专利名称：一种食品中2-萘胺的酶联免疫吸附检测方法
技术领域：
一种检测食品中偶氮染料的酶联免疫吸附检测方法，属于免疫学检测分析领域。
背景技术：
偶氮是染料中形成基础颜色的物质，且偶氮染料合成方法较为简单、结构多变，因而种类繁多，很多染料都属于此。偶氮染料因其易于发生偶氮还原裂解而可以产生20余种致癌芳香胺而备受关注，并成为食品、皮革、玩具等产品中化学品成分分析的一项极其重要的内容，而联苯胺和2-萘胺是其中致癌性最强的两种芳香胺，它们是合成许多工业染料及食品色素的中间物。然而随着食品工业的不断发展，人们对于食品感官品质的要求也不断提高，偶氮染料凭借其自身颜色鲜艳、着色简单、稳定等其它染料不可比拟的优越性，而被谋取暴利的不法商贩越来越多地添加到食品中，如苏丹红。对于偶氮染料的检测，主要是通过检测其产生的芳香胺来实现对其监控的。目前，芳香胺的检测主要依靠传统的气相色谱、液相色谱、气质联用、液质联用等仪器分析检测，这些检测方法虽灵敏、准确，但均依赖昂贵 而庞大的仪器设备，因此检测成本较高，而且耗时、前处理复杂繁琐，很难满足现场检测的快速简便而灵敏高效的要求。故而，研究出一种快速、灵敏、简便、准确、高效而价廉的免疫学检测方法，势在必行。然而酶联免疫学迄今在此领域鲜有涉足，因而，开展此项研究的必要性和重要性可见一斑。
发明内容
(一 )要解决的技术问题
本发明旨在建立一种具有高特异性、高灵敏度、高准确度、高精确度、操作方法简单、快速、价廉等特点的酶联免疫吸附检测方法，用于含偶氮染料的食品的批量、快速检测分析。( 二 )技术方案
为实现上述目的，本发明建立了 2-萘胺的酶联免疫吸附检测方法，并对检测方法进行了条件优化。其中，样品前处理根据国标GB/T 17592-2006 :将食品样品剪成5mmX5mm的碎片，均匀混合后准确称取3. OOg样品置于具塞锥形瓶中，加入50mL pH 6. O的柠檬酸盐缓冲溶液，70°C水浴搅拌反应30min，然后加入IOmL连二亚硫酸钠溶液，继续上述水浴搅拌反应30min，待反应结束后，将试管迅速用流动自来水冷却至室温，如此即可将食品中的偶氮染料还原为相应的芳香胺，然后滤去残渣，备用。其中，包被2-萘胺抗原的酶标板的制备过程中，所用的包被原是半抗原2-萘胺与卵清蛋白(OVA)的偶联复合物，所用包被缓冲液是O. 05 M pH9. 6碳酸钠缓冲液，所用封闭液是含2%明胶的上述包被缓冲液。其中，2-萘胺多克隆抗体是用2-萘胺与牛血清白蛋白(BSA)的重氮化法偶联复合物，用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，并以一定的免疫剂量多次加强免疫健康的新西兰大白兔制备得到的。
其中，酶标二抗是辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(GAR-HRP)。其中主要溶液的配制
O. OlM磷酸盐(PBS)缓冲液氯化钠8 g、磷酸二氢钾O. 24 g、磷酸氢二钠3. 62 g、氯化钾O. 2g，用超纯水定容至1L。洗涤液(PBST):为含有O. 05%吐温-20的O. 01M、pH7. 4的磷酸盐缓冲液。抗体稀释液含O. 1%明胶的PBST溶液。标准品稀释液为甲醇溶液。O. 05M pH 9. 6 的碳酸盐(CBS)缓冲溶液称取 I. 59g Na2CO3^2. 93g NaHCO3,加超纯水稀释至1L。显色液由A液和B液两种溶液构成，A液配方为9. 33 g柠檬酸，36. 8 gNa2HPO4 · 12H20,180 μ L 30%的H2O2，用超纯水定容至IL ；Β液配方为600 mg四甲基联苯胺溶于IL乙二醇，并超声振荡几分钟。二者均贮于4°C冰箱中保存，使用时将A液和B液以A B=5 I的体积比混匀即可。终止液为2mol/L 的 H2S04。本发明方法的检测分析原理是
