!甲醇溶液，美国SIGMA公司)甲醇(色谱纯，天津四友)；β-环糊精(β-⑶)、2，4_ 二甲基-β-环糊精(DM-β-⑶)、羟丙基-β-环糊精(ΗΡ-β-⑶)、羟乙基-β -环糊精(HE- β -⑶)、甲基-β -环糊精(M- β -⑶)、葡萄糖基-β -环糊精(分析纯，山东新大精细化工有限公司)水溶液；HgCl2 (分析纯，贵州铜仁汞试剂公司)水溶液。
实施例1 β -环糊精和Hg2+摩尔比的影响一试剂的配制
12组试剂的配制步骤为首先1-6组中的每组中均加入ImL lOPg/L AFB1甲醇溶液， 200μ 0. 01mol/L HgCl2,混勻；然后 1-6 组中分别加入 0、40、100、200、300、400μ 0. Olmol/ L β -CDs，混勻后得含有所述的黄曲霉毒素B1的荧光增敏剂的黄曲霉素B1待测溶液。同时在7-12组的每组中均加入ImL 10μ§/1 AFB1甲醇溶液，再在7_12组中分别加入 0、40、80、120、160、200μ 0. 01mol/L HgCl2,混勻后，均加入 800μ 0. 01mol/L β -CDs，混勻后得含有所述的黄曲霉毒素B1的荧光增敏剂的黄曲霉毒素B1待测溶液。12组试剂中AFB1 终浓度为5Pg/L。所述甲醇溶液中甲醇的体积百分含量为50%。二检测方法
分别取待测溶液1-12号各lmL，用1. Ocm荧光用石英比色杯放置在荧光分光光度计中进行荧光激发、发射光谱的扫描，仪器狭缝均置为5nm。另外，取5Pg/L AFB1标准品溶液作为空白对照，用1.0cm荧光用石英比色杯，在最大激发波长365nm，最大发射波长440nm处测量荧光强度，狭缝均置为5nm。对400 μ g/L AFB1进行光谱扫描，确定AFB1最大激发波长(EX)365nm，最大发射波长(EM)432nm。对AFB1-HgCl2- β -OTs体系进行光谱扫描，确定研究AFB1荧光增强作用的荧光体系最大激发波长(EX) 365nm，最大发射波长(EM) 440nm。三结果
1-12 组荧光强度读数依次分别为:24. 7,290. 3,310. 9,337. 5,339. 1,338. 2,24. 7、 137. 4,294. 1,341. 1,340. 5,342. 3。根据实验结果，HgCl2、β-⑶与AFBl摩尔比在100:1 500:1范围内时，均能达到一定程度的荧光增强。当HgC12、β-⑶与AFBl摩尔比均大于300 :1时，反应完全且浓度升高对反应没有影响。当HgC12、i3-⑶均过量时，β-⑶与HgC12摩尔比在1_3:1范围内， 摩尔比增大有利于荧光增强，3-10 1时荧光值稳定且达到最大。推测原因为包合反应是可逆反应，体系中β-CD浓度高有利于化学反应快速完全。通过计算5 μ g/L AFBl至少需要 0. OlmoVLHgCl2I μ L,0. 01mol/L β-CD溶液4yL。由于AFB1污染具有不均勻性，有高浓度含量样品检测，因此要确保荧光增强剂过量，使测定准确快速稳定。
实施例2甲醇含量的影响一试剂的配制
试剂共配制6组，配制步骤为首先1-6组中的每组中均加入400μ 浓度为5(^g/L AfB1JOOPLO. 01mol/L HgCl2,混勻后加入 400μ 0. 01mol/L β -CDs，再依次加入 0、200、400、 600、800、1000μ 甲醇，混勻后混勻后得含有所述的黄曲霉毒素B1的荧光增敏剂的黄曲霉毒素B1待测溶液。二检测方法
检测方法同实施例1中的“检测方法”。三结果
