用于检测流体样品中淀粉状蛋白β寡聚体的方法及其用途
【专利摘要】本发明涉及能够可靠地并且灵敏地检测患者的生物样品中的Aβ寡聚体的选择性Aβ寡聚体免疫测定。在一个实施方案中，本发明的测定使用一对抗Aβ寡聚体的抗体，19.3和82E1，来检测和定量在脑脊液（CSF）样品中的Aβ寡聚体。本发明测定可以用于区分阿尔茨海默氏病(AD)患者与非-AD患者和/或根据其疾病的严重程度对AD患者分层。本发明测定还可以用作目标接触测定，其可以测量结合的Aβ寡聚体，作为替代终点用于评估疗效和/或目标接触。
【专利说明】用于检测流体样品中淀粉状蛋白β寡聚体的方法及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于检测生物样品中与阿尔茨海默氏病(AD)相关的淀粉状蛋白β(Αβ )寡聚体的方法。本发明还提供用于诊断和评价用于AD的治疗的方法。
技术背景
[0002]阿尔茨海默氏病(AD)是破坏性的神经变性疾病，其特征为在涉及学习和记忆的大脑区域的淀粉状蛋白β (Αβ)斑块积累。虽然一度认为这些大的不溶性斑块导致ADJM现在证据证明小的可扩散的Αβ的寡聚体可以是负责的。淀粉状蛋白衍生的可扩散的配体(ADDLs)是Αβ寡聚体的种类，其可以在体外生成，具有与内源性Αβ寡聚体类似的性质(美国专利号6，218，506; Klein,等，2004，Neurobiol.Aging 25:569-580; Lambert,等，1998; Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A..95:6448-6453)。A β 寡聚体存在于 AD 患者的脑中，它们结合神经元，并且它们诱导神经元形态学和记忆中的缺陷。用结合Αβ寡聚体的抗体的研究已经证明在神经元形态学和记忆中的改善。
[0003]虽然测量Αβ单体的测定是已知的，其利用β_和Y-分泌酶对淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的活性，但是很少的测定已报道在正常对照和AD中特异性和可靠地检测人流体样品如脑脊液(CSF)中的 Αβ 寡聚体(Georganopoulou,等，2005，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A., 102:2273-2276; Fukumoto,等，2010，FASEB T., 24:2716-2726; Gao,等，2010，PLoS One, 2010 Dec.30; 5 (12): el5725)。报道的 A β 寡聚体测定已采用了许多方法，包括偶联生物条形码PCR扩增平台的ADDL特异性抗体(Georganopoulou,等，2005)、重叠表位ELISA(Gandy,等，2010.，Ann.Neurol., 68:220-230.; Xia,等，2009，Arch.Neurol., 66:190-199),也第一次与尺寸排阻层析配对(Fukomoto等，2010),以及淀粉状蛋白亲和基质方法(Gao,等，2010; Tanghe,等，2010，Int.J.Alz.Dis.，Sep.2，pi1: 417314)，随后是低聚物的解离和用Αβ单体的抗体的测量。
[0004]从CSF或脑检测Αβ寡聚体也使用:凝胶电泳，随后是Western印迹(Klyubin等，2008，T.Neurosc1., 28:4231-4237; Hillen, 等，2010，T.Neurosc1.,30:10369-10379)，或之前是尺寸排阻层析(Shankar,等，2011，Methods Mol.Biol.,670:33-44)，取决于电泳方法后维持的寡聚体的分子量。但是，电泳和印迹技术不提供在正常对照CSF中看到这些种类所需的灵敏度(Klyubin,等，2008)。