以相同量(100 μ L)的抗原包被到酶标板的各个孔中，加入待测含2-萘胺食品样品和2-萘胺多克隆抗体后，待测样品中的2-萘胺与固相包被抗原相互竞争有限的抗待测物的抗体(一抗)，并与之结合，由于每个孔中的固相抗原和加入的抗体含量均相同，所以当待测样品所含的2-萘胺浓度高时，与固相抗原结合的抗体就会减少，而反应达到平衡时，将上清液倾倒出来，并用洗液洗涤，故只有与固相抗原结合的抗体留在酶标板孔中，并与加入的酶标二抗反应，显然此时酶标二抗与被固定的抗体结合量减少，用洗涤液洗涤后加入底物液(即显色液A液)和显色液(即B液)，显色反应浅，用酶标仪检测450nm处的OD值低，表明抑制率高；反之，当待测2-萘胺浓度低时，则所测的OD值高，抑制率低。根据所作的标准曲线，可以推算出待测样品中所含2-萘胺的浓度高低。一种食品中偶氮染料的还原物2-萘胺的酶联免疫吸附检测方法，步骤为
(1)抗原的包被
将2-萘胺与卵清蛋白OVA重氮化法偶联，并以此偶联复合物作为包被抗原，以O. 05 M、pH 9. 6的碳酸钠缓冲液稀释包被抗原，抗原稀释倍数分别为2000、4000、8000、16000倍，向酶标板的每孔中加入上述不同稀释倍数的包被液100 μ L，4°C孵育过夜，用添加有2%明胶的上述包被缓冲液作为封闭液封闭；
(2)竞争反应
将免疫制备的2-萘胺多克隆抗体用抗体稀释液分别稀释1000、3000、9000倍后，力口入酶标板中，每孔加50 μ L,同时分别加入浓度为O ng/mL, 2 ng/mL, 5 ng/mL, 10 ng/mL, 20ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL的2-萘胺标准品，每孔加入50 μ L，37°C孵育lh，然后用PBST洗涤液置于摇床上洗涤3次，每次3min ；
所述洗涤液PBST :为含有O. 05%吐温-20的O. 01M、pH7. 4的磷酸盐缓冲液；
抗体稀释液含O. 1%明胶的PBST溶液；
(3)加酶标二抗
加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体GAR-HRP，用抗体稀释液进行5000倍稀释，每孔加入100 μ L，37°C温育lh，以PBST置于摇床上洗涤3次，每次3min ；
(4)显色
向酶标板的各孔中分别加入100 μ L显色液，于37°C恒温箱中反应15 min，取出酶标板，向每孔加入100 μ L终止液2 mol/L的硫酸,用酶标仪测定450nnm处的吸光值A45(l。(三)有益效果
本发明提供的食品偶氮染料检测方法采用了 2-萘胺多克隆抗体，能准确灵敏地检测食品中的部分偶氮染料，样品的前处理过程简单、耗时少、检测成本低、反应条件温和、方法环保、能实现食品的大通量检测，而且本发明方法稳定性好，基本无有机溶剂的污染。本发明对于含偶氮染料的现场检测具有重要的现实意义，并对于其它相关偶氮染料的酶联免疫吸附检测方法的建立具有重要的指导意义。
图I 2-萘胺的标准抑制曲线。
具体实施例方式实施例I检测方法的操作及结果计算 一种定量检测食品中2-萘胺的酶联免疫吸附方法，包括以下步骤
(1)制备2-萘胺-BSA免疫原；
(2)制备抗2-萘胺的多克隆抗体；
(3)制备2-萘胺-OVA包被原；
(4)制备包被板；
(5)竞争反应；
(6)加酶标二抗；
(7)显色；
其中
(I)制备2-萘胺-BSA免疫原
称取 . 2 mg的2-萘胺(约O. 05mmol),用lmol/L HCl溶液将其溶解并调pH至I左右，(TC预冷30min，得到A液；称取6g NaNO2溶解于20mL纯水中，配成30% NaNO2溶液，(TC预冷30min ;4°C、持续搅拌下，把配置的30% NaNO2溶液滴加到A液中，NaNO2溶液的加入量用淀粉-碘化钾试纸检测，当其变为蓝黑色，且2秒内不变色即可停止加入，此后继续反映15min ;称取 67mg BSA，溶解于 9mL、0. IM pH9. 6 的 CB 溶液中，并置于(TC预冷 30min ;4°C、持续搅拌下将重氮化的2-萘胺缓慢滴加到BSA溶液中，并于4°C冰箱中搅拌反应过夜，在此过程中要不断检测反应体系pH，并用IM NaOH使其保持在pH8 9左右。反应结束后，将反应液转移到透析袋中，然后于O. 01M、pH7.4的PBS中、4°C温度下透析72h。然后用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。4°C保存备用。(2)制备抗2-萘胺的多克隆抗体
