用于制备进行检查的细胞学样品的系统和试剂盒的制作方法

用于制备进行检查的细胞学样品的系统和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及制备细胞学样品以进行检查的系统或试剂盒，其包含固定剂以固定所述样品中包含的细胞，细胞表面修饰剂以修饰所述样品中包含的细胞表面，具有至少两个面的第一样品支持装置，具有至少两个面的第二样品支持装置，其中至少一个支持装置上的至少一个面上沉积有细胞质染料或核染料(图1)。
【专利说明】用于制备进行检查的细胞学样品的系统和试剂盒
发明领域
[0001]本发明涉及细胞学样品的显微镜检查领域。
[0002]发明背景
[0003]子宫颈癌在全世界的女性中是第二位最常见的癌症，在发展中国家是导致女性因癌症死亡的主要因素。妇女中有大约30%的癌症是子宫颈癌，例如在印度每年诊断超过100，000个新病例。子宫颈癌病例的预计年复合增长率(CAGR)是2.56%，以这个增长速度在2012年将检测到大约175，000例的子宫颈癌新病例。
[0004]筛查子宫颈癌的一种推荐工具是在帕帕尼科拉乌测试(Papanicolaou test)(也称作Pap-涂片、Pap-试验、宫颈涂片或者涂片试验)中检测癌症的细胞学前体，这是用于妇科学中的一种筛查检查，用以检测子宫颈管特别是变性带中的恶化前和恶性病变。
[0005]在取Pap涂片时，使用阴道窥器从子宫颈的外口和宫颈内膜取细胞。在显微镜下检查细胞以观察异常情况。该测试目的在于检测由性传播人乳头瘤病毒导致的潜在的癌前改变。该测试仍然是早期检测癌前和子宫颈癌的一种有效的广泛使用的方法。该测试还可检测宫颈内膜和子宫内膜中的感染和异常。
[0006]这种方法在发达国家有效地降低了子宫颈癌的发生率。然而，目前的Pap染色是冗长且耗时的。此外，需要的步骤数和方法学使其整个过程非常难以自动化，而且难以在床旁(point of care setting)实施,这意味着样品不能在床旁分析,必须送至实验室分析。
[0007]发明概述
[0008]根据本发明的第一方面，提供了用于制备进行检查的细胞学样品的系统或者试剂盒。所述系统或者试剂盒包含固定所述样品中包含的细胞的固定剂，修饰所述样品中包含的细胞表面的细胞表面修饰剂，具有至少两个面的第一样品支持装置，及具有至少两个面的第二样品支持装置，其中至少一个支持装置的至少一个面上沉积有细胞质染料或者核染料。
[0009]如本文所用，“细胞学样品”被定义为来自生物体、优选哺乳动物的数量足够进行鉴别和/或分析的任何样品。细胞学样品非限制性例子包括细胞样品、皮肤样品、组织样品和粘I吴样品。
[0010]如本文所用，术语“固定剂”是指一种组合物，其可以是或者不是液体形式，其固定细胞学样品，由此使所述细胞学样品被附着于载玻片足够的时间以鉴别和/或分析该细胞学样品。
[0011]如本文所用，术语“细胞表面修饰”是指处理细胞，由此细胞是非折叠的和/或非卷曲的，和/或细胞重叠减少。在样品制备期间细胞折叠和卷曲的减少将增强细胞和形态学细节的观测，用于随后检测样品中的异常细胞，例如在子宫颈癌筛查中。
[0012]细胞重叠的减少将改善细胞分散，这特别在细胞悬浮液中是重要问题，在细胞悬浮液中细胞趋于彼此重叠，特别是非常小的并趋于聚集及位于大细胞上的多形性。一般地，这两个目的都可以通过增加细胞的表面电荷实现，使得各个细胞之间排斥增加及因此提供更好的分散。[0013]核染色是当样品沉积在所述第一样品支持装置上或者由所述第一样品支持装置覆盖时对样品中包含的细胞的细胞核染色。细胞质染色是当样品沉积在所述第二样品支持装置上或者由所述第二样品支持装置覆盖时对样品中包含的细胞的细胞质染色。
[0014]这种系统或试剂盒提供了制备细胞学样品的选项，由此样品中的细胞以适于通过显微镜观测或者适于通过自动化光学细胞分析装置分析的形式分散。因此，本发明的一个重要特征是可以对指定样品进行现场染色，即即时(Point of Care)分析。此外，不再需要在该位点制备染色溶液，因为染料以合适量预先分布在样品支持装置上。进一步地，不再需要进行复杂的方案和多步骤染色程序，并且在染色期间基本上由于灰尘和杂质所致的污染问题也被消除。再者，由于染料是以最佳染色需要的精确量分布的事实也使得例如过度染色或者染色不足等偏差最小化。