并且，Georganopoulou的发现证明A β寡聚体浓度的1000倍范围，并且将该浓度表示为fM。Αβ寡聚体种类代表了大范围的分子量，并且，因此，精确的体积摩尔浓度分配是有问题的。Georganopoulou测定是半定量的，并且展示了三个数量级的分析目标浓度范围，具有在IOOaM的更低的检测限。报道最多的方法(Georganopoulou,等 2005; Gao,等，2010; Fukumoto,等，2010;Gandy,等，2010)没有评估来自A β寡聚体相比A β单体的信号之间的选择性，所以所提到的浓度需要谨慎看待。Xia测定(Xia，等，2009，Arch.Neurol., 66:190-199)，是Immunobiological Laboratories, Inc.(Minneapolis, MN)市售的测定，宣称对于他们的A β 1-16 二聚体相比A β 40单体具有320倍的选择性，但是缺少避免与CSF中的A β单体交叉反应性所需的选择性。由于假设在CSF中的Αβ寡聚体以fM水平存在，并且CSF Αβ单体在1.5-2ηΜ之间存在，所以选择性测量CSF样品中A β寡聚体的测定对于A β寡聚体相对单体必须具有出色的选择性。
[0005]除了测量人CSFftAP寡聚体水平作为潜在的疾病生物标记物之外，Αβ寡聚体还已被用作治疗性单克隆抗体的目标以治疗AD (参见，例如，美国专利号7，811，563，7，780，963和7，731，962)。据认为，这些抗体进入CNS并将毒性的ADDL种类从脑清除，通过I)通过Fe介导的小胶质细胞的激活的催化反转,2)进入脑血管的抗体/ADDL复合物的清除，或3)在抗体结合并改善降解酶的接触后ADDLs的酶消化，所述降解酶例如脑啡肽酶、胰岛素降解酶、纤溶酶、内皮素转化酶(ECE-1和_2)、基质金属蛋白酶(ΜΜΡ-2、-3和-9)和血管紧张素转化酶(ACE)。因此，选择性的Αβ寡聚物测定的目的是在使用抗寡聚体抗体治疗或改变A β单体/寡聚体形成或清除的其它治疗之后，测量中枢神经系统A β寡聚体的药效动力学(PD)变化。此外，能特异性检测结合抗A β寡聚体抗体的A β寡聚体的测定，即目标接触(TE)测定，对于治疗后治疗性抗体的评估将是非常宝贵的。
[0006]本发明提供这样的测定，其能够可靠地并且灵敏地检测人流体样品中的Αβ寡聚体。
[0007]发明概述
本发明涉及能够可靠地并且灵敏地检测患者的生物样品，即患者的流体样品中的Αβ寡聚体的选择性Αβ寡聚体测定。本发明的测定使用一对具有高度选择性的抗Αβ寡聚体的抗体，19.3和82Ε1，来检测和定量在脑脊液(CSF)样品中的Αβ寡聚体。在一个实施方案中，本发明是选择性的Αβ寡聚物的药效动力学(PD)测定，其可以将阿尔茨海默氏病(AD)患者和非AD患者区分开来和/或根据其疾病的严重程度分层AD患者。在又另一个实施方案中，本发明是选择性的Αβ寡聚体目标接触(TE)测定，其可以测量结合的Αβ寡聚体，作为替代终点用于治疗效果的评估。
[0008]附图简述
图1A-1C是图解表示，显示抗ADDL抗体19.3结合A β寡聚体的ADDL种类(每组的中间的条)相比Αβ单体或Αβ纤维的选择性。图1A显示一组人源化的(h3B3)和亲和力成熟的抗ADDL (14.2,7.2,11.4,9.2,13.1,17.1和19.3)抗体和三个比较性抗体(比较1、2和3)对单体A β ,ADDLs和纤维A β的ELISA结合。比较性抗体2已知是对于ADDLs的非选择性的抗体。本测定的背景通过从ELISA去除捕获抗体来确定(无mAb)。误差条表示平均值的标准误差。图1B显示在板用Αβ寡聚体(▲)或Αβ单体( )包被的单面ELISA中，人源化抗体19.3的相对亲和力和最大结合特征。图1C显示竞争性ELISA和19.3对包被在ELISA板上的Αβ寡聚体(▲)和Αβ单体( )在溶液中存在竞争性种类的情况下的相对亲和力。
