专利名称：检测牛奶中氟喹诺酮类药物的胶体金试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及ー种检测氟喹诺酮类药物的试剂盒，特别是检测牛奶中氟喹诺酮类药物的试剂盒，属于免疫学范畴。
背景技术：
喹诺酮类抗菌药(4-quinolones),又称卩比酮酸类或卩比唳酮酸类,是ー类较新的合成抗菌药，该类药物的开发可以追溯到1962年,Lesher从合成抗拒药氯喹中分离出ー种副产品-萘啶酸，喹诺酮类历经40多年的发展，共开发出了四代喹诺酮类药物，共计50多种药物。喹诺酮类抗菌药以细菌的脱氧核糖核酸(DNA)为靶位，通过选择性的抑制细菌DNA促旋酶与拓扑异构酶IV而造成染色体的不可逆损害，而使细菌细胞不再分裂，主要作 用于革兰阴性菌的抗菌药物，对革兰阳性菌的作用较弱(某些品种对金黄色葡萄球菌有较好的抗菌作用)。已成为兽医临诊和水产养殖中最重要的抗感染药物之一，被大量用于治疗、预防和促生长，由于其耐药性和潜在的致癌性引起广泛的关注。在组织中，恩诺沙星的标示残留物为恩诺沙星和环丙沙星，其中以肝脏组织和肾脏组织中的残留物浓度最高，其次是肌肉和脂肪附着的皮肤组织，恩诺沙星其代谢产物环丙沙星(CIF)仍具有生物活性。氧氟沙星(OFL)其主要以原形药物的形式存在于组织中；培氟沙星(PEF)在体内代谢率接近100%，而其代谢产物是诺氟沙星(NOR)。目前，牛奶及生鲜奶中氟喹诺酮类药物残留的检测方法依据不同的检测原理，大体可分为三大类微生物受阻检测、理化检测法、免疫学分析法。微生物受阻检测方法，主要有抑菌圈试验、浑浊度试验、变色型检测金标试剂盒方法，微生物检测方法检测成本价低，但是灵敏度低、耗时长、耐药菌的存在容易导致误检；理化检测方法，是目前检测氟喹诺酮类药物主要方法，有液相色谱法、色谱/质谱联用技术、气相色谱法等，理化检测方法精确度高，但其存在检测成本高、检测设备复杂、对检测人员的要求较高、检测耗时长等缺点，目前常用的免疫学分析法，主要为酶联免疫检测法和放射免疫分析法，需要的检测费用还是较高，不适合企业低成本的检测需要。因此，在实践中有必要建立ー种敏感度高、操作简单、成本低、检测药物种类多、适合大規模推广的检测方法。
实用新型内容本实用新型的目的是提供一种灵敏度高、检测氟喹诺酮类药物种类多、成本低、操作简单、检测时间短的检测氟喹诺酮类药物的试剂盒。本实用新型的试剂盒，其包括冻干有氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂条和试纸条，试纸条由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，所述反应膜上具有包被有氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹“ I ”和包被羊抗鼠抗抗体构成的质控线印迹“ I ”。检测线和质控线平行，检测线位于距离样品吸收垫ー侧5 8mm，所述质控线位于距离检测线4 7mm，试纸条两端贴有保护膜，覆盖在吸水端上的为手柄端，覆盖在样品吸收垫上的为检测端，检测端保护膜上有MAX标记线，微孔试剂条的反应孔上具有胶塞。为了便于运输和使用，试剂盒还有固定用具及固定于其中用于盛装微孔试剂条和试纸条的试剂桶，所述试剂桶上具有密封盖。本实用新型试剂盒中试纸条底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；吸水垫为吸水纸；反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；保护膜为PE材质保护膜；试剂盒盒体为硬纸盒；试剂桶为塑料试剂桶；固定用具为硬质支撑材料。本实用新型试剂盒具有如下有益效果I.灵敏度高。氟喹诺酮类药物检测试剂盒以胶体金标记高亲和カ的单克隆抗体 为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无价健形成，二者通过异性电荷间的范德华カ相结合，胶体金对单克隆抗体特异性和亲和カ影响很小，且具有较高的标记率。其中的氟喹诺酮类药物单克隆抗体-肢体金标记物冻干在微孔试剂条中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，増加整个体系的反应灵敏度。因此，本实用新型试剂盒具有较高的特异性和灵敏度。本试剂盒对恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、培氟沙星、氟甲喹、噁喹酸、达氟沙星检测灵敏度分别为 20 μ g/L,20 μ g/L,20 μ g/L,20 μ g/L,20 μ g/L,20 μ g/L,40 μ g/L,20 μ g/L、20 μ g/L、40 μ g/L、20 μ g/L。2.操作简便快速。使用试剂盒检测时无需任何其它试剂，只要将待检样品溶液滴加于微孔试剂中，混匀后，孵育5min，将试纸标有MAX线标记端向下，插入孵育后的微孔试剂后计时，5min内观察结果。