专利名称：肌钙蛋白Ⅰ血清快速检测试剂盒(胶体金法)的制作方法
肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)技术领域
本发明提供了一种快速检测心肌梗死病症的快速检测的肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)。
背景技术：
心肌缺血性损伤，特别是急性心肌梗塞(AMI)是威胁人类生命的主要疾病之一， 临床化学家和临床科学家一直努力寻找和探索特异性好、灵敏度高的血清指标，心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I, cTnl)具有高度的心肌特异性，当心肌细胞受损时,血液中的 cTnl出现时间早，持续时间长，与心肌损伤程度及预后密切相关，因此，它可作为心肌损伤的一种特异性指标。发明内容
本发明提供了一种用于快速检测心肌梗死病症的肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)，具有快速检测试，性能极其稳定，用户使用方便、能准确快速检测的功能。
本发明是通过如下技术方案实现的
肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)，其原理为心肌钙蛋白I(cTnl)的分子量为22. 5KD，其连同肌钙蛋白T和肌钙蛋白C构成结构复合物，在心脏中的细胞间钙信号肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的转化过程中起着重要作用，人体中的cTnl与骨骼肌中的形式在结构上有所不同，它的氨基端上多了一个氨基酸残基，使得cTnl成为一个特异性的标志物，在心肌梗死(AMI)发生后，cTnl便迅速释放入血液循环中，本发明采用双抗夹心免疫法，当标本加入样品槽后，通过结合垫和金抗体结合，复合物沿膜流动和抗体在检测区域反应，如果标本中存在有可检出浓度或更浓的标志物，就会在检测区出现一条色带，如果没有就会保持无色，标本继续移动至控制区域，出现粉红-玫瑰红的色带，说明试验正常结果有效。
本发明同时公开了肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)的制备及检测方法，其流程为
—、cTnl标记用单克隆抗体的预处理
1.1透析，纯化水，24小时；
1.2离心去上清，4 10°C，10000转/分钟、5分钟；
I. 3 BCA法则浓度(物料平衡)；
I. 4 PH 的调节，0. lmol/LK2C03 量的确定；
I. 5最佳标记量的确定；
1.6分装(5000人份量/支)、-20度冻存；
二、试剂的配制
2.1 1%的柠檬酸三钠的配制；
2.2 1%的氯金酸的配制；
2.3 0.01%的氯金酸的配制；2. 4 0. lml/L K2C03 的配制；2.5 10%的氯化钠的配制；2.6 的叠氮钠的配制；2.7 10% 的 BSA 的配制;2. 8 lmol/1 PBS 的配制；2. 9 0. 05mol/l PBS 的配制；2. 10胶体金复溶液的的配制；三、胶体金的制备3. 1 量取 0. 01 % 的 HAuCL4 溶液；3.2 加热至沸腾，迅速加入柠檬酸三钠溶液，搅拌均勻，IOOml 0.01%的 HAuCL4溶液加1. 6ml 柠檬酸三钠溶液；3. 3继续加热10分钟，然后冷却至室温，用超纯水恢复至原体积；3.4 0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌；3.5送检、装瓶、贴标签；四、cTnl免疫金的制备和干燥4. 1 cTnl标记抗体的稀释，按照每生产5000人份4mm宽的cTnl试纸条需1支 cTnl标记抗体计算，领取相应量的抗体，用0. 05mol/l PBS稀释到0. 5mg/ml ；4.2生产前小试a取Iml胶体金；b 调 PH 值，0. lmol/L K2C03 的量，混勻 5min ；c根据生产指令加入CTnIAbl，混勻IOmin ；d 加入 IOOul 10% BSA，混勻 IOmin ；e 离心 1000 转 /min，30min,要求环境温度 4_10°C ；f 30%复溶，浸泡聚酯膜 O.anl/条，0.6cmX30cm;g温度20_30°C，相对湿度30-35%干燥5小时；h送质检部检验；4. 