一种检测细胞内蛋白质降解的方法
【专利摘要】本发明属于生物化学领域，涉及一种检测细胞内蛋白质降解的方法，包括步骤：（1）利用甲硫氨酸类似物将细胞内新合成的蛋白质的甲硫氨酸标记上叠氮小分子基团，（2）在不同的时间点裂解细胞，通过CuAAC反应将特定的可被识别的分子偶联在蛋白质的叠氮小分子基团上，（3）在反应体系中直接利用均相时间分辨荧光共振原理（HTRF）对偶联了步骤（2）中可被识别的分子的目标蛋白进行定量，从而确定目标蛋白的降解速率。本方法无需同位素或细胞毒素的蛋白质降解测量新方法，并达到了与高通量筛选兼容，可用于医药产业界筛选疾病蛋白降解相关药物，以及学术界对特定蛋白降解相关信号通路的筛选等。
【专利说明】一种检测细胞内蛋白质降解的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属生物化学领域，涉及检测细胞内蛋白质降解的方法，具体涉及一种基于 CuAAC反应及能量转移均相时间分辨荧光共振的细胞内蛋白质降解的检测方法。
【背景技术】
[0002] 本领域公知，蛋白质降解其相关参数（降解速度及半衰期等）对理解蛋白质功 能、小分子调控物对蛋白的预期作用、以及针对特定疾病蛋白的降解研发药物有着重要 意义。目前，研究报道的蛋白质降解途径主要有蛋白酶体降解以及溶酶体降解两种途 径。研究显示，蛋白质通过上述两种途径的降解异常时，均可能产生疾病。例如，多种神 经退行性疾病（如亨廷顿病等）由变异蛋白的错误折叠及不正常降解引起，而增强溶酶体 或蛋白酶体对疾病蛋白的降解在疾病细胞及动物模型中显示出可以有效的治疗这些疾病 [Boxun Lu, Ismael Al-Ramahi, Antonio Valencia, Qiong Wang, Frada Berenshteyn, Haidi Yang, Tatiana Gallego-Flores， Salah Ichcho， Arnaud Lacoste， Marc Hild， Marian DiFiglia, Juan Botas & James Palacino， Identification of NUB1 as a suppressor of mutant Huntingtin toxicity via enhanced protein clearance, NATURE NEUROSCIENCE 16，562 - 570，May 2013]。近年来，有多项研究表明，溶酶体降解的不正常， 是导致多种癌症的原因之一 [Maria H0yer_Hansen and Marja Autophagy: An emerging target for cancer therapy, AUTOPHAGY 4(5), 574-580, 2008]〇
[0003] 经典的蛋白质降解检测方法主要利用同位素35S标记进行脉冲-示踪实验 (Pulse-chase)。其原理在于，利用同位素 35S标记新合成的蛋白，之后通过目标蛋白的抗体 沉淀目标蛋白，再通过电泳胶上分离得到目标蛋白的位置，最后通过同位素信号强弱随时 间变化追踪被标记目标蛋白的降解。实践显示，该经典的蛋白质降解检测方法其存在的主 要缺陷有：一、需要利用同位素，因此，对实验人员健康及安全有一定影响，并对实验室要求 较高；二、操作流程复杂，需要免疫沉淀、电泳分离等高通量不兼容的实验步骤，使得利用此 方法进行针对蛋白降解的高通量筛选变得不可能；三、由于免疫沉淀的效率受诸多因素影 响，此方法对蛋白降解速率的定量在很多情况下噪音很大，定量不精确。
[0004] 近年来有研究利用蛋白质翻译阻断剂放线菌酮研究蛋白降解，其优点是操作方 便，并且有可能进行高通量筛选；但，仍存在如下缺陷：一、放线菌酮阻断所有蛋白翻译，非 特异性强；二、放线菌酮具有很高的细胞毒性，处理9个小时即导致大规模细胞死亡，因此， 不适用于降解速度较慢的蛋白；而另一方面，事实上很多神经退行性疾病蛋白降解缓慢。