3.显示检测结果形象、直观准确。检测试纸条以显示红线色“ I ”及“ I I ”印迹作为阳性和阴性标记，即在硝酸纤维素膜上显示一条红线“ I ”印迹表示在被检测样本液中氟喹诺酮类药物的含量高于或等于试剂盒对氟喹诺酮类药物的最低检测限，两条红线“ 11 ”印迹表示在被检测样本中氟喹诺酮类药物含量低于试剂盒对氟喹诺酮类药物的最低检测限，结果判定形象、直观、准确、简单明了，不容易出现结果误判。4.成本低，投资少。使用本实用新型试剂盒，不需另配仪器设备及其他试剂，使现场检测一歩到位，成本低廉，投资少，见效快。5.易于大范围推广应用。试剂盒操作简单，能较好满足不同层次人员的需要，如专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、乳业企业等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
图I为本实用新型试纸条结构示意图；图2为本实用新型试纸条俯视图；图3为本实用新型微孔试剂图；图4. a、图4. b、图4. C、图4. d为本实用新型试纸条检测结果判定图；图5为本实用新型试剂桶结构示意图；图6为本实用新型固定用具的俯视图；[0021]图7为本实用新型盒体与固定用具的侧视图。
具体实施方式
一、氟喹诺酮类药物检测试剂盒的组装制备I)试纸条样品吸收垫I、反应膜2、吸水垫3和保护膜依次按顺序黏贴在所述底板6上，样品吸收垫的末端与反应膜始端相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，试纸两端黏贴有保护膜，保护膜7-1覆盖在吸水垫上手柄端，保护膜7-2覆盖在样品吸收垫的检测端，在检测端保护膜上印有MAX标记线，检测线4包被有氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物，质控线5包被有羊抗鼠抗抗体。 底板为PVC底板，样品吸收垫为吸滤纸，反应膜为硝酸纤维素膜，吸水垫为吸水纸，保护膜为PE材质保护膜。2)微孔试剂条微孔试剂条8具有胶塞9，板孔中冻干有氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物。3)将I)试纸条和2)微孔试剂条装入具有密封盖的塑料试剂桶10，将塑料试剂桶放置于试剂盒盒体12内的固定用具11中。ニ、试剂盒的使用待检牛奶样品溶液滴加200 μ I到微孔试剂中，混匀后，孵育5min，将试纸标有MAX线标记端向下，插入孵育后的微孔试剂后计吋，5min内观察結果。三、检测结果分析氟喹诺酮类药物在样本中的含量高于或等于试剂盒对其的最低检测限吋，氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物与氟喹诺酮类药物结合，金标抗体上的抗原结合位点被封闭，从而在检测区内因为竞争反应，不会与氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条帯。阴性样本在检测过程中由于缺少抗原抗体竞争反应，将会在检测线和质控线上出现红色条带。如图4. a、图4. b、图4. C、图4. d所示。阳性当质控线(C)显示一条红色条带，而检测线(T)不显色，试纸条以显示红线色“ I”，判为阳性，如图4. a图所示。阴性当质控线(C)显示一条红色条帯，检测线(T)同时也显示出一条红色条帯，且检测线(T)顔色接近或浅于质控线(C)时，试纸条以显示红线色为“I |”，判为阴性，如图
4.b所示。无效当质控线(C)不显示出红色条帯，则无论检测线(T)显示出红色条带与否，该试纸条判为无效，如图4. c、4. d所示。四、检测试剂盒中用到的材料制备方法I、氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物的合成与鉴定氟喹诺酮类药物是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。I)诺氟沙星衍生物合成将诺氟沙星Immol，溶于55ml三氯甲烷中，加入DCC 2mmol，DMAP催化剂适量，对氨基苯こ酸こ酯I. 5mmol,室温搅拌5h, TLC监测原料消失,过滤,将液相水洗,无水NaS2O4干燥，柱层析纯化(洗脱剂，こ酸こ酷/石油醚，1/5)。将上述产物溶于甲醇中，加NaOH O. 76g，60 V室温搅拌5h，TLC监测原料消失，减压脱溶剂，将得到的粘稠物溶于Imo 1/L NaOH溶液，调节pH3 5，こ酸こ酯萃取，干燥，柱层析纯化(洗脱剂，こ酸こ酯/石油醚，1/1)，得喹诺酮类半抗原。2)免疫原的制备-氟喹诺酮类药物与牛血清白蛋白偶联物合成取15mg诺氟沙星半抗原，溶解于ImL DMF中，取15mg EDC用O. 2ml水充分溶解后加入诺氟沙星溶解液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A。称取BSA 40mg，使之充分溶解在3mL PBS(PH 7.2)中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用