3 cTnl 抗体标记1)标记小试质检质检合格，取胶体金，电磁搅拌，以生产1000人份5mm宽的肌钙蛋 白I胶体金试纸条约需50ml胶体金来计算；2)调 PH 值，0. lmol/L K2C03 的量，混勻 5min ；3)根据最适标记量加入CTnIAbl，混勻IOmin ；4)加入 IOOul 10% BSA，混勻 IOmin ；5)离心 1000 转 /min，30min, 4_10°C ；6) 30%复溶，浸泡聚酯膜 25. 3ml/ 张，20cmX30cm ；7)温度20_30°C，相对湿度30-35%干燥5小时；8)抽一条0. 6cm宽送质检部做膜金匹配检测；9)cTnI免疫金送中间品室暂存；五、cTnl包被板的制备
5. I包被抗体的稀释,羊抗鼠IgO. 05mol/LPBS稀释到I. 2mg/ml工作浓度,cTnl捕获抗体用0. 05mol/LPBS稀释到I. lmg/ml工作浓度；
5. 2包被前小试
I)各取20ul试包被I条20cm长的膜，线浓度I. Oul/cm ；
2)2°C-8°C 过夜；
3)贴膜；
4)温度20-30°C、相对湿度30_35*%干燥5小时,最后送质检部检验质检合格；
5. 3包被生产
I) cTnl包被小试质检合格单；
2)羊抗鼠IgG、cTnl捕获抗体工作浓度包被质控线和检测线，线浓度I. Oul/cm ；
3)2°C-8°C 过夜；
4)贴膜；
5)温度20_30°C、相对湿度30-35%，干燥5小时；
6)抽I板送质检部作膜金匹配；
7)密封后送中间品库暂存。
本发明的检测流程为采用以上技术方案制作标本，加入样品槽后，通过结合垫和金抗体结合，复合物沿膜流动和抗体在检测区域反应，其分为以下三种情况
(一)、阳性15分钟后出现两条色带，说明结果阳性试验有效，只要在检测区域出现有色带即可以读取结果，很低浓度的cTnl会在长于15分钟的时候出现两条带；
( 二)、阴性如果在检测区域没有条带而控制区域有条带，说明结果阴性而试验有效；
(三)、无效试验如果在控制区域没有任何条带，说明试验无效，标本应选用另一个新的卡片重新测试。
由于采用了以上技术方案，本发明具有的有益效果为肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒，性能极其稳定，用户使用极其方便、能准确快速检测。
图I、为本发明的制备的工艺流程图。
其中《 ☆”为必须在净化车间内操作；
“令”为必须在温度20_3(TC、湿度30_35%操作，
另外cTnl包被板的制备以及cTnl免疫金的制备的干燥过程也必须在温度 20-30°C、湿度 30-35%进行；
为关键控制点。
具体实施方式
肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)，其原理为心肌钙蛋白I(cTnl)的分子量为22. 5KD，其连同肌钙蛋白T和肌钙蛋白C构成结构复合物，在心脏中的细胞间钙信号肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的转化过程中起着重要作用，人的cTnl与骨骼肌中的形7有所不同，它的氨基端上多了一个氨基酸残基，使得cTnl成为一个特异性的标志物，在心肌梗死(AMI)发生后，cTnl便迅速释放入血液循环中。
本发明同时公开了肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)的制备及检测方法，其流程为
—、cTnl标记用单克隆抗体的预处理
1.1透析，纯化水，24小时；
1.2离心去上清，4 10°C，10000转/分钟、5分钟；
I. 3 BCA法则浓度(物料平衡)；
I. 4 PH 的调节，0. lmol/LK2C03 量的确定；
I. 5最佳标记量的确定；
1.6分装(5000人份量/支)、-20度冻存；
二、试剂的配制
2. II %的柠檬酸三钠的配制
2. 2I %的氯金酸的配制；
2. 30.01%的氯金酸的配制;
2. 40. lml/L K2C03 的配制；
2. 510%的氯化钠的配制；
2. 6I %的叠氮钠的配制；
2. 710%的BSA的配制；
2. 8Imo 1/1 PBS 的配制；
2. 90. 05mol/l PBS 的配制；
2. 10胶体金复溶液的的配制
三、胶体金的制备
3. I 量取 0. 01 % 的 HAuCL4 溶液；
