专利名称：H5亚型禽流感病毒抗体的ha抗原表位胶体金快速检测试纸条的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种H5亚型禽流感病毒抗体的HA抗原表位胶体金快速检测试纸条。
背景技术：
禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是ー种能引起禽类发生严重急性传染病的A型流感病毒，其引起的禽流感被国际兽疫局(OIE)列为类A动物传染病。该病毒很容易发生变异，至今已发现了 16个血凝素(HA)和9个神经氨酸酶(NA)亚型。其中，H5是一种高致病性亚型AIV，能引起禽类大規模死亡并给养禽业造成巨大的经济损失。有证据表明，H5亚型AIV还能通过多种途径传播给人类及其它多种哺乳动物，如猫、狗、猪和虎等，导致其发病甚至死亡。由此可见，H5除了对养禽生产具有严重危害外，对人畜生命安全也有严重威胁。因此，快速准确检测H5亚型禽流感病毒感染对该病的排查和防控具有重要意义。AIV基因组由8个独立的RNA组成，共编码10种蛋白。其中，HA蛋白是AIV的一个重要的表面抗原性蛋白，在病毒的吸附和穿膜、决定病毒致病力等方面起重要作用，也是病毒刺激机体产生中和抗体的重要抗原，在AIV的免疫学诊断中有重要意义。酶联免疫吸附试验(ELISA)是ー类以酶标抗原或酶标抗体为主要试剂，通过复合物中的酶催化底物呈色而对被检物进行定性或定量的标记免疫技木。该技术具有灵敏度高、特异性强、准确性好、操作简单方便等特点，是目前对病毒抗原及其抗体检测的常用技木。该技术最早于1974年被欧洲国家应用于禽流感的检测，目前我国研发的禽流感ELISA诊断方法包括禽流感病毒检测ELISA和禽流感抗体检测ELISA两种。这两种技术所使用的抗原是全病毒浓缩抗原，需要通过浓缩、纯化和灭活等エ艺来制备。禽流感病毒是ー种很容易变异的病毒，具有潜在性生物安全危害。尤其是H5亚型禽流感病毒，是ー种高致病性病毒，制备抗原时要求在至少P3级的生物安全设施中生产。生产成本大、仪器设备要求高，不能满足实际生产需要，不利于这些技术的推广应用。针对这些问题，有学者以血凝素(HA)基因表达蛋白为抗原建立禽流感ELISA检测技术，并已证明可用于对禽流感病毒的HA亚型进行分型。但由于HA基因中含有较多的大肠杆菌稀有密码子，HA全长基因在原核细胞中进行表达时，序列中密集分布的稀有密码子会对重组蛋白的表达产量有很大影响，无法满足生产需要；而且这些稀有密码子分布广泛，对其进行改造需要耗费很大的人力和物力，大幅度增加研发成本。胶体金免疫层析分析(gold-immunochromatography assay, GI CA)是近年发展起来的一种以胶体金为标记物，通过抗原抗体免疫学反应对样本中的生物大分子进行定性分析的免疫学分析技木。胶体金作为免疫标记物应用于免疫学分析始于1971年，随着1989首次以胶体金为标记物开发的艾滋病抗体渗滤检测试剂诞生以来，免疫胶体金快速检测技术在生命医学诊断各个领域中得到了广泛应用。 目前尚未有H5亚型禽流感病毒抗原表位原核重组表达蛋白制备的免疫胶体金快速检测试纸条。
发明内容
本发明的目的是提供ー种H5亚型禽流感病毒抗体的HA抗原表位胶体金快速检测试纸条。所述试纸条可用于检测待测动物的H5亚型禽流感病毒的抗血清，由依次连接并固定于底板上的样品垫、胶体 金结合垫、设有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫组成，所述检测线处的检测抗原为如下a)或b)的蛋白a)由序列表序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表序列2的氨基酸序列经过ー个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且可与H5亚型禽流感病毒的抗血清特异结合的蛋白；序列表序列2所示的氨基酸序列由244个氨基酸残基组成，含有H5亚型禽流感病毒的HA抗原表位。为了使上述(a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表I所示的标签；表I标签的序列