[0015]另一优势是pH条件可以容易控制，这是细胞质染色(在一些情况中酸性pH是有利的)及核染色(在一些情况中碱性PH是有利的)必需的。
[0016]其上已经沉积有染料的样品支持装置的使用使得可以在密闭环境中进行染色，SP在样品筒(cartridge)中，这进一步消除了灰尘和杂质并增加了染色程序的可再现性。
[0017]在一个优选的实施方案中，提供了第一和/或第二样品支持装置的仅一个面具有各自的染料。然而，可以有利的是第一和/或第二样品支持装置的两个面均具有染料，在这种情况中，技术人员操作该系统时不需要考虑该支持装置的哪个面面对样品。在这种实施方案中，避免了由于使用第一和/或第二样品支持装置的错误面所致人为假象。
[0018]根据本发明的第二方面，提供了一种制备进行检查的细胞学样品的方法，所述方法包括如下步骤:
[0019]用固定剂固定所述样品中包含的细胞，
[0020]用细胞表面修饰剂修饰所述样品中包含的细胞的表面，
[0021]提供具有至少两个面的第一样品支持装置，及
[0022]具有至少两个面的第二样品支持装置，其中至少一个支持装置的至少一个面上沉积有细胞质染料或核染料，
[0023]将细胞沉积在第一或者第二样品支持装置上，及
[0024]分别用第二或第一样品支持装置覆盖沉积的细胞。重要的是要理解这个方法的步骤不是必须以上述顺序进行。
[0025]因此，本发明包括使用至少一种类型的预制样品支持装置。这些预制的样品支持装置用核染料或者用细胞质染料涂覆。在本发明优选的实施方案中，核染料沉积在第一样品支持装置的至少一个面，细胞质染料沉积在第二样品支持装置的至少一个面。或者，两个样品支持装置的仅一个用染料涂覆(例如核染料)，而另一类型染料/如细胞质染料例如与固定剂和/或细胞表面修饰剂一起加入细胞悬浮液中。
[0026]在本发明优选的实施方案中，第一样品支持装置和/或第二样品支持装置是载玻片和/或盖玻片形式。
[0027]如本文所用，术语“载玻片(slide) ”是指由玻璃或塑料制成的小的透明平板，其上可以沉积样品如细胞以在光学放大装置如显微镜下检查。
[0028]如本文所用，术语“盖玻片(cover slip)”是指由玻璃或塑料制成的小的透明平板，其用于覆盖样品如细胞，之后在光学放大装置如显微镜下检查。[0029]根据一般理解，载玻片和盖玻片的大小和厚度不同。在ISO 8255-2标准下，显微镜载玻片的大小为26X76mm，厚度为1mm，而盖玻片通常大小为18X 18mm，厚度为100 -200μπ?ο然而,在本发明中，术语盖玻片和载玻片可以互换使用。特别地,在涂片制备中,在已经进行涂片之后，显微镜载玻片用于既支持样品又覆盖样品。
[0030]根据本发明另一优选实施方案，第一样品支持装置和第二样品支持装置通过铰链(hinge)彼此连接。这个实施方案进一步便于本发明的系统或试剂盒的使用。这种铰链可例如由在带有第一和第二样品支持装置的两个塑料框架之间的裁口接头(rebated joint)组成。提供这种铰链的其它可能性包括使用一片胶带连接第一和第二样品支持装置。技术人员不需要创造性步骤就能发现使用这种铰链的其它技术方案。
[0031]根据本发明另一优选的实施方案，固定剂和/或细胞表面修饰剂是以液体形式提供。优选地，固定剂包含选自如下一组的至少一种试剂:
[0032].醇
[0033]?异丙醇
[0034].醋酸(优选冰醋酸)
[0035]?甲醒，和/或
[0036].戊二醛。
[0037]甚至更优选地，所述固定剂包含包括乙醇、异丙醇和醋酸的混合物，优选体积比率为 7:2:1。
[0038]基于醇的固定剂对于细胞学涂片非常有益，因为其作用快速及提供良好的细胞核细节。优选地，使用乙醇(70%v/v)、异丙醇(70%v/v)和冰醋酸(10%v/v)的混合物。这是一种低PH混合物，可以使用缓冲液或`者控制醋酸浓度而维持。