1-6 组荧光强度读数依次分别为:622. 3,703. 7,735. 7,753. 1,739. 1、628。在分析过程中，选择适当的甲醇/水比例，能够更好的达到荧光增强的效果(AFB1 易溶于有机溶剂，在水中溶解度极低，在水相中易发生荧光淬灭作用；β "CD溶于水且能增加AFB1在水相中的溶解度)。根据实验结果，甲醇比例在20% 70%范围内时，均有一定程度的荧光增强。当甲醇比例为50%时，反应时间短，反应稳定，荧光增强值高，因此选择50% 作为最佳反应比例。并在甲醇比例50%条件下，对反应时间进行考察，混勻后即可测定，30d 内保持稳定，表明形成了稳定的三元络合物。
实施例3 β环糊精衍生物的影响一试剂的配制
在 ImL 10 μ g/L AFB1 中加入 200 μ L HgCl2,混勻后依次加入 0、20、50、100、150、 200μ β-环糊精混勻。检测方法同实施例1的检测方法，荧光强度读数依次分别为 39.98,290.3,328.9,335. 7,340,340. 8。在ImL 10 μ g/L AFB1 中加入 200 μ L HgCl2,混勻后依次加入 0、20、50、100、150、200 μ L葡萄糖基-β -环糊精混勻。检测方法同实施例1的检测方法，荧光强度读数依次分别为39. 98、169、178、182. 3,186. 1、187。在ImL 10 μ g/L AFB1 中加入 200 μ L HgCl2,混勻后依次加入 0、20、50、100、150、 200 μ L2，4- 二甲基-β -环糊精混勻。检测方法同实施例1的检测方法，荧光强度读数依次分别为39. 98,300,308. 9、313、320、324。在ImL 10 μ g/L AFB1 中加入 200 μ L HgCl2,混勻后依次加入 0、20、50、100、150、 200 μ L羟丙基-β -环糊精混勻。检测方法同实施例1的检测方法，荧光强度读数依次分别为39.98、289、300、308、312、313。在ImL 10 μ g/L AFB1 中加入 200 μ L HgCl2,混勻后依次加入 0、20、50、100、150、 200 μ L羟乙基-β -环糊精混勻。检测方法同实施例1的检测方法，荧光强度读数依次分别为39. 98,292. 3,318.9,330.7,331,332.1。在ImL 10 μ g/L AFB1 中加入 200 μ L HgCl2,混勻后依次加入 0、20、50、100、150、 200yL甲基-β-环糊精混勻。检测方法同实施例1的检测方法，荧光强度读数依次分别为39. 98,288,310. 2,321,330. 3、335。在ImL 10 μ g/L AFB1 中依次加入 0、20、40、60、80、100 μ L HgCl2,混勻后加入 800 μ L葡萄糖基-β -环糊精混勻。检测方法同实施例1的检测方法，荧光强度读数依次分别为39. 98,100. 1、150、166、170、187。在ImL 10 μ g/L AFB1 中依次加入 0、20、40、60、80、100 μ L HgCl2,混勻后加入 800 μ L2，4- 二甲基-β -环糊精混勻。检测方法同实施例1的检测方法，荧光强度读数依次分别为:39. 98,151,274. 1,311. 1,324. 5、324。在ImL 10 μ g/L AFB1 中依次加入 0、20、40、60、80、100 μ L HgCl2,混勻后加入 800 μ L羟丙基-β -环糊精混勻。检测方法同实施例1的检测方法，荧光强度读数依次分别为39. 98,151,274. 1,311. 1,324. 5、324。在ImL 10 μ g/L AFB1 中依次加入 0、20、40、60、80、100 μ L HgCl2,混勻后加入 800 μ L轻乙基-β -环糊精混勻。检测方法同实施例1的检测方法，荧光强度读数依次分别为39. 98、137、262、321、330、332.1。在ImL 10 μ g/L AFB1 中依次加入 0、20、40、60、80、100 μ L HgCl2,混勻后加入 SOOyL甲基-β-环糊精混勻。