[0009]图2A-2C是图解表示,其显示在使用化学发光(EnVision? Multilable Reader,Perkin Elmer, Waltham, MA)作为检测方法的夹心ELISA形式中三对抗体的灵敏度和它们对Αβ寡聚体的相对亲和力。图2Α显示，描绘经Αβ寡聚体浓度范围的抗Aβ寡聚体抗体19.3作为捕获抗体和82Ε1作为检测抗体。图2Β和2C描绘6Ε10和19.3分别均作为捕获和检测抗体。19.3 X 82Ε1夹心ELISA对(图2Α)在检测Αβ寡聚体方面相比其它对(图2B和2C)显著更灵敏。
[0010]图3是使用抗-A β寡聚体抗体19.3和82Ε1对于Αβ寡聚体()相比Αβ单体(▲)的检测的灵敏度和选择性的图解表示，如使用顺磁性微粒探测器,例如Erenna?数字检测器(Singulex?，Almeda, CA)所测量的。使用顺磁性微粒探测器显著提高了用19.3/82E1抗体对检测Αβ寡聚体的灵敏度。
[0011]图4Α和4Β是在人脑脊液(CSF)样品中检测的Αβ寡聚体的水平的图解表示。图4Α显示在本文使用本发明的方法的设盲的评价中A β寡聚体水平在AD患者中比年龄匹配的对照，即非AD患者中高4倍。如采用双向t检验和Mann Whitney秩分析确定,差异是统计学显著的，达Pi0.0004，假设人群是非高斯分布的。图4B显示在本文使用本发明的方法的设盲的评价中A β寡聚体水平在AD患者中比年轻的对照，即非AD患者高8倍。使用如图4Α中相同的统计学方法，这些组之间的差异也是统计学显著的，为P-值i 0.0021。
[0012]图5A和5B是在临床证实的AD或年轻对照(B卩非AD)患者的CSF中A β单体水平的图解表示，在AD样品中具有Αβ 42单体的水平的相应的下降和不变的A β 40单体的水平。这表示对于AD患者观察到的一般模式并证实在图4Β中评价的样品的疾病状态。图5Α显示在AD CSF样品中降低的Αβ 42单体水平。如采用双向t检验和Mann Whitney秩分析确定，差异是统计学显著的，达Pi0.002，假设人群是非高斯分布的。图5B显示两组之间不变的A β 40单体水平。
[0013]图6是简易精神状态检查(MMSE)评分(作为认知表现的量度)和使用本文中本发明测定测量的Αβ寡聚体水平之间相关性的图解表示。图4Β中描绘的所有患者包括在此相关性中。在-0.7445pg/mL Αβ寡聚体的相关性是显著的，为ρ < 0.0001。
[0014]图7Α和7Β是目标接触测定的图解表示。图7Α是掺入人CSF(.)或酪蛋白缓冲液(▲)的先体外后体内形成的抗_Αβ寡聚体抗体19.3/Αβ寡聚体复合物的表示。图7Β是掺入人CSF(.)或酪蛋白缓冲液(▲)的先体外后体内形成的抗_Αβ寡聚体抗体19.3/Αβ寡聚体复合物的表示。在抗人K链(捕获)χ82Ε1 (检测)目标接触ELISA (实施例9)中19.3/Αβ寡聚体的检测中观察到差异灵敏度(Differential sensitivity)。抗κ捕获抗体很差地区分抗-A β寡聚体抗体19.3与人CSF中的内源抗体种类。
[0015]图8是使用采用小脑延髓池开口的恒河猴模型静脉内推注施用20 mg/kg剂量后，在灵长类动物(三只雄性恒河猴)脑脊液(CSF)中评估的抗-ADDL抗体19.3的PK的图解表示。在给药后约24小时，抗体19.3以100 ng/mL存在于CSF中。
[0016]图9A和9B分别是Αβ寡聚体夹心ELISA，即药效动力学(PD)测定，和Αβ寡聚体/抗体夹心ELISA，即目标接触测定的图解表示。
[0017]发明详述
申请人:在本文中提供能够可靠地和灵敏地检测在患者CSF中Αβ寡聚体的方法，用于作为Αβ寡聚体的药效动力学和目标接触测量使用。本发明的方法可以将AD患者与非AD患者区分开并基于AD患者中CNS Αβ寡聚体升高的水平分层AD疾病状态，类似于先前报道的对于 tau/AP42 CSF 比 例的用途(De Meyer,等，2010，Arch.Neurol..67:949-56)。此外，相比于对于Αβ单体的水平观察到的较差相关性，检测大部分神经毒性种类的Aβ寡聚体测定可以与认知表现中的变化更好地关联，并且是认知表现中变化的更动态的量度。 申请人:在本文第一次证明外周施用的抗Aβ寡聚体抗体可以穿透血-脑屏障并结合Αβ寡聚体，并且，当在本文中本发明的方法中使用时，可以提供用于AD疗法的评估的替代终点测定。