3.2 加热至沸腾，迅速加入I %柠檬酸三钠溶液，搅拌均匀，IOOml 0.01%的 HAuCL4溶液加I. 6mll%柠檬酸三钠溶液；
3. 3继续加热10分钟，然后冷却至室温，用超纯水恢复至原体积；
3.4 0. 22iim微孔滤膜过滤除菌；
3.5送检、装瓶、贴标签；
四、cTnl免疫金的制备和干燥
4. IcTnI标记抗体的稀释,按照每生产5000人份4mm宽的cTnl试纸条需I支cTnl 标记抗体计算，领取相应量的抗体，用0. 05mol/l PBS稀释到0. 5mg/ml ；0105]4.2生产前小试0106]a取Iml胶体金；0107]b调 PH 值，0. lmol/L K2C03 的量，混匀 5min ；0108]C根据生产指令加入CTnIAbl，混匀IOmin ；0109]d加入 IOOul 10% BSA，混勻 IOmin ；0110]e离心1000转/min, 30min,要求环境温度4-10°C0111]f30%复溶,浸泡聚酯膜0. 8ml/条,0. 6cmX 30cm
g温度20-30°C，相对湿度30-35%干燥5小时；
h送质检部检验；
4. 3 cTnl抗体标记
I)标记小试质检质检合格，取胶体金，电磁搅拌，以生产1000人份5mm宽的肌I丐蛋白I胶体金试纸条约需50ml胶体金来计算；
2)调 PH 值，0. lmol/L K2C03 的量，混匀 5min ；
3)根据最适标记量加入CTnlAbl，混匀IOmin ；
4)加入 IOOul 10% BSA，混勻 IOmin ；
5)离心 1000 转/min, 30min, 4_10°C ；
6) 30%复溶，浸泡聚酯膜25. 3ml/张，20cmX30cm ；
7)温度20-30°C，相对湿度30-35%干燥5小时；
8)抽一条0. 6cm宽送质检部做膜金匹配检测；
9) cTnl免疫金送中间品室暂存；
五、cTn I包被板的制备
5. I包被抗体的稀释，羊抗鼠IgO. 05mol/LPBS稀释到I. 2mg/ml工作浓度，cTnl捕获抗体用0. 05mol/LPBS稀释到I. lmg/ml工作浓度；
5. 2包被前小试
I)各取20ul试包被I条20cm长的膜，线浓度I. Oul/cm ；
2) 2°C _8°C过夜；
3)贴膜；
4)温度20-30°C、相对湿度30-35%干燥5小时,最后送质检部检验质检合格；
5. 3包被生产
I) cTnl包被小试质检合格单；
2)羊抗鼠IgG、cTnl捕获抗体工作浓度包被质控线和检测线，线浓度I. Oul/cm ；
3) 2°C _8°C过夜；
4)贴膜；
5)温度20-30°C、相对湿度30-35%，干燥5小时；
6)抽I板送质检部作膜金匹配；
7)密封后送中间品库暂存。
本发明的检测流程为采用以上技术方案制作的标本，加入样品槽后，通过结合垫和金抗体结合，复合物沿膜流动和抗体在检测区域反应，其分为以下三种情况
(一)、阳性15分钟后出现两条色带，说明结果阳性试验有效，只要在检测区域出现有色带即可以读取结果，很低浓度的cTnl会在长于15分钟的时候出现两条带。
有效。(二)、阴性如果在检测区域没有条带而控制区域有条带，说明结果阴性而试验
(三)、无效试验如果在控制区域没有任何条带，说明试验无效，标本应选用另一个新的卡片重新测试。
心肌钙蛋白I(cTnl)的分子量为22. 5KD，其连同肌钙蛋白T和肌钙蛋白C构成结构复合物，在心脏中的细胞间钙信号肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的转化过程中起着重要作用，人的cTnl与骨骼肌中的形式在结构上有所不同，它的氨基端上多了一个氨基酸残基，使得cTnl成为一个特异性的标志物，在心肌梗死(AMI)发生后，cTnl便迅速释放入血液循环中，释放的模式和CK-MB相同(在AMI发生4-6个小时以后)，然而，CK-MB的水平在 36-48小时后恢复正常，cTnl可以持续升高6_10天，在正常健康人体内，cTnl水平是非常低的，在骨骼肌受损的病人体内也检测不到cTnl，因此cTnl是诊断心肌梗死的一个特异性指标。
产品名称肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)
规格25人份/盒
适用范围
本试剂盒是免疫层析基础上的一步法体外诊断试剂盒，用来对发生心肌梗死时人血清中的心肌钙蛋白I进行定性检测。