[0005] 近年来有研究公开了 CuAAC 反应（copper-catalyzed azide-alkyne cycloadditions [])被发现可以用于标记细胞内新合成蛋白，并用于研究细胞内蛋白降解 [Boxun Lu, Ismael Al-Ramahi, Antonio Valencia, Qiong Wang, Frada Berenshteyn, Haidi Yang, Tatiana Gallego-Flores， Salah Ichcho， Arnaud Lacoste， Marc Hild， Marian DiFiglia， Juan Botas & James Palacino， Identification of NUB1 as a suppressor of mutant Huntingtin toxicity via enhanced protein clearance, NATURE MWOStTBVCF 16，562 - 570,May 2013]。然而，其所用的操作流程与传统脉冲-示踪实验 相似，只是利用了叠氮小分子基团代替了同位素35S标记，因此，仍然还是不能做到高通量 及精确定量。鉴于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种新的研究蛋白质降解的有 效方法，以达到可以进行非同位素依赖的，高精度的，并与高通量筛选兼容的蛋白质降解测 量。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为克服现有技术存在的缺陷，提供一种新的研究蛋白质降解的有 效方法，具体涉及一种检测细胞内蛋白质降解的方法，尤其涉及一种基于CuAAC反应及能 量转移均相时间分辨荧光共振的细胞内蛋白质降解的检测方法。该方法可以进行非同位素 依赖的，高精度的，并与高通量筛选兼容的蛋白质降解测量。
[0007] 本发明的方法依据如下原理：利用L-azidohomoalanine和CuAAC反应，将特定 时间点被标记而未被降解的蛋白标记上特定的可被识别的分子(例如生物素）；之后，再利 用与偶联的分子特异性结合的识别化合物(例如与生物素特异性结合的链霉亲和素)，在反 应中加入荧光基团标记了的识别化合物和目标蛋白抗体，利用均相时间分辨荧光共振原理 (HTRF)，对生物素分子偶联的目标蛋白进行定量。
[0008] 具体的，本发明的一种检测细胞内蛋白质降解的方法，其包括步骤： (1) 将细胞内新合成的蛋白质的甲硫氨酸标记上叠氮小分子基团； (2) 在降解过程中的不同时间点，利用CuAAC反应将特定的可被识别的分子偶联在蛋 白质的叠氮小分子基团上； (3) 利用均相时间分辨荧光共振原理（HTRF)对偶联了步骤（2)中可被识别的分子的 目标蛋白进行定量，从而确定目标蛋白的降解速率。
[0009] 更具体的，本发明的一种检测细胞内蛋白质降解的方法，其特征在于，其包括步 骤： (1) 利用甲硫氨酸类似物L-azidohomoalanine将细胞内新合成的蛋白质的甲硫氨酸 标记上叠氮小分子基团； (2) 洗去细胞外的L-azidohomoalanine后，在不同的时间点裂解细胞，通过CuAAC反 应将特定的可被识别的分子(例如生物素）偶联在未降解的被标记了的蛋白质的叠氮小分 子基团上； (3) 在反应体系中加入荧光共振基团标记了的目标蛋白抗体以及识别化合物，利用均 相时间分辨荧光共振原理高通量高精度特异性地对目标蛋白进行定量，从而确定目标蛋白 的降解速率。
[0010] 本发明中，所述的识别化合物是指，能特异性地结合步骤（2)中通过CuAAC反应偶 联的分子基团的化合物(例如识别生物素的链霉亲和素)。
[0011] 本发明中，可用的荧光共振包括，含稀土族元素铽或铕的荧光供体标记的目标蛋 白抗体，以及XL665或D2荧光受体标记的链霉亲和素,或含稀土族元素试或铕的荧光供体 标记的链霉亲和素，以及XL665或D2荧光受体标记的目标蛋白抗体。
[0012] 本发明所需和各种生化试剂均可通过市购渠道在多家生物及化学公司购得，亦可 人工合成。
[0013] 本发明中，以生物素和与之特异性结合的链酶亲和素为例，进一步阐明本发明的 原理及步骤： 首先，利用甲硫氨酸类似物L-azidohomoalanine将细胞内新合成的蛋白质的甲硫氨 酸标记上叠氮小分子基团，将细胞在无 L-甲硫氨酸的培养液中培养一小时后，耗尽胞内处 于自由状态的甲硫氨酸，之后，加入L-azidohomoalanine将细胞内新合成蛋白中的L-甲硫 氨酸均替换成L-azidohomoalanine，达到将细胞内新合成的蛋白质标记上叠氮小分子基团 的效果；该步骤中，可使用于各种细胞； 其次，利用培养液的更换，洗去细胞外的L-azidohomoalanine，由此，含有叠氮小分子 基团的蛋白不断被细胞降解，而培养液更换后新合成的蛋白则不会被重新标记；之后，在不 同的时间点裂解细胞，通过CuAAC反应将生物素分子偶联在未降解的被标记了的蛋白质的 叠氮小分子基团上，用于下一步的检测； 第三，利用高通量药筛常用的均相时间分辨荧光共振原理（HTRF)对未降解的被标记了 的目标蛋白进行高通量的、高精度的、特异性的定量，从而准确的检测蛋白降解。