[0018] 申请人:在本文中已经开发了高灵敏度的测定法及其用途，所述测定法在生物样品中，即，流体样品中检测和测量神经元衍生蛋白的水平。在本发明的一个实施方案中，神经元衍生蛋白是Αβ寡聚体，并且流体样品是脑脊液(CSF)样品。本发明方法利用顺磁微粒检测在夹心ELISA中使用两种选择性的抗-Aβ寡聚体抗体。虽然Αβ寡聚体已在生物样品中，特别是在CSF中发现(Georganopoulou,等，2005 ;Klyubin等，2008),但是与已知检测方法相关的限制(包括灵敏度和选择性)尚不能实现可靠地检测，更不用说，对Αβ寡聚体定量，以用于对患者的疾病状态进行分类或用于AD疗法的开发。使用两种抗-A β寡聚体抗体19.3和82Ε1，连同顺磁微粒检测，本文 申请人:能够开发夹心ELISA测定，以在生物样品中检测Αβ寡聚体，到40 fg/mL的检测限。采用此测定，本文 申请人:证明在临床证实的AD样品中，相比年轻的或年龄匹配的对照的Αβ寡聚体高度显著性升高。这些相同的样品，用于测量A β 42和A β 40单体的水平，证实了在AD样品中与对照相比，A β 42单体被显著减少，而Aβ 40单体水平保持不变。本发明的Aβ寡聚体夹心ELISA测定表明Aβ寡聚体浓度和在广泛用于测量AD的严重程度的认知测试，称为简易精神状态检查(MMSE)中性能之间的显著的相关性；认知得分越高(最多为30的值，其是认知正常的)，CSF中的Αβ寡聚体水平越低。本发明的Αβ寡聚体夹心ELISA测定可以与额外的患者样本用于产生与已知的流体、成像和认知的生物标志物的进一步的相关性。
[0019]除了上文的药效动力学测定之外， 申请人:已经开发了对人IgG2/抗-Αβ寡聚体复合物具有选择性，使得它可以用于人CSF样品的目标接触(TE)。如在后面的实施例所述，本文所述的TE测定克服了将非天然人IgG2抗体(抗A β寡聚体，IgG2抗体)与存在于人CSF中的过多内源性IgG抗体选择性地区分的挑战。TE测定的选择性通过使用高度选择性的抗 IgG2 同种型捕获(Southern Biotech, Birmingham, AL, #9060-05)抗体而实现，所述捕获抗体能够从存在于人类CSF中内源的IgG2种类中捕获Αβ寡聚体IgG2抗体/Αβ寡聚体复合物。结合到19.3/IgG2同种型抗体的Αβ寡聚体的检测使用商业抗体，82Ε1(Immunobiological Laboratories, Inc., Minneapolis, MN)完成。这种方法能够可靠和一致地检测19.3-1gG2抗体/Αβ寡聚体复合物，无论是在缓冲液中，在用Αβ寡聚体抗体处理的动物的转基因Tg2576脑提取物中，还是掺入外源抗体和Αβ寡聚体的人CSF样品中。
[0020]为了能够获得具有独特的灵敏度的测定，来检测治疗性抗Αβ寡聚体IgG2抗体结合Αβ寡聚体的复合物，如下文药效动力学(PD)测定中所述，抗人IgG2抗体结合到磁性微粒(MP)上。MP/抗人IgG2复合物与从个体取得的CSF样品混合，所述个体用IgG2同种型(治疗性IgG2抗体)的治疗性抗Αβ寡聚体抗体给药。治疗性抗A β寡聚体抗体将结合个体的CSF样品中存在的任何Αβ寡聚体种类。此MP/抗-1gG2/抗-Αβ寡聚体/Αβ寡聚体复合物与第二抗-Αβ寡聚体抗体82Ε1混合,所述82Ε1上连接突光染料(fluor)。所述MP/抗-1gG2/抗-A β寡聚体/A β寡聚体/82El-f Iuor复合物凭借微粒的磁性性质充分清洗，并且82El-fluor复合物从微珠分离以减少背景。82El-fluor的单分子代表在给药的个体的CSF中存在的抗-A β寡聚体/Αβ寡聚体复合物的初始水平。此测定将能够证实，治疗性IgG2抗体接触Αβ寡聚体目标(图9Β)。随着治疗过程中Αβ寡聚体的清除，所述治疗性IgG2抗体将接触更少的Αβ寡聚体并从而展示减少的信号。因此，目标接触测定将能够测量对所评价的治疗性抗体的有效性。药效动力学测定(图9Α)也将展示减少的信号，其将归因于减少的Αβ寡聚体的存在，例如在治疗后。因此，对于用于AD治疗的任何疗法的有效性的评价，药代动力学测定可以用作替代终点。
