专利名称：一种酶法制备阿莫西林中残留蛋白质的检测方法
技术领域：
本发明涉及制药领域，具体涉及ー种药品质量的检测方法，更具体涉及ー种测量酶法制备阿莫西林中残留蛋白质的方法。
背景技术：
目前阿莫西林的合成有两种方法，即化学半合成法(简称化学法)和酶半合成法(简称“酶法”)，化学法是在30多年前开发的，目前仍然在阿莫西林エ业生成中广泛使用； 酶法是近年来研发的新型エ艺，其采用青霉素G酰基转移酶与DHPG活性酰基衍生物耦联起来。与化学法相比，酶法エ艺步骤少，減少有机溶剂和化学制品的使用。但酶法合成阿莫西林的生产エ艺中，所使用的青霉素G酰基转移酶(Novelpenicillin G Acylase NPGA)对人体而言,是ー种外源性蛋白质,如果在最终产品中存在，将对患者有可能导致过敏等不良反应。因此，为了更好地检测阿莫西林药品的质量，有必要提供一种测量方法，以检测酶法制备的阿莫西林最终产品中是否有酶蛋白的残留，从而保证用药的安全性。
发明内容
本发明提供ー种酶法制备阿莫西林产品中残留酶蛋白的检测方法，本发明方法包括对照品溶液制备取青霉素G酰基转移酶蛋白标准品，用pH值7. O的O. 05mol/L磷酸盐缓冲液稀释得对照品溶液；供试品溶液的制备取供试品，精密称定并置于量瓶中，加入pH值7.0的O. 05mol/L的磷酸盐缓冲液，加入O. lmol/L氢氧化钠溶液，使供试品完全溶解至溶液澄清，再用PH值7. O的O. 05mol/L磷酸盐缓冲溶液稀释得供试品溶液；分别精密量取上述溶液各100 μ L注入高效液相色谱仪中，记录峰面积，以外标法測量残留蛋白的含量；其中，所述高效液相色谱的条件为色谱柱TSKgel Octadecyl 4 PW(7)、4· 6 X 150mm ;色谱柱温度30°C;流动相水-こ腈-三氟醋酸体系，线性梯度洗脱。作为实施方案之一，本发明标准品青霉素G酰基转移酶溶液的浓度没有特别的限定，可以为本领域常规的浓度，以便于检测为原则，如配成O. 08mg/ml的浓度，或其他适宜的浓度范围。青霉素G酰基转移霉标准品可以由本领域技术人员结合现有技术进行制备获得；也可以通过商业方法，如购买获得，其来源不受任何的限制。作为实施方案之一，本发明供试品溶液的浓度同样没有特别的限定，可以为本领域常规浓度的溶液，以便于检测为原则，如配成40mg/ml的浓度，或其他适宜的浓度范围。
本发明中所述的色谱柱TSK gel Octadecyl 4 Pff (7)为硅胶基质反相色谱柱，其仅为本发明优选的实施方案之一，本发明包括但不限于该色谱柱；本领域技术人员根据本发明的记载并结合本领域常识，可以采用能够达到同样效果的其他类型的色谱柱来替换本发明所述的色谱柱。作为实施方案之一，本发明所述检测方法中的流动相包括流动相A :水-こ臆-三氟醋酸的比为950 50 O. 5 ；作为实施方案之一，所述方法中的流动相进ー步还包括流动相B :水-こ臆-三氟醋酸的比为100 900 0.5。作为优选实施方案之一，本发明所述检测方法还包括流动相A与流动相B的梯度洗脱的时间表为
时间(min)%A%B
O6535
205050
305050
356535
406535 ο作为实施方案之一，本发明所述检测方法中，所述方法中高效液相色谱的条件还包括进样器温度20°C，进样量为lOOul。作为实施方案之一，本发明所述检测方法中，所述方法中高效液相色谱的条件还包括双波长紫外检测器，检测波长为280nm，200nm。作为实施方案之一，本发明所述检测方法中，所述方法中高效液相色谱的条件还包括多波长荧光检测器，激发波长为275nm。作为实施方案之一，本发明所述检测方法中，高效液相色谱的条件还包括多波长突光检测器，发射波长为345nm。作为实施方案之一，本发明所述检测方法最佳为包括I.青霉素G酰基转移酶蛋白标准品的含量确定青霉素G酰基转移酶有两个亚单元， 27Kda和65Kda，在此色谱条件下，得到了两个主锋，命名为A峰和B峰；根据青霉素G酰基转移酶标准品的总蛋白含量9. Omg/g,以峰面积归ー化法计算出含量若以A+B峰为O. 84% ;2不同供试品的測量对照品溶液制备取酶蛋白标准品约80mg，用pH值7. O的O. 05mol/L磷酸盐缓冲液溶液并稀释至100ml，取10. 