权利要求
1.一种检测待测动物H5亚型禽流感病毒抗血清的胶体金试纸条，该试纸条由依次连接并固定于底板上的样品垫、胶体金结合垫、设有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫组成，其特征在于所述检测线处包被的检测抗原为如下a)或b)的蛋白 a)由序列表序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质； b)将序列表序列2的氨基酸序列经过ー个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且可与H5亚型禽流感病毒的抗血清特异结合的蛋白； 所述胶体金结合垫上包被有胶体金标记的抗所述待测动物IgG的抗体； 所述质控线处的检测抗体为与所述抗待测动物IgG的抗体特异结合的抗体； 所述检测线位于所述硝酸纤维素膜靠近所述胶体金结合垫的一端； 所示质控线位于所述硝酸纤维素膜靠近所述吸水垫的一端。
2.根据权利要求I所述的试纸条，其特征在于所述检测抗原为在序列表序列2所示氨基酸序列的氨基末端添加6个组氨酸的蛋白。
3.根据权利要求I或2所述的试纸条，其特征在于所述检测线与所述胶体金结合垫的连接所述硝酸纤维素膜的一端边缘的垂直距离为0. 5_-1_。
4.根据权利要求1-3中任一所述的试纸条，其特征在于所述质控线与所述检测线的垂直距离为4mm-7mm。
5.根据权利要求1-4中任一所述的试纸条，其特征在于所述样品垫是用封闭液こ浸泡过的；所述封闭液こ的溶剂为PBS包被缓冲液，溶质为牛血清白蛋白、NaN3、聚こ烯吡咯烷酮和蔗糖，溶质牛血清白蛋白、NaN3、聚こ烯吡咯烷酮和蔗糖在所述封闭液こ中的浓度分别为20g/L、0. 5g/L、3g/L和25g/L;所述PBS包被缓冲液的溶剂为水，溶质为NaCl、KCl、KH2P04和Na2HPO4，溶质NaCl、KCl、KH2PO4和Na2HPO4在所述PBS包被缓冲液中的浓度分别为8. Og/L、0. 2g/L、0. 2g/L和 I. 15g/L。
6.根据权利要求1-5中任一所述的试纸条，其特征在于所述检测抗原按照包括如下步骤的方法包被于所述硝酸纤维素膜上用所述PBS包被缓冲液将所述检测抗原稀释至I.0-1. 5mg/mL后包被于所述硝酸纤维素膜上。
7.根据权利要求5或6所述的试纸条，其特征在于所述PBS包被缓冲液的PH值为7.2。
8.根据权利要求1-7中任一所述的试纸条，其特征在于所述待测动物为鸡或鸭。
全文摘要
本发明公开了一种H5亚型禽流感病毒抗体的HA抗原表位胶体金快速检测试纸条。该试纸条可用于检测待测动物的H5亚型禽流感病毒的抗血清，由依次连接并固定于底板上的样品垫、胶体金结合垫、设有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫组成，所述检测线处的检测抗原为如下a)或b)的蛋白a)由序列表序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且可与H5亚型禽流感病毒的抗血清特异结合的蛋白。本发明的试纸条具有以下优点抗原制备方法简单、安全、产量高；操作操作简单，特异性好、敏感性高、诊断结果可靠；适用于H5亚型禽流感病毒感染的现场检测，尤其适用基层单位或个人的现场快速检测。
文档编号G01N33/68GK102645538SQ20121008545
公开日2012年8月22日 申请日期2012年3月28日 优先权日2012年3月28日
发明者刘加波, 庞耀珊, 范晴, 谢丽基, 谢志勤, 谢芝勋, 邓显文 申请人:广西壮族自治区兽医研究所