所用免疫动物为新西兰大白兔4只，分别编号为I号、2号、3号、4号。采用皮下和肌肉注射法进行免疫。免疫方法初次免疫用制得的免疫原和等体积的弗氏完全佐剂在带有连接管的注射器中混合乳化，剂量为O. 5mg/kg，采用背部皮下多点注射；四周后进行第一次加强免疫，用弗氏不完全佐剂进行乳化，剂量为I mg/kg，采用肌肉注射；以后每隔两周进行一次加强免疫，用弗氏不完全佐剂进行乳化，免疫剂量为I mg/kg，采用肌肉注射。从第二次加强免疫开始，每次免疫8-10天后耳缘采血，并将血液于5000r/min、4°C下离心lOmin，收集血清来测定效价和抑制率。当效价和抑制率均达到最大或满足要求后，用心脏穿刺采血法采血，将血液经同样离心条件离心后收集血清，采用免疫亲和层析法对抗体进行纯化，向所得抗体中加入等量甘油和O. 1%叠氮钠，-20°C保存。(3 )制备2-萘胺-OVA包被原
2-萘胺-OVA包被原的合成采用上述重氮化法合成，将BSA换成OVA即可。(4)包被板的制备
包被板为96孔酶标板并在微孔中包被2-萘胺-OVA偶联物，采用O. 05M pH 9. 6的碳酸盐缓冲液作为包被液稀释2-萘胺-OVA偶联物，抗原稀释倍数分别为2000、4000、8000、16000倍，然后向包被板的每个孔中加入100 μ L包被液，37°C烘箱放置2h或4°C过夜，用洗·涤液洗涤3min，每次在吸水纸上拍干，重复2次。然后加入含2%明胶的上述包被缓冲液作为封闭液封闭，37°C烘箱温育2h，取出用上述洗涤液洗涤3次。(5)竞争反应
分别将一系列浓度梯度分别为 O ng/mL, 2ng/mL, 5 ng/mL, 10 ng/mL, 20 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL的2-萘胺标准品和经前处理过的样品提取液分别加入到包被板各自的微孔中，每孔50 μ L，要双孔平行加样。再将免疫制备的2-萘胺多克隆抗体用抗体稀释液(含O. 1%明胶、含O. 05%吐温-20、pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液PBST)分别稀释9000倍，加入酶标板中，每孔加入量为50 μ L，37°C恒温箱孵育Ih后以PBST洗涤3次，每次洗3min ；
(6)加酶标二抗
加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔(GAR-HRP)，用抗体稀释液稀释5000倍，向每孔中加100 μ L，37°C恒温箱温育Ih后以PBST洗涤3次，每次3min ；
(7)显色
每孔加入100 μ L显色液,置于37°C不透光恒温箱中反应15 min,取出后每孔加入100μ L终止液，用酶标仪测定450nm处吸光值A45tl。标准抑制曲线的绘制方法为把加入O ng/mL标准品孔的OD值减去加入最大浓度标准品孔的OD值所得差值定为Btl,把加入O ng/mL标准品孔的OD值减去加入其它浓度各孔的OD值之差记为B，计算出各个浓度对应的B / Btl值；以标准品浓度为横坐标，以其对应的B / Btl值为纵坐标，绘制2-萘胺标准抑制曲线。根据曲线的回归方程可以求出对应样品的浓度，也可以求出2-萘胺的最小检测限IC9tl (B/Bo=90%时对应的浓度)为2. Ong/mL,IC50 (B/Bo=50% 时对应的浓度)为 14. 5 ng/mL。实施例2回收率及样品提取方法的确定