0ml，用pH7. O的O. 05mol/L磷酸盐缓冲液稀释至IOOml,即 得;供试品溶液的制备分别取供试品I. Og，精密称定，置25ml量瓶中，用pH值7. O的O. 05mol/L的磷酸盐缓冲液，逐滴加入O. lmol/L氢氧化钠溶液，边滴加边振摇，滴加至正好使供试品完全溶解至溶液澄清，用pH值7. O的O. 05mol/L磷酸盐缓冲溶液稀释至25ml，即得;精密量取上述溶液各100 μ L注入液相色谱仪，记录峰面积，以外标法测量残留蛋白的含量；其中高效液相的条件为Waters 1525 型 HPLC 泵数据处理软件 Waters Empower ；Waters 717 Plus型自动进样器，进样器温度20°C ，进样量lOOul，检测器Waters 2487 Dual λ Absorbance dectector双波长紫外检测器,检测波长 280nm, 200nm ;Waters 2475 Multi λ Flurescence Dectector 多波长突光检测器,激发波长275nm,发射波长345nm ；色谱柱TSKgel Octadecyl 4 PW (7) 4. 6 X 150mm Lot No. P0074 ;色谱柱温度30 °C ；流动相A 7jC -こ腈-三氟醋酸(950 50 0. 5);流动相B冰_こ腈_三氟醋酸(100 900 0.5)线性梯度洗脱；其中流动相A与流动相B梯度洗脱的时间表为
时间(min)%A%B
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406535 ο本发明通过方法学验证证明了本发明检测方法的安全性、可靠性、可以有效地检测出采用酶法制备的阿莫西林产品是否含有残留的酶蛋白及其残留量，通过本发明方法有效地检测出阿莫西利产品的质量，提高了药品的用药安全。
图I :青霉素G酰基转移酶的HPLC谱图；图2 :蛋白标准品(青霉素G酸基转移酶)溶液；图3 :空白溶液的典型HPLC谱图；图4 :供试品溶液的典型HPLC色谱图(批号CL021002001)；图5 :供试品加样回收率的HPLC色谱图；图6 :蛋白标准品溶液的线性关系；图7 :标准品溶液的稳定性；图8 :供试品溶液(加样回收样品)的稳定性。
具体实施例方式本发明通过以下实施例和实验例进ー步阐述本发明，但本发明并不受限于此。
以下是实施例和实验例中所采用的材料、试剂、仪器与HPLC色谱条件为I.仪器与HPLC色谱条件Lambda 35UV/VIS紫外分光光度计Waters I525 型 HPLC 泵数据处理软件 Waters Empower ；Waters 717 Plus型自动进样器，进样器温度20°C，进样量lOOul，检测器Waters 2487 Dual λ Absorbance dectector双波长紫外检测器,检测波长 280nm, 200nm ;Waters 2475 Multi λ Flurescence Dectector 多波长突光检测器,激发波长275nm,发射波长345nm。色谱柱TSKgel Octadecyl 4 PW (7) 4. 6 X 150mm Lot No. P0074 ;色谱柱温度30 °C ；流动相A 7jC -こ腈-三氟醋酸(950 50 0. 5);流动相B冰_こ腈_三氟醋酸(100 900 0. 5)线性梯度洗脱(表I)表I阿莫西林中残留蛋白測定的梯度时间表
权利要求
1.ー种酶法制备阿莫西林产品中残留酶蛋白的检测方法，其特征在于，所述方法包括 对照品溶液制备取青霉素G酰基转移酶蛋白标准品，用pH值7. O的O. 05mol/L磷酸盐缓冲液稀释得标准品溶液； 供试品溶液的制备取供试品，精密称定并置于量瓶中，加入PH值7. O的O. 05mol/L的磷酸盐缓冲液，加入O. lmol/L氢氧化钠溶液，使供试品完全溶解至溶液澄清，再用pH值7. O的O. 05mol/L磷酸盐缓冲溶液稀释得供试品溶液； 分别精密量取上述溶液各100 μ L注入高效液相色谱仪中，记录峰面积，以外标法测量残留蛋白的含量； 其中，所述高效液相色谱的条件为色谱柱TSK gel Octadecyl 4 Pff (7) >4. 6 X 1 50mm ； 色谱柱温度30°C ; 流动相水-こ腈-三氟醋酸体系，线性梯度洗脱。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法中的流动相包括流动相A:水-こ臆-三氟醋酸的比为950 50 0.5。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法中的流动相还包括流动相B:水-こ臆-三氟醋酸的比100 900 0.5。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括流动相A与流动相B的梯度洗脱的时间表为时间(min)%A%B O6535 205050 305050 356535 406535ο