O.Olmol/L PBS 4°C透析3d姆天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。分装,于_20°C保存备用。3)包被原的制备-氟喹诺酮类药物与卵清蛋白偶联物合成 取20mg诺氟沙星半抗原，溶解于ImL DMF中，取15mg EDC用O. 2ml水充分溶解后加入诺氟沙星溶解液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A。称取OVA 30mg,使之充分溶解在3mL PBS(PH 7.2)中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用
O.01mol/L PBS 4°C透析3d姆天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。分装，于_20で保存备用。4)氟喹诺酮类药物-载体偶联物的鉴定将载体蛋白、氟喹诺酮类药物、氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物用pH7. 4的PBS配成O. 5mg/ml的溶液，以O. 01mol/L ρΗ7· 4PBS调零，用紫外分光光度计在波长200_800nm范围内扫描，得到载体蛋白、氟喹诺酮类药物、氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明氟喹诺酮类药物与载体蛋白偶联成功。2、氟喹诺酮类药物单克隆抗体的制备A.动物免疫将步骤I得到的免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150 μ g/只，使其产
生抗血清。B.细胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按9 I (数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选得到稳定分泌氟喹诺酮类药物单克隆抗体的氟喹诺酮类药物单克隆杂交瘤细胞株。C.细胞冻存和复苏将杂交瘤细胞用冻存液制成IX IO9个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。D.单克隆抗体的制备与纯化增量培养法将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37°C条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，_20°C保存。所述细胞培养基为向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20% (质量百分含量)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0. 2% (质量百分含量)；所述细胞培养基的pH为7. 4。3、羊抗鼠抗抗体的制备[0058]以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。4、氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物的制备(I)胶体金的制备用双蒸去离子水将I %氯金酸(购于sigma公司，产品目录号T09041)稀释成
O.01% (质量百分含量)，置磁力加热棒搅拌器上搅拌煮沸，每IOOml O. 01%氯金酸加入
2.5ml I %柠檬酸三钠(购于广州化学试剂厂，产品目录号BGl I-AR-01KG)，继续搅拌加热反应至液体呈红色时停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。(2)氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物的制备在磁力搅拌下,用O. 2mol/L碳酸钾调胶体金的pH值至7. O,按50 100 μ g抗体/ml胶体金的标准向胶体金溶液中加入上述氟喹诺酮类药物单克隆抗体，继续搅拌混匀30min，加入10% BSA至BSA在胶体金溶液中的终浓度为1% (体积百分含量)，静置30min。12000rpm、4°C离心30min,弃上清液,沉淀用复溶缓冲液洗漆两次,用体积为初始胶体金体积1/20的复溶缓冲液将沉淀重悬，得到的氟喹诺酮类药物单克隆抗体-肢体金标记物溶液的浓度为50 μ g单抗/ml溶液，置4°C备用。复溶缓冲液含酪蛋白、吐温-80的O. 02mol/L,pH7. 