[0021]本文发明是灵敏的和选择性的夹心ELISA测定，其检测并定量来自AD和人对照个体的CSF样品中的内源Αβ寡聚体。本发明测定的开发从鉴定产生对Αβ寡聚体相对Αβ单体和纤维具有选择性的抗体的小鼠杂交瘤开始。 申请人:开发的(共同未决的申请PCT/US2011/XXXXXX，要求USSN 61/364，210的优先权)并且本文称为19.3的选择性的抗_Α β寡聚体抗体，进行人源化到IgG2同种型，并进一步通过单面ELISA表征其对A β寡聚体的亲和力，具有约1.6ηΜ的EC50。对19.3抗体在溶液中和固相中对ADDLs的亲和力的进一步的评价，当以竞争性ELISA形式评价时，证明19.3对Αβ寡聚体相比对Aβ单体具有约600倍更高的选择性。19.3对于Αβ寡聚体的灵敏度和选择性表明在用于Aβ寡聚体检测的夹心ELISA中的可用性。
[0022]在夹心ELISA形式中，组合三种不同抗体如检测抗体19.3、7305 (美国专利号7，780, 963，其通过引用以其整体并入本文)和82Ε1，在它们生物素化之后，评价19.3抗体作为对于Αβ寡聚体的潜在的捕获剂。在重叠表位测试中，检验生物素化的19.3作为检测抗体并与作为捕获抗体的19.3配对。重叠表位的存在将指示具有多个表位的A β构建体，其表明二聚体或更高阶A β寡聚体的存在。19.3 X 19.3重叠表位ELISA具有对A β寡聚体的98 pg/mL的检测限(LoD)(图2C)。对于抗体对19.3和82E1 ( “19.3 x 82E1夹心ELISAO 的夹心 ELISA (图 2A)，以及 19.3 x 7305 夹心 ELISA (数据未显示)，1.3 pg/mL的(LoD),对于Αβ寡聚体的4.2 pg/mL的可靠定量限(LoRQ),并且来自Αβ寡聚体/Αβ单体的信号比例为大约1，000:1，显示该测定对于A β寡聚体相比A β 40单体选择性高1,000倍。 申请人:发现非-重叠表位测定，即19.3 X 82Ε1夹心ELISA相比最近公开的对于采用商品化Αβ抗体6Ε10的类似测定的结果更有灵敏度(图2Β)，其导致对Aβ寡聚体的98 pg/mL的检测限(Covance, Princeton, NJ) (Gandy,等，2010，Ann.Neurol., 68:220-230),并且相比采用商品化抗体82E1的重叠表位测定同等敏感(Xia,等2009，Arch.Neurol.，66:190-199) (Immunobiological Laboratories, Inc., Minneapolis, MN)。虽然使用化学发光检测进行的夹心ELISA(图2A、2B和2C)足以检测Αβ寡聚体标准品，但是先前报道的fM (fg/mL)范围内的CSF Αβ寡聚体水平表明选择性的基于ELISA的Αβ寡聚体测定将需要十至一百倍更高的灵敏度，以可靠地检测和定量CSF样品中的Αβ寡聚体。