检测方法同实施例1的检测方法，荧光强度读数依次分别为39. 98,147. 4,274. 1,311. 1,330.5、335。实验结果显示随着β -⑶s和Hg浓度的变化，不同β -⑶S- HgCljfAFBd^有荧光增强作用，表明β-环糊精、葡萄糖基-β-环糊精、2，4_二甲基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、羟乙基- β -环糊精和甲基- β -环糊精一种或多种均可以作为AFB1的荧光增强剂。 其中葡萄糖基-β -CD荧光增强幅度相对较小，分析原因可能是其余四种衍生物均属于环糊精醚衍生物，仅葡萄糖基-β "CD属于单支链环糊精，取代基分子较大，对客体分子进入空腔造成了一定程度的阻碍。除葡萄糖基-⑶外，β -⑶与其余四种衍生物的增强后荧光值均无显著性差异(P >0.05)，且⑶成本较其衍生物更为低廉，约为其它⑶s价格的1/10，更符合做新型荧光增强剂的条件。
实施例4四种体系一试剂的配制
β-CD-Hg2+甲醇/水溶液体系在ImL甲醇中，加入0. OlmoVLHgCl2溶液200 μ L，再加 Λ 0. 01mol/L β -CD 溶液 800 μ L,混勻。AFB1 - HgCl2-β -CD 体系在 ImL 40 μ g/L AFB1 甲醇溶液中，加入0. 01mol/LHgCl2 溶液200yL，再加入0. 01mol/L β-CD溶液800 μ L，混勻。AFB1- β -CD 体系在 20 μ L 1000 μ g/L AFB1 甲醇溶液中，加入 0. 01mol/L β -CD 溶液980 μ L，混勻。AFB1- Hg2+ 体系在 ImL 40 μ g/L AFB1 甲醇溶液中，加入 0. 01mol/LHgCl2 溶液 200 μ L，超纯水 800 μ L。四种体系中AFB1浓度均为20 μ g/L。二检测方法
检测方法同实施例1的检测方法。三结果
在EX 432nm, EM 440nm处，β _⑶-Hg2+甲醇/水溶液体系的荧光强度读数为10. 3， AFB1 - HgCl2-P -⑶体系的荧光强度读数为2四0. 0，AFB1-^-OT体系的荧光强度读数为 890. 1，AFB1- Hg2+体系的荧光强度读数为552. 9。将各体系荧光光谱特性进行比较，β -⑶-Hg2+甲醇/水溶液在365/432nm处无荧光产生。AFB1-HgCl2-^-QKAFB1-P-OKAFB1- Hg2+反应体系的EX基本没有发生移动，说明基态分子结构均没有发生变化。AFB1-HgCl2-β-OTJFB1- Hg2+体系的EM发生了相同的变化(432nm到440nm)，说明々 81与Hg2+很大可能发生了配位反应，形成的AFB1- Hg2+螯合物作为客体分子被包合在β-CD空腔内。同时，三元络合物的增强程度很大，没有其他峰干扰，可以有效提高检测的灵敏度和选择性。分析反应前后体系荧光强度增加的可能原因为(1) β-CD空腔为AFB1的生色团提供了一个非极性环境，使其处于去水化状态，对增进量子效应从而为增强荧光强度提供了有利的条件；(2)当AFB1包合进β -CD分子的空腔后，β -CD腔的构造保护了 AFB1的荧光单级态分子免于从外部淬灭；(3)由于增加了疏水性 AFB1在水中的溶解度，而增加了荧光强度。将各体系紫外吸收光谱进行比较，根据紫外吸收光谱图，在AFB1中加入Hg2+后， 最大吸收波长发生了明显的蓝移(364 — 374nm)，表明AFB1和Hg2+之间存在着某种相互作用，该作用可能与AFBJPHg2+形成金属螯合物有关。在AFB1- Hg2+中加入⑶后，最大吸收波长未发生变化(仍为374nm)，但吸光度增加，从中可以推测，AFB1-Hg2+螯合物作为客体分子进入β -CD空腔内，形成了稳定的复合体，AFB1的共轭程度增加，从而增强荧光强度。实施例5黄曲霉素B1待测溶液的配制一试剂的配制