检测原理胶体金法
采用双抗体夹心法，以胶体金作为指示标记，交联抗肌钙蛋白I抗体，另一抗体为捕获抗体，与血液中的肌钙蛋白I结合并显色，测试时，样本向检测区及质控区移动，如果样品中含有肌钙蛋白I，它就会和试剂中的金标抗体组成抗原抗体复合物，再和检测区中的相对应的捕获抗体形成紫红色的色带，如果样品中肌钙蛋白I水平低于最低检测限，检测区中就不会有色带出现，在任何情况下，质控区色带都应出现，质控区色带的出现表明反应系统有效。
主要组成成分
测试卡片和一份干燥剂、一个滴管一起装于铝箔袋中，每个试剂盒有25个相同的铝箔袋。
自备材料
血清收集设备
2、计时装置
样本要求
必须在标准实验室环境下采集血清标本。
2、标本采集后最好马上就做检测。如不能在24小时内检测，血清标本应冷冻起来，在试验以前使标本回复到室温。
3、可以加0. I %的叠氮钠作为防腐剂，不会影响试验结果。
质控方法
控制线是内对照试剂和步骤控制，只要正确操作试剂有效控制线总会出现。
2、建议每次都使用对照品以确保试剂盒的有效性，本试剂盒内没有提供对照品， 可外购。
操作步骤
使用前，将所有的试剂成分和病人样本置于室温。
把测试卡片从铝箔袋中取出。
用微量移液器吸取150 ii I样本。
移液器垂直，加标本2-3滴(100-150 ii I)至样品槽中。
5、15分钟读取显示结果。
广品性能指标
本试剂盒在cTnl彡I. 5ng/ml时出现阳性结果。
注意事项
I.处理样品时，请戴一次性手套。
2.测试时，测试卡应水平放置，不要倾斜。
3.加样15分钟后显示的结果无诊断意义。
4.测试结束，请彻底清洗双手剩余标本和废弃物应用I : 25稀释的84消毒液浸泡30分钟以上才能丢弃。
5. 一个吸管只能吸取一个样品，以免交叉污染。
6.若用微量滴管头滴加样本，应迅速一次性加入到样品槽中，避免断续加入。
7.本试剂结果仅供定性的辅助诊断，对实验结果解释需与临床症状相结合。
贮存2-8°C保存。
有效期12个月。
医疗器械注册证书编号
产品标准编号Q/YZ021-2006。
最后应说明的是以上说明书仅用以说明本发明的技术方案和使用特征，尽管本说明书参照上述的实施例对本发明已进行了详细的说明，但是，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求
权利要求
1.肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)，其原理为心肌钙蛋白I(cTnl)的分子量为22. 5KD，其连同肌钙蛋白T和肌钙蛋白C构成结构复合物，在心脏中的细胞间钙信号肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的转化过程中起着重要作用，人体中的cTnl与骨骼肌中的形式在结构上有所不同，它的氨基端上多了一个氨基酸残基，使得cTnl成为一个特异性的标志物，在心肌梗死(AMI)发生后，cTnl便迅速释放入血液循环中，其特征在于采用双抗夹心免疫法，当标本加入样品槽后，通过结合垫和金抗体结合，复合物沿膜流动和抗体在检测区域反应，如果标本中存在有可检出浓度或更浓的标志物，就会在检测区出现一条色带，如果没有就会保持无色，标本继续移动至控制区域，出现粉红-玫瑰红的色带，说明试验正常结果有效。
2.根据权利要求I所属的肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)，其制备及检测方法，其流程为一、cTnl标记用单克隆抗体的预处理`1.1透析，纯化水，24小时；`I. 2离心去上清，4 10。。，10000转/分钟、5分钟；`I. 3 BCA法则浓度(物料平衡);`I. 4 PH的调节，0. lmol/LK2C03量的确定；`1.5最佳标记量的确定；`1.6分装(5000人份量/支)、-20度冻存；二、试剂的配制`2.I I %的柠檬酸三钠的配制；`2.2I %的氯金酸的配制；`2.30.01%的氯金酸的配制；`2. 4 0. lml/L K2C03 的配制；`2.510%的氯化钠的配制；`2.6I %的叠氮钠的配制；`2. 7 10%的BSA的配制；`2. 8 lmol/1 PBS 的配制；`2.9 0. 05mol/l PBS 的配制；`2.10胶体金复溶液的的配制；三、胶体金的制备`3.I 量取0. 