专利名称：H5亚型禽流感病毒抗体的ha抗原表位-elisa试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种H5亚型禽流感病毒抗体的HA抗原表位-ELISA试剂盒。
背景技术：
禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是一种能引起禽类发生严重急性传染病的A型流感病毒，其引起的禽流感被国际兽疫局(OIE)列为类A动物传染病。该病毒很容易发生变异，至今已发现了 16个血凝素(HA)和9个神经氨酸酶(NA)亚型。其中，H5是一种高致病性亚型AIV，能引起禽类大规模死亡并给养禽业造成巨大的经济损失。有证据表明，H5亚型AIV还能通过多种途径传播给人类及其它多种哺乳动物，如猫、狗、猪和虎等，导致其发病甚至死亡。因此，快速准确检测H5亚型禽流感病毒感染对该病的排查和防控具有重要意义。AIV基因组由8个独立的RNA组成，共编码10种蛋白。其中，HA蛋白是AIV的一个重要的表面抗原性蛋白，在病毒的吸附和穿膜、决定病毒致病力等方面起重要作用，也是病毒刺激机体产生中和抗体的重要抗原，在AIV的免疫学诊断中有重要意义。至今为止，有关该病的血清学诊断技术包括血凝抑制试验(HI)、琼脂扩散试验(AGP)、免疫荧光技术(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。血凝抑制试验(HI)是禽流感及其亚型鉴定的常用方法，但操作复杂费时，需要与血凝试验(HA)同时进行，而且对于具有相同神经氨酸酶亚型(NA)的病毒感染容易发生交叉反应，导致误诊。琼脂扩散试验(AGP)是利用可溶性抗原抗体在琼脂糖凝胶内扩散，当抗原抗体发生免疫反应时，在琼脂糖凝胶内形成肉眼可见的免疫复合物沉淀线，并依此判定结果。该方法特异性差、敏感性低，容易造成误诊。免疫荧光技术(IFA)是一种将免疫学方法与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。该方法最早在1961年用于人类流感的快速诊断，在禽流感的诊断上也有应用。该方法具有敏感、快速、简便、成本低等特点，但也存在非特异性荧光干扰而出现的假阳性结果问题。酶联免疫吸附试验(ELISA)是一类以酶标抗原或酶标抗体为主要试剂，通过复合物中的酶催化底物呈色而对被检物进行定性或定量的标记免疫技术。该技术具有灵敏度高、特异性强、准确性好、操作简单方便等特点，是目前对病毒抗原及其抗体检测的常用技术。该技术最早于1974年被欧洲国家应用于禽流感的检测，目前我国研发的禽流感ELISA诊断方法包括禽流感病毒检测ELISA和禽流感抗体检测ELISA两种。这两种技术所使用的抗原是全病毒浓缩抗原，需要通过浓缩、纯化和灭活等工艺来制备。禽流感病毒是一种很容易变异的病毒，具有潜在性生物安全危害。尤其是H5亚型禽流感病毒，是一种高致病性病毒，制备抗原时要求在至少P3级的生物安全设施中生产。生产成本大、仪器设备要求高，不能满足实际生产需要，不利于这些技术的推广应用。针对这些问题，有学者以血凝素(HA)基因表达蛋白为抗原建立禽流感ELISA检测技术，并已证明可用于对禽流感病毒的HA亚型进行分型。但由于HA基因中含有较多的大肠杆菌稀有密码子，HA全长基因在原核细胞中进行表达时，序列中密集分布的稀有密码子会对重组蛋白的表达产量有很大影响，无法满足生产需要；而且这些稀有密码子分布广泛，对其进行改造需要耗费很大的人力和物力，大幅度增加研发成本。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种H5亚型禽流感病毒感染血清抗体的HA抗原表位-ELISA试剂盒。该试剂盒可用于检测或辅助检测待测动物H5亚型禽流感病毒的抗血清，所述试剂盒中含有独立包装的如下a)或b)的蛋白作为检测抗原a)由序列表序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质； b)将序列表序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且可与H5亚型禽流感病毒的抗血清特异结合的蛋白。 序列表序列2所示的氨基酸序列由244个氨基酸残基组成，含有H5亚型禽流感病毒的HA抗原表位。为了使上述(a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表I所示的标签。表I标签的序列