[0039]根据另一优选的实施方案，所述固定剂包含戊二醛和磷酸盐缓冲盐水，优选2%-20%w/w的戊二醛于0.05M-1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。优选地，所述固定剂的pH为5-6.5。
[0040]根据本发明另一个优选的实施方案，所述细胞表面修饰剂包含选自如下一组的至少一种试剂:
[0041].使细胞表面具有正电荷的试剂，
[0042]?使细胞表面具有负电荷的试剂，
[0043].螯合剂，
[0044].抗凝剂，
[0045].去粘液化剂(demucifying agent),
[0046].支持细胞分散的试剂，和/或
[0047].在细胞表面产生微孔的试剂。
[0048]使细胞表面具有正电荷的试剂优选是选自聚-L-盐酸赖氨酸和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的至少一种水溶性化合物。
[0049]使细胞表面具有负电荷的试剂优选是选自硫酸葡聚糖、聚4-苯乙烯磺酸钠、聚甲基丙烯酸、羧甲基纤维素和/或聚丙烯酸钠的至少一种水溶性化合物。
[0050]重要的是要理解在溶液中产生正/负电荷的任何其它分子也可用于本发明中。然而，如果所述分子是水溶性的则是有益的。[0051]所述聚合物可以不同分子量和/或不同浓度使用。高分子量聚合物似乎更好地赋予细胞高电荷。相似地，高浓度(例如5-10mg/ml的PVP于醇固定剂中提供良好作用)示出细胞表面增加的电荷(见图5)。
[0052]所述螯合剂和/或抗凝剂优选是选自如下一组的至少一种:乙二胺四乙酸(EDTA)、羟基乙二胺三乙酸(HEDTA)、次氮基三乙酸(nitriolotriacetic acid, NTA)、朽1檬酸钠和/或草酸二钠或二甲基草酸二钠，或者其它柠檬酸盐或草酸盐。
[0053]所述去粘液化剂优选是选自如下的至少一种:氢氧化钠、N-乙酰基-L-半胱氨酸和/或次氯酸钠。优选地，所述细胞表面修饰剂包含2-5%w/vNa0H和0.25g/50ml N-乙酰基-L-半胱氨酸，或者0.5-6%w/v NaOCl。
[0054]支持细胞分散的试剂和/或在细胞表面产生微孔的试剂优选是去污剂，更优选是选自二硫苏糖醇和/或TritonX-1OO的至少一种。这些试剂的存在在细胞膜产生受控孔，使得染料快速进入细胞质和细胞核。
[0055]所述化合物支持细胞样品的适当固定、避免凝集及增强良好分散。其不影响亚甲蓝、伊红天青(EA)和橙黄G对细胞的染色(见图6)，且帮助细胞保持稳定几乎一周时间(见图7)。
[0056]特别优选的是提供一种细胞制备混合物，其包含至少固定剂和细胞表面修饰剂。或者，优选在本发明方法中，固定所述样品中包含的细胞及修饰所述样品中包含的细胞的表面的步骤是同时进行的。
[0057]在这些实施方案中，所述细胞制备混合物同时固定样品中的细胞及修饰细胞表面。
[0058]在另一优选的实施方案中，所述固定剂和/或细胞表面修饰剂可进一步包含染料。
[0059]进一步优选的是所述核染料包含选自如下一组的至少一种:
[0060].卡红
[0061]?亚甲蓝
[0062]?中性红/ 二苯乙烯红
[0063].苏木精
[0064].番红精
[0065].尼罗蓝。
[0066]同样，优选的是所述细胞质染料包含选自如下一组的至少一种:
[0067].伊红
[0068].Alician blue
[0069].二甲苯胺Hll春红(Xylidine Ponceau)
[0070].猩红(Biebrich scarlet)
[0071].Tartazine
[0072]?范吉逊染剂(Van Gieson's stain)(苦味酸和酸性品红)
[0073].赖特染剂(Wright stain)。 [0074]甚至更优选 地，可以使用染料组合，例如包含于所谓的Pap染色混合物中，其包含苏木精、橙黄G、伊红Y、微黄淡绿SF(Light Green SF yellowish)及有时包含俾斯麦棕Y (Bismarck Brown Y)的组合。
[0075]另一合适的染料组合是用于马森三色(Masson’s trichrome)中，其包含W e i g e r t ’ s苏木精、酸性品红、二甲苯胺丽春红、磷钥酸和微黄淡绿S F，或者坚牢绿FCF (Fast Green FCF)、甲基蓝、水蓝或者苯胺蓝。