[0023]为了增加夹心ELISA测定的灵敏度， 申请人:评价了在顺磁微粒检测系统中的两种抗体对的性能，所述顺磁微粒检测系统具体为Erenna?系统(Singulex?, Almeda, CA),利用从夹心ELISA复合物解偶联的荧光标签的检测抗体的检测。对19.3 X 82E1夹心ELISA的性能进行改善，使得19.3 X 82E1抗体对能够以相比年龄匹配的或更年轻的对照样品更高的水平检测AD CSF样品中Αβ寡聚体信号。更具体地，所述测定LoD改善了大约三十倍，达到0.04 pg/mL,而LoRQ改善了十倍,达到0.42 pg/mL。类似地，Αβ寡聚体/Αβ单体比例也改善了，达到5，000:1。如用此测定所测量的，AD CSF样品降低了 Αβ 42水平并且未改变A β 40水平，这是AD患者的特征。总之，使用顺磁微粒检测系统的19.3 χ 82Ε1夹心ELISA能够可靠并特异性地测量人CSF中的Αβ寡聚体种类。[0024]如本文所用术语“Αβ寡聚体”指Αβ单体的多聚体种类，其由于单体种类的自缔合而得到。Αβ寡聚体主要是Αβ42的多聚体，尽管Αβ40的Αβ寡聚体也已有报道。在合成的Αβ单体体外聚集之后，或从人脑或体液分离/提取Aβ种类之后，Αβ寡聚体可以包括二体、三体、四体和更高阶种类的动态范围。ADDLs是Αβ寡聚体的一个种类。
[0025]如本文所用术语“神经元源性蛋白”或“目的神经元源性蛋白”指在脑中的神经元中生成的蛋白和/或由脑中的神经元生成的蛋白，其可以通过本文的本发明测定进行测量。在本文中本发明的一个实施方案中，神经元源性蛋白是存在于人的脑脊液(CSF)样品中的Αβ寡聚体。此蛋白与其它Αβ寡聚体的区别在于，其可以在神经元以外的细胞或组织中由Αβ形成。
[0026]如本文所用术语“ADDLs”或“淀粉状蛋白-β衍生的可扩散的配体”或“淀粉状蛋白-β衍生的痴呆性配体”指包括两种或更多Αβ蛋白单体的神经毒性的、可溶的、球状、非纤维的寡聚体结构。更高阶的寡聚体结构不仅可以从Αβ 42获得，也可以从任何能够稳定形成可溶性非纤维Aβ寡聚体结构的Aβ蛋白，例如Αβ 43或Αβ 40获得。美国专利号6，218，506 和 WO 01/10900。
[0027]如本文所用术语“Αβ纤维”或“纤维”或“纤维状淀粉状蛋白”指Αβ的不溶性种类，其可以在人和转基因小鼠脑组织中检测到，这是由于它们与染料，例如硫代黄素S的双折射性。形成由Αβ单体构成的纤维状结构的Αβ种类包括β_折叠片。这些种类被认为是在AD大脑中发现的细胞外淀粉状蛋白斑结构的中间前体。
[0028]如本文所用术语“Αβ 40单体”或“Αβ 42单体”指在无细胞或细胞环境中β-分泌酶和Y-分泌酶的对淀粉状蛋白前体(APP)的酶切割(即天冬氨酸蛋白酶活性)的直接产物。β -分泌酶对APP的切割产生从Aspl开始的A β种类(编号为切割后的A β肽序列)，而Y-分泌酶释放的Aβ的C末端主要是在残基40或42。
[0029]如本文所用术语“捕获抗体”或“Α β寡聚体捕获抗体”或“抗-人IgG2捕获抗体”指在本文的测定中用作捕获抗体的抗体。如本文所用捕获抗体结合Aβ寡聚体或Aβ寡聚体/抗体复合物，其在流体样品中测量和/或检测。在本发明的一个实施方案中，所述捕获抗体是抗-Αβ寡聚体抗体19.3，并且所检测的复合物是19.3/Αβ寡聚体。在另一个实施方案中，所述捕获抗体是抗-人IgG2捕获抗体并且所检测的复合物是IgG2/19.3/Αβ寡聚体。
[0030]如本文所用术语“IgG”或“IgG2”指作为抗体分子发挥功能的任何蛋白。每个IgG由四条肽链组成一两条重链Y和两条轻链。每个IgG具有两个抗原结合位点。在人中有四个IgG亚类(IgGl、2、3和4)，按照在血清中它们的丰度顺序命名(IgGl是丰度最高的)。铰链区的结构赋予四类IgG的每一类其独特的生物学概况。
[0031]如本文所用术语“ κ轻链”指包含抗原结合结构域和恒定区两者的免疫球蛋白G(IgG)的部分。每个抗体分子具有两条轻链，其可以是κ或λ型，分别在染色体2或22上编码。两条κ轻链将在B细胞内产生，连同两条重链通过二硫键组装以形成完整的IgG抗体分子，并且被分泌以作为体液免疫防御系统的一部分发挥功能。