标签残基序列
Poly-Arg5-6(通常为 5 个)RRRRR
Poly-His2-10(通常为 6 个)HHHHHH
FLAG8DYKDDDDK
Strep-tag II 8WSHPQFEK
c-myc10EQKLISEEDL~所述蛋白具体可为在序列表序列2所示氨基酸序列的氨基末端添加6个组氨酸的蛋白。所述试剂盒中还含有独立包装的包被液和/或独立包装的PBST缓冲液和/或独立包装的封闭液和/或独立包装的样品稀释液和/或独立包装的TMB储存液和/或独立包装的TMB底物稀释液和/或独立包装的终止液；所述包被液的溶剂为水，溶质为Na2CO3和NaHCO3,溶质Na2CO3和NaHCO3在所述包被液中的浓度分别为I. 59g/L和2. 93g/L，所述包被液PH值具体可为9. 6 ；所述PBST缓冲液的溶剂为水，溶质为NaCl、KCl、KH2P04、Na2HPO4和吐温_20，溶质NaCl、KCUKH2PO4和Na2HPO4在所述PBST缓冲液中的浓度分别为8. 0g/L、0. 2g/L、0. 2g/L和
I.15g/L，所述吐温-20在所述PBST缓冲液中的体积百分含量为0. 05%，所述PBST缓冲液的PH值具体可为7.4 ;
所述封闭液的溶剂为PBST缓冲液，溶质为脱脂牛奶，溶质脱脂牛奶在所述封闭液中的浓度为50g/L ；所述样品稀释液的溶剂为PBST缓冲液，溶质为牛血清白蛋白，溶质牛血清白蛋白在所述样品稀释液中的浓度为10g/L ；所述TMB储存液的溶剂为无水乙醇，溶质为四甲基联苯胺，溶质四甲基联苯胺在所述TMB储存液中的浓度为2mg/mL ； 所述TMB底物稀释液的溶剂为水，溶质为Na2HPO4和柠檬酸，溶质Na2HPO4和柠檬酸在所述TMB底物稀释液中的浓度分别为18. 27g/L和4. 665g/L，所述TMB底物稀释液的PH值具体可为5. 5 ;所述终止液为2mol/L的硫酸水溶液。所述试剂盒中还含有独立包装的酶标记的抗待测动物IgG的抗体。所述酶标记的抗待测动物IgG的抗体的标记酶为辣根过氧化物酶。所述待测动物具体可为鸡或鸭，也可为鹅、猪、牛、人和野鸟。本发明所提供的酶联免疫试剂盒中的检测抗原是H5N1亚型禽流感病毒的HA抗原表位原核重组表达蛋白，该重组表达蛋白是在不改变原有基因信息的前提下，通过选择HA基因中抗原表位集中、稀有密码子之间距离相对较远的区域作为目的基因进行表达，解决了 HA全长基因在表达过程中由于部分区域存在密集分布的稀有密码子而导致目的蛋白表达产量低的难题，开拓了一条方便、低廉、高效获取检测抗原的途径。实验证明，本发明的试剂盒可特异地检测含有H5亚型禽流感病毒的待测动物抗血清，灵敏度达I : 800，准确率达92%以上，该试剂盒适用于检测鸡、鸭、鹅、野鸟、猪、牛和人等来源的H5亚型禽流感病毒抗血清，既可用于H5亚型禽流感的早期诊断，又可用于抗体监测，在生产实际中的流行病学调查和抗体监测方面非常实用。