方法1:在ImL 20 μ g/L AFB1甲醇溶液中先加入0. 01mol/LHgCl2溶液200 μ L，再 0. 01mol/L β -CD溶液800 μ L，得待测溶液。方法2 在ImL 20 μ g/L AFB1甲醇溶液中先加入0. 01mol/L β -CD溶液800 μ L，再加入0. OlmoVLHgCl2溶液200 μ L，待测溶液。二检测方法
检测方法同实施例1。
三结果
将方法1和方法2所得待测溶液分别测定体系的荧光强度，其分别为1091和998。结果表明两种衍生方法都有荧光增强作用，按照方法1进行配制能够达到更好的荧光增敏效果。若按照方法2进行配制，β -CD空腔的构造保护了 AFB1的荧光单级态分子免于从外部淬灭，从而不能与HgCl2完全螯合，未螯合的AFB1仅能形成AFB1- β -⑶二元包合物或形成部分AFB1- β -⑶-Hg三元包合物，因此不能达到最大荧光增强效果。实施例6荧光增强效果比较一检测体系
实验重点对国标及报道中的不同实验试剂体系的荧光增敏作用进行了比较。实验试剂体系分别为=DBr2体系:lmL40yg/L AFB1甲醇溶液中加入ImLO. 00 溴溶液；2) HgCl2 体系lmL40yg/L AFB1甲醇溶液中加入900 μ L超纯水，IOOyL HgCl2 ;3) β-CD体系 lmL40 μ g/L AFB1甲醇溶液挥干后加入40 μ L甲醇，1000 μ L 0. 01mol/L β -CD水溶液， 96(^1^纯水；4)取(12-3-0)体系11^4(^8/1 AFB1 甲醇溶液中加入 200yL HgCl2,混勻后加入800 μ L β -⑶。上述实验试剂体系中AFB1浓度均为20 μ g/L。二检测方法
方法1 同实施例1的检测方法。方法2 参照《MA Liang(马良).Beijing(北京)Chinese Academy of Agricultural Sciences (中国农业科学院)，Doctoral Dissertation (博士论文)，2007》 一文中AFB1-IAC速测方法。三结果
增强倍数=增强后的荧光值/ AFB1本底荧光值一 1，如表1。方法1和方法2的研究结果一致HgC12-i3 -⑶体系对AFB1荧光增强15倍，远远优于其他衍生试剂。实施例7黄曲霉毒素B1的荧光增敏剂灵敏度和回收率的检测一试剂的配制
1 AFB1 - HgCl2- β -⑶标准溶液的配制
移取 0、40、80、160、M0、320、400、600、800 PL 浓度为 5Pg/L 的 AFB1 甲醇溶液，浓度 200、400、600、800浓度为μ 50μδ/ 的AFB1甲醇溶液于13只试管中，依次加入1000,960, 920、840、760、680、600、400、200、800、600、400、200μ 甲醇后，于每只试管中加入 200μ 0. OlmoVLHgCl2,800μ 0. 01mol/Lβ-CD (即最终溶剂中甲醇比例为50%)，充分振荡，配制成 0,0. 1,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8、1、1· 5、2、5、10、15、20“g/L AFB1 溶液。2 AFB1标准溶液的配制
移取 0、40、80、160、240、320、400、600、800 μ 浓度为 5“g/L 的 AFB1 甲醇溶液，浓度 200、 400,600,800浓度为的AFB1甲醇溶液于13只试管中，添加甲醇均至2mL，配制成含有浓度相同但未使用黄曲霉毒素B1的荧光增敏剂的AFB1甲醇溶液为对照。3回收率试剂