2的磷酸盐溶液，其中酪蛋白在复溶缓冲液中的终浓度为O. 05-0. I % (体积百分含量)，吐温-80在复溶缓冲液中的终浓度为O. 05-0. 15% (质量百分含量)。5、将氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上向微孔试剂微孔板中加入100 μ I氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，冷阱温度为-70°C条件下，预冻4h后，再冻干14h，即可取出，得到冻干有氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂。6、样品吸收垫的准备将样品吸收垫置于含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲液中的终浓度为O. 5%(体积百分含量))、pH为7. 2、0. lmol/L磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37°C烘2h备用。7、反应膜的制备包被过程用磷酸缓冲液将氟喹诺酮类药物-卵清蛋白偶联物稀释到10mg/mL，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线，包被量为I. Oy g/cm2 ;用O. Olmol/L、pH 7. 4PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到200 μ g/ml，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线，包被量为l.Oyg/cm2。将包被好的反应膜置于37°C条件下干燥2h，备用。
权利要求1.一种检测牛奶中氟喹诺酮类药物的胶体金试剂盒，其特征在于包括冻干有氟喹诺酮类药物单克隆抗体-肢体金标记物的微孔试剂条和试纸条，试纸条由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，所述反应膜上具有包被有氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹“ I ”和包被羊抗鼠抗抗体构成的质控线印迹“ I ”。
2.如权利要求I所述的胶体金试剂盒，其特征在于所述检测线与质控线平行。
3.如权利要求I或2所述的胶体金试剂盒，其特征在于所述的检测线位于距离样品吸收垫ー侧5 8mm，所述质控线位于距离检测线Γ7πιπι。
4.如权利要求I所述的胶体金试剂盒，其特征在于，所述试纸条两端贴有保护膜，覆盖在吸水端上的为手柄端，覆盖在样品吸收垫上的为检测端，检测端保护膜上有MAX标记线。
5.如权利要求I所述的胶体金试剂盒，其特征在于所述微孔试剂条的反应孔上具有胶塞。
6.如权利要求I所述的检胶体金试剂盒,所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料，样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸，吸水垫为吸水纸，反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，保护膜为PE材质保护膜。
7.如权利要求I所述的胶体金试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还有固定用具及固定其中用于盛装微孔试剂条和试纸条的试剂桶。
8.如权利要求书7所述的胶体金试剂盒，其特征在于所述试剂盒盒体为硬纸盒，试剂桶为塑料试剂桶，固定用具是硬质支撑材料。
9.如权利要求8所述的胶体金试剂盒，其特征在于所述试剂桶上具有密封盖。
专利摘要本实用新型提供了一种检测牛奶中氟喹诺酮类药物的胶体金试剂盒，包括冻干有氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂条和试纸条，试纸条由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，所述反应膜上具有包被有氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹“︱”和包被羊抗鼠抗抗体构成的质控线印迹“︱”。本实用新型试剂盒具有便携性好，灵敏度高，检测时间短等特点，可以在牛奶中氟喹诺酮类药物残留检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/558GK202631541SQ201220110529
公开日2012年12月26日 申请日期2012年3月22日 优先权日2012年3月22日
发明者冯才伟, 吴鹏, 冯静, 朱亮亮, 田甜, 王子健, 王建霞, 赵赫 申请人:北京勤邦生物技术有限公司