图I为H5N1亚型禽流感病毒HA基因编码的氨基酸序列在大肠杆菌中的密码子使用情况表(临界值为1% )。其中，图中所示的全长序列为H5N1亚型禽流感病毒HA基因开放阅读框编码的氨基酸序列，阴影部分为本发明的HA抗原表位基因编码的氨基酸序列；序列中使用频率< I %的大肠杆菌稀有密码子用大写字母显示；使用频率< 0. 28%的大肠杆菌稀有密码子用带框的大写字母显示。图2为H5亚型禽流感病毒HA抗原表位基因片段和HA基因的开放阅读框(ORF)基因的PCR扩增产物电泳图。其中，泳道I为两端含有EcoR I酶切识别序列的HA抗原表位基因片段，泳道2为分子量标准，从上至下依次为1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp，泳道3为两端含有EcoR I酶切识别序列的HA基因开放阅读框片段。图3为H5亚型禽流感病毒HA抗原表位重组表达蛋白的SDS-PAGE电泳图。其中，泳道I为预染蛋白质Markerlll，从上至下依次为94KD、60KD、45KD、27KD和18KD ;泳道2为重组菌 Rosetta-gami B (DE3) /pET~32a (+) -HA 未诱导对照，泳道 3 为重组菌 Rosetta-gamiB (DE3) /pET-32a (+) -HA的包涵体，箭头所指处即为目的蛋白。图4为H5亚型禽流感病毒HA基因开放阅读框重组表达蛋白的SDS-PAGE电泳图。其中，泳道I为预染蛋白质Markerlll，从上至下依次为94KD、60KD、45KD和27KD ;泳道2为重组菌Rosetta-gami B (DE3) /pET_32a (+) -HAORF未诱导对照，泳道3为重组菌Rosetta-gami B (DE3)/pET-32a (+) -HAORF的包涵体，箭头所指处即为目的蛋白。
图5为H5亚型禽流感病毒HA抗原表位重组表达蛋白的Western-Blot分析结果。其中，泳道I为预染蛋白质Markerlll，从上至下依次为94KD、60KD、45KD、27KD和18KD ;泳道2为HA抗原表位重组表达蛋白与H5亚型禽流感病毒阳性血清的反应结果；泳道3为HA抗原表位重组表达蛋白与SPF阴性鸡血清反应结果。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例所用血清的来源如下H5亚型禽流感鸡阳性血清购自哈尔滨维科生物技术开发公司，经血凝抑制试验方法鉴定呈阳性。H7亚型禽流感鸡阳性血清购自哈尔滨维科生物技术开发公司，经血凝抑制试验方法鉴定呈阳性。H9亚型禽流感鸡阳性血清购自哈尔滨维科生物技术开发公司，经血凝抑制试验方法鉴定呈阳性。传染性鼻炎阳性鸡血清购自中国兽医药品监察所，经琼脂扩散试验方法鉴定呈阳性。新城疫阳性鸡血清购自北京康农兴牧科技发展中心，经血凝抑制试验方法鉴定呈阳性。产蛋下降综合症阳性鸡血清购自北京康农兴牧科技发展中心，经琼脂扩散试验方法鉴定呈阳性。传染性支气管炎阳性鸡血清购自顺勃生物工程技术(北京)有限公司，经琼脂扩散试验方法鉴定呈阳性。实施例I、H5亚型禽流感病毒感染血清抗体的HA抗原表位-ELISA试剂盒本发明的用于检测H5亚型禽流感病毒感染血清抗体的HA抗原表位-ELISA试剂盒由H5亚型禽流感病毒的HA抗原表位重组蛋白(简称包被抗原)、包被液、PBST缓冲液、封闭液、样品稀释液、TMB储存液、TMB底物稀释液和终止液组成，其制备方法或组成如下—、包被抗原-H5亚型禽流感病毒的HA抗原表位重组蛋白的制备与鉴定I、H5亚型禽流感病毒HA基因的克隆以经过病毒分离、血凝抑制试验等常规实验方法鉴定为H5N1禽流感病毒A/Duck/GX/1/00 (H5N1)感染的鸭肝组织为样品提取总RNA，反转录获得cDNA，再以5’ -atggagaaaatagtgcttc-3’ 和 5’ _ttaaatgcaaattctgcactgt_3’ 为引物进行 PCR 扩增，得到序列表序列I所示的大小为1704bp的DNA片段，该序列为H5N1亚型禽流感病毒HA基因的开放阅读框(ORF)。2、H5亚型禽流感病毒HA基因的稀有密码子分析分析H5N1亚型禽流感病毒HA基因的开放阅读框(其序列如序列表序列I所示)及HA抗原表位基因(其序列如序列表序列I的第289位至第1020位所示)的稀有密码子出现次数及在基因序列中的分布情况。结果如图I和表2所示。表2. HA基因在大肠杆菌中表达的稀有密码子分析
权利要求