[0076]另一合适的染料组合是用于利里三色(Lillie’s trichrome)中，其与马森三色相似，但是使用猩红代替酸性品红和/或二甲苯胺丽春红。
[0077]进一步地，也可以使用荧光染料如DAPI (V，6-二脒基-2-苯基吲哚)。
[0078]再者，也可以使用可商购的特殊染料组合，如由Invitrogen提供的HCS cellmask?染色试剂盒。
[0079]当样品沉积在所述第一样品支持装置上或者由所述第一样品支持装置覆盖时，所述细胞核染料对所述样品中包含的细胞的细胞核染色。当样品沉积在所述第二样品支持装置上或者由所述第二样品支持装置覆盖时，所述细胞质染料对所述样品中包含的细胞的细胞质染色。
[0080]在本发明的另一优选的实施方案中，第一和第二样品支持装置构造为由自动化装置接受以染色样品。
[0081]本发明的方法可优选进一步包含选自如下一组的至少一个步骤:
[0082]a)通过阴道镜检查详细检查子宫颈；
[0083]b)在所述生物学样品中或者在具有相应性质的新样品中进行HPVDNA测试；
[0084]c)在所述生物学样品中或者在`具有相应性质的新样品中进行生物标记测试；和/或
[0085]d)由合格的病理学家对所述生物学样品或者具有相应性质的新样品进行肉眼检查。
[0086]根据本发明另一方面，本发明的系统、试剂盒或方法用于选自如下的至少一个目的:
[0087].癌症筛查
[0088].癌症诊断
[0089].对指定治疗进行预测
[0090].同时监测指定癌症治疗。
[0091]优选地，所述细胞学样品是人样品。优选地，所述细胞学样品是子宫颈样品。然而，由于癌症发生和细胞转化的原理是普遍存在的，因此所述方法也可使用来自其它机体组织的需要进行异常检查的样品，如乳腺样品、前列腺样品、肝脏样品、肺样品、血液样品等等。
[0092]优选所述细胞学样品选自如下一组:
[0093].涂片样品
[0094].组织切片
[0095]?液体样品，和/或
[0096]?其它细胞学样品。
[0097]涂片样品例如是与帕帕尼科拉乌试验(也称作Pap-涂片、Pap-试验、宫颈涂片或者涂片试验)中使用的那些样品相似或相同。组织切片例如通过切片机提供。液体样品可优选由细胞-例如通过涂拭获得的细胞的悬浮液组成。[0098]其它合适的样品包括但不限于细针穿吸细胞学(FNAC)样品、擦试法细胞学样品和/或鳞片样脱落样品(exfoliated samples)。
[0099]在许多情况中，将样品置于载玻片上使其可进行研究，如组织切片或者涂片。然而，其它装置也可用于承载样品，例如在样品是液体样品的情况中可以使用小杯，或者在样品是擦拭样品的情况中可以使用样品筒(cartridge)。在流程图中使用的术语切片因此不限制本发明的范围。
[0100]实施例:具有核染料和细胞质染料的盖玻片和载玻片的旋涂
[0101]按照标准洁净室方案清洁载玻片和盖玻片。
[0102]1.染料制备
[0103]a)伊红 Y-Azure (EA):伊红 Y:0.23%w/v,坚牢绿 F:0.08%w/v,俾斯麦掠:0.05%w/V，磷钨酸；0.2%w/v，溶解于变性醇中；
[0104]b)橙黄G(OG):0G:0.3%w/v，磷钨酸:0.01%w/v,溶解于变性醇中；
[0105]c)亚甲蓝(MB)/甲酚紫(CV):MB:80g/l于甲醇中，CV:40g/L于甲醇中；
[0106]2.旋涂(Holmarc Spin Coater, India)
[0107]a)MB/CV 载玻片:lOOOrpm，20 秒(2OO μ I 染料);
[0108]b) EA/0G 盖玻片:3OOOrpm, 20 秒(了0 μ I 染料);
[0109]3.涂层浓度及用于涂覆的旋转速度如下:
[0110]i)盖玻片
[0111]
【权利要求】
1.制备用于检查的细胞学样品的系统或试剂盒(100)，所述系统或试剂盒包含: 固定剂，用以固定所述样品中包含的细胞， 细胞表面修饰剂，用以修饰所述样品中包含的细胞的表面， 第一样品支持装置(103)，其具有至少两个面，及 第二样品支持装置(105)，其具有至少两个面， 其中至少一个所述支持装置的至少一个面上沉积有细胞质染料或核染料。