[0032]如本文所用术语“生物样品”或“流体样品”指相比于组织或脊椎动物的任何类型的流体。可在本文的测定中使用的典型实例是血液、尿液、泪液、唾液和脑脊液，其在本发明的一个实施方案中使用。如果存在Aβ寡聚体,也可以使用任何其它种类的体液。[0033]如本文所用术语“阿尔茨海默氏病”或“AD”或“淀粉样蛋白形成性疾病”指与大脑中Αβ斑块或神经纤维缠结形成或沉积相关的神经元退化导致的一系列痴呆或认知损伤，所述大脑来自下列疾病范围:包括但不限于唐氏综合征、路易体痴呆、帕金森氏病、临床前阿尔茨海默氏病、由于阿尔茨海默氏病的轻度认知功能障碍、早发性阿尔茨海默氏病(E0D)、家族性阿尔茨海默氏病(FAD)、由于阿尔茨海默氏病的痴呆的直通提前认知损伤(thru the advance cognitive impairment of dementia due to Alzheimer’s disease)(Jack,等，2011，Alzheimer's Dement., May 7(3):257-262),以及与ApoE4等位基因的存在有关的疾病。
[0034]如本文所用术语“LoD”的“检测限”指在除了不存在Αβ寡聚体之外相同的样品之上在可以被检测的最低浓度的测定的灵敏度。不存在Αβ寡聚体情况下的信号被定义为“背景”。如本文所用，对于Αβ寡聚体的LoD定义为在背景的平均值之上的> 3标准偏差。
[0035]如本文所用“可靠定量的下限”或“LLoRQ”指组合变异系数的测定的灵敏度，以指示可以可靠地和可重复地从背景区别的最低浓度。该限值通常定义测定在灵敏度的低端的实际工作范围，并且是，可提供跨> 3的测量值< 20%的变异系数的浓度。
[0036]选择性的抗-Ag寡聚体捕获抗体的鉴定和表征
为了开发对Αβ寡聚体选择性的和特异性的测定， 申请人:首先寻求鉴定对ADDLs (Αβ寡聚体的非纤维种类)选择性和特异性的抗体。如下生成抗ADDL的小鼠单克隆抗体，3Β3(美国专利号7811563和7780963):通过用1:1混合弗氏(第一和第二疫苗，皮下)或不完全弗氏佐剂(所有后续的疫苗接种，腹腔内)的ADDL Αβ寡聚体种类免疫小鼠。每次注射由等价于194 土 25 Pg总蛋白的纯化的ADDLs组成。来自具有最高滴度的血清的小鼠的脾脏与SP2/0骨髓瘤细胞在聚乙二醇的存在下融合，并接种到96孔板中。细胞在37°C，5% CO2,在200 μ L次黄嘌呤-氨基蝶呤胸腺嘧啶核苷(HAT)选择培养基中培养10天。培养物在第10天用补充有10%的胎牛血清(FBS)的Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基(MDM)(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)补料一次,并在第14天去除培养物上清液以使用单面ELISA筛选阳性的包含Aβ寡聚体抗体的孔(实施例？)。基于其相比Αβ单体或Αβ纤维优先结合ADDLs的能力，选择抗体3Β3用于进一步开发(图1Α)。
[0037]小鼠克隆11/3Β3转化为人IgG2抗体并命名为19.3。对编码Αβ寡聚体结合结构域的3Β3可变重链和轻链结构域区进行测序，并且产生的编码这些⑶R的cDNA引入人IgG2背景。用在pFab3D噬菌体展示载体中引入的3B3的可变重链和轻链结构域产生亲和力成熟文库。连接产物转染到大肠杆菌TGl细胞中，并且产生的噬菌体培养物上清液进行滴定，浓缩，并且制备等分试样用于噬菌体文库淘选。随后使用生物素化的Aβ寡聚体进行噬菌体文库淘选。结合生物素化的A β寡聚体的噬菌体被洗脱并再次添加到大肠杆菌TGl细胞。使用与Αβ寡聚体相同的方法(实施例1)制备生物素化的Αβ寡聚体，但是从N-末端生物素化的A β 42肽开始(American Peptide, Sunnyvale, CA)。在上述Αβ单体、Αβ寡聚体和A β纤维差异结合ELISA中，噬菌体上清液(约100μ1)直接用于分析。