1.一种检测或辅助检测待测动物H5亚型禽流感病毒抗血清的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有独立包装的如下a)或b)的蛋白 a)由序列表序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质； b)将序列表序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且可与H5亚型禽流感病毒的抗血清特异结合的蛋白。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述蛋白质为在序列表序列2所示氨基酸序列的氨基末端添加6个组氨酸的蛋白。
3.根据权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还含有独立包装的包被液和/或独立包装的PBST缓冲液和/或独立包装的封闭液和/或独立包装的样品稀释液和/或独立包装的TMB储存液和/或独立包装的TMB底物稀释液和/或独立包装的终止液； 所述包被液的溶剂为水，溶质为Na2CO3和NaHCO3,溶质Na2CO3和NaHCO3在所述包被液中的浓度分别为I. 59g/L和2. 93g/L ； 所述PBST缓冲液的溶剂为水，溶质为NaCl、KCl、KH2P04、Na2HP04和吐温-20，溶质NaCl、KCl、腿#04和Na2HPO4在所述PBST缓冲液中的浓度分别为8. 0g/L、0. 2g/L、0. 2g/L和I. 15g/L，所述吐温-20在所述PBST缓冲液中的体积百分含量为0. 05% ; 所述封闭液的溶剂为PBST缓冲液，溶质为脱脂牛奶，溶质脱脂牛奶在所述封闭液中的浓度为50g/L ； 所述样品稀释液的溶剂为PBST缓冲液，溶质为牛血清白蛋白，溶质牛血清白蛋白在所述样品稀释液中的浓度为10g/L ； 所述TMB储存液的溶剂为无水乙醇，溶质为四甲基联苯胺，溶质四甲基联苯胺在所述TMB储存液中的浓度为2mg/mL ； 所述TMB底物稀释液的溶剂为水，溶质为Na2HPO4和柠檬酸，溶质Na2HPO4和柠檬酸在所述TMB底物稀释液中的浓度分别为18. 27g/L和4. 665g/L ； 所述终止液为2mol/L的硫酸水溶液。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述包被液PH值为9.6 ;所述PBST缓冲液的PH值为7. 4 ;所述TMB底物稀释液的PH值为5. 5。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还含有独立包装的酶标记的抗待测动物IgG的抗体。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述酶标记的抗待测动物IgG的抗体的标记酶为辣根过氧化物酶。
7.根据权利要求1-6中任一所述的试剂盒，其特征在于所述待测动物为鸡或鸭。
全文摘要
本发明公开了一种H5亚型禽流感病毒抗体的HA抗原表位-ELISA试剂盒。该试剂盒可用于检测或辅助检测H5亚型禽流感病毒抗血清，所述试剂盒中含有独立包装的如下a)或b)的蛋白作为检测抗原a)由序列表序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且可与H5亚型禽流感病毒的抗血清特异结合的蛋白。实验证明，本发明的试剂盒可特异地检测含有H5亚型禽流感病毒的待测动物抗血清，灵敏度达1∶800，准确率达92％以上，适用于检测鸡、鸭、鹅、野鸟、猪、牛和人等来源的H5亚型禽流感病毒抗血清，既可用于H5亚型禽流感的早期诊断，又可用于抗体监测，在生产实际中的流行病学调查和抗体监测方面非常实用。
文档编号G01N33/543GK102645539SQ201210085999
公开日2012年8月22日 申请日期2012年3月28日 优先权日2012年3月28日
发明者刘加波, 庞耀珊, 范晴, 谢丽基, 谢志勤, 谢芝勋, 邓显文 申请人:广西壮族自治区兽医研究所