2.制备用于检查的细胞学样品的方法，所述方法包括如下步骤: 用固定剂固定所述样品中包含的细胞， 用细胞表面修饰剂修饰所述样品中包含的细胞的表面， 提供具有至少两个面的第一样品支持装置(103)，及 具有至少两个面的第二样品支持装置(105)，其中至少一个所述支持装置的至少一个面上沉积有细胞质染料或核染料， 使细胞沉积在第一或第二样品支持装置上，及 分别用第二或第一样品支持装置覆盖沉积的细胞。
3.权利要求1 的系统或试剂盒或者权利要求2的方法，其中核染料沉积在所述第一样品支持装置的至少一个面上，并且细胞质染料沉积在所述第二样品支持装置的至少一个面上。
4.前述任何权利要求的系统、试剂盒或方法，其中所述第一样品支持装置和/或所述第二样品支持装置是载玻片和/或盖玻片形式。
5.前述任何权利要求的系统、试剂盒或方法，其中所述第一样品支持装置和所述第二样品支持装置通过铰链彼此连接。
6.前述任何权利要求的系统、试剂盒或方法，其中所述固定剂和/或细胞表面修饰剂以液体形式提供。
7.前述任何权利要求的系统、试剂盒或方法，其中所述固定剂包含选自如下一组的至少一种试剂: ?乙醇 ?异丙醇 ?醋酸(优选冰醋酸) ?甲醛 ?戊二醛。
8.前述任何权利要求的系统、试剂盒或方法，其中所述固定剂包含包括乙醇、异丙醇和冰醋酸的混合物，优选体积比率为7:2:1。
9.前述任何权利要求的系统、试剂盒或方法，其中所述固定剂包含戊二醛和磷酸盐缓冲盐水，优选2% - 20%w/w的戊二醛于0.1M-1M磷酸盐缓冲盐水中。
10.前述任何权利要求的系统、试剂盒或方法，其中所述固定剂的pH为5-6.5。
11.前述任何权利要求的系统、试剂盒或方法，其中所述细胞表面修饰剂包含选自如下一组的至少一种试剂: ?使得细胞表面具有正电荷的试剂， ?使得细胞表面具有负电荷的试剂，?螯合剂， ?抗凝剂， ?去粘液化剂； ?支持细胞分散的试剂，和/或 ?在细胞表面产生微孔的试剂。
12.前述任何权利要求的系统、试剂盒或方法，其中提供的细胞制备混合物包含至少固定剂和细胞表面修饰剂。
13.前述任何权利要求的方法，在所述方法中固定所述样品中包含的细胞及修饰所述样品中包含的细胞的表面的步骤是同时进行的。
14.前述任何权利要求的系统、试剂盒或者方法，其中所述核染料包含选自如下一组的至少一种: ?卡红 ?亚甲蓝 ?中性红/二苯乙烯红 ?苏木精 ?番红精 ?尼罗蓝。
15.前述任何权利要求的系统、试剂盒或者方法，其中所述细胞质染料包含选自如下一组的至少一种: ?伊红
?Alician blue ?二甲苯胺丽春红 ?猩红
?Tartazine ?范吉逊染剂 ?赖特染剂。
16.前述任何权利要求的系统、试剂盒或者方法，其中第一和第二样品支持装置构造为由自动化装置接受以染色样品。
17.前述任何权利要求的方法，所述方法进一步包括选自如下一组的至少一个步骤: a)通过阴道镜详细检查子宫颈； b)在所述生物学样品中或者在具有可比性质的新样品中进行HPVDNA测试； c)在所述生物学样品中或者在具有可比性质的新样品中进行生物标记测试；和/或 d)由合格的病理学家肉眼检查所述生物学样品或者具有可比性质的新样品。
18.根据选自如下一组的至少一个目的的系统、试剂盒或者方法的应用: ?癌症筛查 ?癌症诊断 ?预测指定治疗 ?同时监测指定的癌症治疗。
19.前述任何权利要求的方法、系统或者试剂盒，其中所述细胞质样品是子宫颈样品。
20.前述任何权利要求的方法、系统或者试剂盒，其中所述细胞学样品选自:?涂片样品?组织切片?液体样品，和/或?其它细胞学样品。·
【文档编号】G01N33/48GK103827654SQ201280044631
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年9月6日 优先权日:2011年9月13日
【发明者】S·库马尔, S·贾亚万特, S·K·奈克, P·凯瑟沃浦, B·查克拉巴蒂 申请人:皇家飞利浦有限公司