(O以新鲜彩色豆腐作为实验添加样品，依照前文所述前处理方法将其剪碎，以10.0ng/g、20. O ng/g、50. O ng/g的水平加入2-萘胺到研磨碎的新鲜彩色豆腐中,各浓度分别制备样品4份，依照上述技术方案中的样品前处理方法处理食品样品，将其中的偶氮染料还原为相应的芳香胺。同时设定一空白对照实验。(2)按照前述方法，用移液枪准确移取50 μ 样品提取液，直接加样于96孔微孔中，进行ELISA测定。(3)回收率的计算根据不同添加浓度的样品OD值计算相应的抑制率，再根据相应的抑制率从标准曲线上查到各自的浓度。检测浓度与真实浓度之比为对应浓度的回收率。结果见表I。表I添加回收率的测定
权利要求
1.ー种食品中偶氮染料的还原物2-萘胺的酶联免疫吸附检测方法，其特征在于 (1)抗原的包被 将2-萘胺与卵清蛋白OVA重氮化法偶联，并以此偶联复合物作为包被抗原，以O. 05 M、pH 9. 6的碳酸钠缓冲液稀释包被抗原，抗原稀释倍数分别为2000、4000、8000、16000倍，向酶标板的每孔中加入上述不同稀释倍数的包被液100 μ L，4°C孵育过夜，用添加有2%明胶的上述包被缓冲液作为封闭液封闭； (2)竞争反应 将免疫制备的2-萘胺多克隆抗体用抗体稀释液分别稀释1000、3000、9000倍后，カロ入酶标板中，姆孔加50 μ L,同时分别加入浓度为O ng/mL, 2 ng/mL, 5 ng/mL, 10 ng/mL, 20ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL的2-萘胺标准品，每孔加入50 μ L，37°C孵育lh，然后用PBST洗涤液置于摇床上洗涤3次，毎次3min ； 所述洗涤液PBST :为含有O. 05%吐温-20的O. 01M、pH7. 4的磷酸盐缓冲液； 抗体稀释液含O. 1%明胶的PBST溶液； (3)加酶标ニ抗 加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体GAR-HRP，用抗体稀释液进行5000倍稀释，每孔加入100 μ L，37°C温育lh，以PBST置于摇床上洗涤3次，每次3min ； (4)显色 向酶标板的各孔中分别加入100 μ L显色液，于37°C恒温箱中反应15 min，取出酶标板，向姆孔加入100 μ L终止液2 mol/L的硫酸,用酶标仪测定450nnm处的吸光值A4500
2.根据权利要求I所述的2-萘胺酶联免疫吸附检测方法，其特征在干，PBST洗涤液的配方为1000 mL蒸馏水中加入氯化钠8 g、磷酸ニ氢钾O. 24 g、磷酸氢ニ钠3. 62 g、氯化钾O.2g、和吐温-20 O. 5 mL。
3.根据权利要求I所述的2-萘胺酶联免疫吸附检测方法，其特征在于，显色液由A液和B液两种溶液构成，A液配方为9. 33 g柠檬酸，36. 8 g Na2HPO4 · 12H20,180 μ L 30%的H2O2，用超纯水定容至IL ；Β液配方为600 mg四甲基联苯胺溶于ILこニ醇，并超声振荡几分钟，然后分装使用；二者均贮于4°C冰箱中保存，使用时将A液和B液以A B=5 I的体积比混匀。
全文摘要
一种食品中2-萘胺的酶联免疫吸附检测方法，属于免疫学检测分析领域。以相同量的抗原包被到酶标板的各孔中，加入待测含2-萘胺食品样品和2-萘胺多克隆抗体后，待测样品中的2-萘胺与固相包被抗原相互竞争有限的一抗，并与之结合，当待测样品的2-萘胺浓度高时，与固相抗原结合的抗体就会减少，反应达平衡时，将上清倾出，用洗液洗涤，与固相抗原结合的抗体留在酶标板孔中，并与加入的酶标二抗反应，此时酶标二抗与被固定的抗体结合量减少，显色反应浅，酶标仪检测450nm处的OD值低，表明抑制率高；反之尔然。据所作标准曲线，算出待测样品中2-萘胺的浓度高低。本发明样品前处理过程简单、耗时少、成本低、反应条件温和、方法环保、能实现食品的大通量检测。
文档编号G01N21/78GK102680675SQ201210189970
公开日2012年9月19日 申请日期2012年6月11日 优先权日2012年6月11日
发明者匡华, 尹玉云, 彭池方, 王利兵, 王文斌, 胥传来 申请人:江南大学