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法中高效液相色谱的条件还包括进样器温度为20°C，进样量为IOOul。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法中高效液相色谱的条件还包括双波长紫外检测器，检测波长280nm，200nm。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法中高效液相色谱的条件还包括多波长荧光检测器，激发波长为275nm。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法中高效液相色谱的条件还包括多波长突光检测器，发射波长为345nm。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法中，所述青霉素G酰基转移酶标准品溶液的浓度为O. 08mg/ml ;和/或所述供试品溶液的浓度为40mg/ml。
10.根据权利要求1-9任一所述方法，其特征在于，所述方法还包括 青霉素G酰基转移酶蛋白标准品的含量确定青霉素G酰基转移酶有两个亚单元， 27Kda和65Kda，在此色谱条件下，得到了两个主鋒，命名为A峰和B峰； 根据青霉素G酰基转移酶标准品的总蛋白含量9. Omg/g,以峰面积归ー化法计算出含量若以A+B峰为O. 84% ; 供试品的測量 对照品溶液制备取酶蛋白标准品约80mg，用pH值7. O的O. 05mol/L磷酸盐缓冲液溶液并稀释至100ml，取10. 0ml，用ρΗ7· O的O. 05mol/L磷酸盐缓冲液稀释至IOOml,即得；供试品溶液的制备分别取供试品I. Og，精密称定，置25ml量瓶中，用pH值7. O的O. 05mol/L的磷酸盐缓冲液，逐滴加入O. lmol/L氢氧化钠溶液，边滴加边振摇，滴加至正好使供试品完全溶解至溶液澄清，用PH值7. O的O. 05mol/L磷酸盐缓冲溶液稀释至25ml，即得; 精密量取上述溶液各100 μ L注入液相色谱仪，记录峰面积，以外标法测量残留蛋白的含量; 其中高效液相的条件为 Waters 1525 型 HPLC 泵数据处理软件 Waters Empower ； Waters 717 Plus型自动进样器，进样器温度20°C，进样量为lOOul， 检测器Waters 2487 Dual λ Absorbance dectector双波长紫外检测器，检测波长280nm, 200nm ；ffaters 2475 Multi λ Flurescence Dectector 多波长突光检测器,激发波长275nm,发射波长345nm ；色谱柱TSK gel Octadecyl 4 PW (7) 4. 6 X 150mm Lot No. P0074 ;色谱柱温度30°C ；流动相A:水-こ臆-三氟醋酸(950 50 0.5);流动相B:水-こ臆-三氟醋酸(100 900 0.5)线性梯度洗脱，其中，所述方法还包括流动相A与流动相B的梯度洗脱的时间表为时间(min)%A%B O6535 205050 305050 356535 406535ο
全文摘要
本发明涉及制药领域，提供了酶法制备阿莫西林中残留蛋白质的检测方法，包括取青霉素G酰基转移酶标准品，用pH值7.0的0.05mol/L磷酸盐缓冲液稀释得标准品溶液；取供试品，精密称定并置于量瓶中，加入pH值7.0的0.05mol/L的磷酸盐缓冲液，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液至供试品溶解至溶液澄清，再用pH值7.0的0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液稀释得供试品溶液；分别精密量取上述溶液各100μL注入高效液相色谱仪中，记录峰面积，以外标法测量残留蛋白的含量。本发明方法可以有效地检测阿莫西林产品中残留蛋白的含量，从而可以有效地检测出产品的质量，提高了药品的用药安全。
文档编号G01N30/88GK102645503SQ20121013532
公开日2012年8月22日 申请日期2012年5月4日 优先权日2012年5月4日
发明者梁国艳 申请人:联邦制药(内蒙古)有限公司