01 %的HAuCL4溶液；`3.2 加热至沸腾，迅速加入I %柠檬酸三钠溶液，搅拌均匀，IOOml 0. 01%的HAuCL4 溶液加I. 6ml I %柠檬酸三钠溶液；`3.3继续加热10分钟，然后冷却至室温，用超纯水恢复至原体积；`3.40.22 um微孔滤膜过滤除菌；`3.5送检、装瓶、贴标签；四、cTnl免疫金的制备和干燥`4.IcTnI标记抗体的稀释,按照每生产5000人份4mm宽的cTnl试纸条需I支cTnl标记抗体计算，领取相应量的抗体，用0. 05mol/l PBS稀释到0. 5mg/ml ；4.2生产前小试 a取Iml胶体金；b 调 PH 值，0. lmol/L K2C03 的量，混匀 5min ； c根据生产指令加入CTnIAbl，混匀IOmin ； d 加入 IOOul 10% BSA，混勻 IOmin ； e离心1000转/min, 30min,要求环境温度4_10°C ； f 30%复溶,浸泡聚酯膜0. 8ml/条,0. 6cmX30cm ； g温度20-30°C，相对湿度30-35%干燥5小时； h送质检部检验；4.3 cTnl抗体标记1)标记小试质检质检合格，取胶体金，电磁搅拌，以生产1000人份5mm宽的肌I丐蛋白I 胶体金试纸条约需50ml胶体金来计算；2)调PH 值，0. lmol/L K2C03 的量，混匀 5min ；3)根据最适标记量加入CTnIAbl，混匀IOmin；4)加入IOOul 10% BSA，混勻 IOmin ；5)离心1000 转/min, 30min, 4_10°C ；6)30%复溶，浸泡聚酯膜25. 3ml/张，20cmX30cm ；7)温度20-30°C，相对湿度30-35%干燥5小时；8)抽一条0.6cm宽送质检部做膜金匹配检测；9)cTnl免疫金送中间品室暂存；五、cTnI包被板的制备5.I包被抗体的稀释，羊抗鼠IgO. 05mol/LPBS稀释到I. 2mg/ml工作浓度，cTnl捕获抗体用0. 05mol/LPBS稀释到I. lmg/ml工作浓度；5. 2包被前小试1)各取20ul试包被I条20cm长的膜，线浓度I.Oul/cm ；2)2°C _8°C过夜；3)贴膜；4)温度20-30°C、相对湿度30-35%干燥5小时,最后送质检部检验质检合格；5.3包被生产1)cTnl包被小试质检合格单；2)羊抗鼠IgG、cTnl捕获抗体工作浓度包被质控线和检测线，线浓度I.Oul/cm ；3)2°C _8°C过夜；4)贴膜；5)温度20-30°C、相对湿度30-35%，干燥5小时；6)抽I板送质检部作膜金匹配；7)密封后送中间品库暂存。
3.根据权利要求I所属的肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)，其检测流程为采用以上技术方案制作标本，加入样品槽后，通过结合垫和金抗体结合，复合物沿膜流动和抗体在检测区域反应，其分为以下三种情况(一)、阳性15分钟后出现两条色带，说明结果阳性试验有效，只要在检测区域出现有色带即可以读取结果，很低浓度的cTnl会在长于15分钟的时候出现两条带；(二)、阴性如果在检测区域没有条带而控制区域有条带，说明结果阴性而试验有效；(三)、无效试验如果在控制区域没有任何条带，说明试验无效，标本应选用另一个新的卡片重新测试。
全文摘要
本发明公开了肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)，属于生物检测试剂盒技术领域，其原理为心肌钙蛋白I(cTnI)的分子量为22.5KD，其连同肌钙蛋白和肌钙蛋白构成结构复合物，人体中的cTnI的氨基端上多了一个氨基酸残基，使得cTnI成为一个特异性的标志物，在心肌梗死发生时，cTnI便迅速释放入血液循环中，本发明采用双抗夹心免疫法，当标本加入样品槽后，通过结合垫和金抗体结合，复合物沿膜流动和抗体在检测区域反应；若标本中存在有可检出浓度或更浓的标志物，就会在检测区出现一条色带；若没有就会保持无色，标本移动至控制区域，出现粉红-玫瑰红的色带，说明试验结果正常；本发明具有快速检测、性能稳定、使用方便。
文档编号G01N33/531GK102539787SQ201210006460
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者宣生良 申请人:上海一滴准生物科技有限公司