分别在25g AFB1阴性玉米、花生油中分别添加25 μ L 10000 μ g/L AFB1甲醇溶液(即 AFB1含量为10 μ g/kg)，进行回收试验(回收率=加标试样测定值/加标量X 100%)，平行测
定三次。二检测方法
提取、净化参照GB/T 18979-2003。在净化后的甲醇洗脱液中加入200μ HgCl2,混勻后加入800μ 浓度为0. 01mol/L的β -⑶溶液，混勻，于荧光光度计中读取荧光值，带入标准曲线计算其浓度。提取、净化参照GB/T 18979-2003。在净化后的甲醇洗脱液中加入ImLO. 00 溴溶液，混勻，于荧光光度计中读取荧光值，计算其浓度。三结果
权利要求
1.黄曲霉毒素B1的荧光增敏剂，其特征在于，所述黄曲霉毒素B1的荧光增敏剂由所述 β -环糊精或/和β -环糊精衍生物与含有Hg2+的溶液组成，所述β -环糊精或/和β -环糊精衍生物与Hg2+摩尔比为1-10 :1。
2.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1的荧光增敏剂，其特征在于，所述β-环糊精与含有Hg2+的溶液的摩尔浓度均为O.Olmol/L，所述β _环糊精与含有Hg2+的溶液的体积比为4:1。
3.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1的荧光增敏剂，其特征在于，所述β-环糊精衍生物为β -环糊精、2，4- 二甲基-β -环糊精、羟丙基-β -环糊精、羟乙基-β -环糊精和甲基- β -环糊精中的一种或多种混合。
4.含有权利要求1所述的黄曲霉毒素B1的荧光增敏剂的黄曲霉素B1待测溶液。
5.根据权利要求4所述的黄曲霉毒素B1待测溶液，其特征在于，所述黄曲霉毒素B1待测溶液为含有黄曲霉毒素B1的荧光增敏剂的甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇的体积百分数为20-70%。
6.根据权利要求5所述的黄曲霉毒素B1待测溶液，其特征在于，所述甲醇水溶液中甲醇的体积百分数为50%。
7.根据权利要求4所述的黄曲霉毒素B1待测溶液，其特征在于，所述环糊精或/ 和β-环糊精衍生物与黄曲霉毒素B1的摩尔比为大于或等于300 :1，所述含有Hg2+的溶液中Hg2+与黄曲霉毒素B1的摩尔比为大于或等于300 :1。
8.检测权利要求4所述的黄曲霉毒素B1待测溶液含量的方法，其特征在于将所述黄曲霉毒素B1待测溶液在最大激发波长为360 370nm，最大发射波长为432 445nm的条件下测量荧光强度，并计算黄曲霉毒素A的含量。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述黄曲霉毒素B1待测溶液的配制为在黄曲霉毒素B1的甲醇水溶液中依次加入配方量的含有Hg2+的溶液、β-环糊精或/和β-环糊精衍生物溶液，混合均勻，得黄曲霉毒素B1待测溶液。
全文摘要
本发明涉及化学领域的含量分析领域，特别涉及黄曲霉毒素B1的荧光检测，具体为黄曲霉毒素B1的荧光增敏剂，由所述β-环糊精或/和β-环糊精衍生物与含有Hg2+的溶液组成，所述β-环糊精与Hg2+摩尔比为1～101；将待测溶液在最大激发波长为360-370nm、最大发射波长为432～445nm的条件下测量荧光强度，并计算黄曲霉毒素B1的含量；黄曲霉毒素B1的荧光增敏剂的荧光强度最大可达到15倍，灵敏度高，AFB1浓度在0.1-40μg/L范围内与体系荧光强度呈线性关系，相关系数R为0.9998，检出限为0.08μg/L，回收率为90%-100%；与国标方法及速测方法比对分析，检测准确度均无显著性差异。
文档编号G01N21/64GK102331414SQ201110250548
公开日2012年1月25日 申请日期2011年8月29日 优先权日2011年8月29日
发明者张宇昊, 张敏, 马良 申请人:西南大学