[0038]从3Β3的轻链亲和力成熟文库产生的抗-A β寡聚体抗体19.3，已被描述和表征于共同未决的申请PCT/US2011/XXXXXXX，要求2010年7月14日提交的61/364，210的优先权，并且如本文所用的是分离的抗体，其包括:
具有下列序列的轻链可变区(SEQ ID NO:1)
【权利要求】
1.用于从患者获得的生物样品中确定目的神经元源性蛋白水平(NDPOI)的方法，其包括: (a)从哺乳动物获得具有NDPOI的生物样品； (b)在足以形成NDPOI/捕获抗体/MP小珠复合物的条件下，使所述生物样品与捕获抗体/顺磁微粒小珠(抗体/MP小珠)接触； (c)在足以形成POI/捕获抗体/MP小珠/检测抗体复合物的条件下，使步骤(b)的所述NDPOI/捕获抗体/MP小珠复合物与荧光标记的检测抗体接触；和 (d)检测从步骤(C)的所述复合物生成的荧光信号； 其中步骤(d)的所述荧光信号代表所述NDPOI的量。
2.权利要求1的方法，其中所述NDPOI是Αβ寡聚体。
3.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是人。
4.权利要求1的方法，其中所述捕获抗体是选自19.3、7305、82Ε1和W02的抗_Αβ寡聚体抗体。
5.权利要求1的方法， 其中所述检测抗体是选自82Ε1、7305和6Ε10的抗_Αβ寡聚体抗体。
6.权利要求1的方法，其中所述捕获抗体是19.3并且所述检测抗体是82Ε1。
7.权利要求的方法，其用于通过确定在从患者获得的生物样品中目的神经元源性蛋白(NDPOI)的水平而鉴定具有阿尔茨海默氏症的患者，其中所述NDPOI是Αβ寡聚体，并且其中具有范围为0.5 pg/mL至11 pg/mL的Αβ寡聚体水平的患者确定为具有阿尔茨海默氏症。
8.用于确定疗法治疗阿尔茨海默氏病的疗效的方法，其包括: (a)从患者获得具有目的神经元源性蛋白(NDPOI)的生物样品； (b)在足以形成NDPOI/捕获抗体/MP小珠复合物的条件下，使所述生物样品与捕获抗体/顺磁微粒小珠(抗体/MP小珠)接触； (c)在形成NDPOI/捕获抗体/MP小珠/检测抗体复合物的条件下，使步骤(b)的所述NDPOI/捕获抗体/MP小珠复合物与荧光标记的检测抗体接触；和 (d)检测从步骤(C)的所述复合物生成的荧光信号，并且其中所述荧光信号代表所述NDPOI的量； (e)对有需要的所述患者施用测试疗法； (f)从所述患者获得具有NDPOI的第二生物样品； (g)用来自所述患者的第二生物样品重复步骤(b)至(d);和 (h)比较从所述第二生物样品检测的荧光信号与来自第一生物样品的所述信号； 其中所检测的荧光信号降低代表有效的疗法。
9.权利要求8的方法，其中所述NDPOI是Αβ寡聚体。
10.权利要求8的方法，其中所述捕获抗体是19.3并且所述检测抗体是82Ε1。
11.用于确定结合目的神经元源性蛋白(NDPOI)的治疗性抗体的目标接触的方法，其包括: (a)对哺乳动物施用治疗性抗体； (b)从所述哺乳动物获得具有NDPOI的生物样品；(c)在足以形成NDPOI/捕获抗体/MP小珠复合物的条件下，使所述生物样品与捕获抗体/顺磁微粒小珠(抗体/MP小珠)接触； (d)在形成NDPOI/捕获抗体/MP小珠/检测抗体复合物的条件下，使步骤(b)的所述NDPOI/捕获抗体/MP小珠复合物与荧光标记的检测抗体接触；和 (e)检测从步骤(c)的所述复合物生成的荧光信号，并且其中荧光信号代表NDPOI/治疗性抗体的目标接触。
12.权利要求11的方法，其中所述NDPOI是Αβ寡聚体。
13.权利要求11的方法，其中所述捕获抗体是19.3并且所述检测抗体是82Ε1。
【文档编号】G01N33/53GK103782171SQ201280044598
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年7月9日 优先权日:2011年7月13日
【发明者】M.萨瓦奇, P.舒鲁埃, A.沃尔夫, A.麦坎贝尔 申请人:默沙东公司