[0014] 本发明中，HTRF的原理在于利用含稀土族元素铽或铕的荧光供体及XL665或D2荧 光受体在空间距离足够接近时(约8纳米）会产生稳定的时间分辨荧光共振信号，被特定仪 器检测（如PerkinElmer生产的Envision等）。
[0015] 本发明的方法中，将目标蛋白的抗体和特异性结合生物素的链霉亲和素分别标记 上荧光供体及荧光受体，或者反之；由此，仅有既被生物素标记，又能被目标蛋白抗体特异 性结合的蛋白，产生荧光共振信号(如图2所示)，达到测量被标记蛋白降解速率的目的。本 发明的方法中，尽管从理论上说，与目标蛋白结合的蛋白会对信号产生一定的干扰，但是由 于荧光共振所学空间距离很近，随距离增加衰减很快，所以，通过结合蛋白间接产生的荧光 共振信号很弱，通常，大多数情况下影响不大。
[0016] 本方法的显著效果和优点在于： 可以进行非同位素依赖的，高精度的，并与高通量筛选兼容的蛋白质降解测量，可用于 医药产业界筛选疾病蛋白降解相关药物，以及学术界对特定蛋白降解相关信号通路的筛选 等。
[0017] 该方法在多个方面明显优于现有技术的测量细胞内蛋白质降解的方法。
[0018] 为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的一种检测细胞内蛋白 质降解的方法进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本 领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正 和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1是，甲硫氨酸类似物L-azidohomoalanine，L-甲硫氨酸的结构图。
[0020] 图2是，将目标蛋白的抗体和特异性结合生物素的链霉亲和素分别标记上荧光供 体及荧光受体，或者反之，产生的仅有既被生物素标记，又能被目标蛋白抗体特异性结合的 蛋白，产生荧光共振信号。
【具体实施方式】
[0021] 实施例1叠氮小分子基团对细胞内新合成的蛋白质的甲硫氨酸标记 在实验小鼠的STHdh等多种细胞中，甲硫氨酸是合成蛋白质的必需氨基酸。 L-azidohomoalanines是一种带有叠氮基的甲硫氨酸类似物。在数个培养皿中铺上相 同数目的细胞，用完全培养液培养24小时，移去完全培养液，用PBS洗一次。使用购自 Life Technologies公司不含甲硫氨酸的培养液对细胞进行一小时饥饿处理，使细胞内原 有的甲硫氨酸完全消耗，然后加入带有叠氮基的甲硫氨酸类似物L-azidohomoalanine， 使培养液中其终浓度为1%。，培养12小时，该12小时中细胞内新合成的蛋白质被 L-azidohomoalanine标记，从而带有叠氮基；12小时后收取第一个时间点的细胞，并将 其余培养皿中的细胞用PBS洗后换成完全培养液；之后，隔一定时间收取一皿细胞，收到 的细胞在冰上用裂解液（1% SDS in 50mM Tris-HCl, pH 8.0 with EDTA-free cocktail protease inhibitor)裂解30分钟，10%功率超声裂解产物10s, Vortex震荡产物5分 钟，18000g离心5分钟，对上清进行蛋白定量；得到在同一时间点被叠氮基标记，降解时间 可控，能反映一定时间长度内蛋白降解情况的蛋白样品。
[0022] 实施例2 通过CuAAC反应将生物素分子偶联在蛋白质的叠氮小分子基团上： CuAAC反应是指铜催化叠氮化物和端基炔发生环加成反应，利用铜离子催化标记了叠 氮基团而未被降解的蛋白质的叠氮基团与带有生物素的端基炔反应，实现蛋白质被生物素 记。
[0023] 按照购自Life Technologies公司的Click-iT Reaction Kit的具体操作步骤 进行反应。在EP管中加入最多50uL蛋白裂解液(蛋白质量上限为200ug)，加入100uL Click一iT reaction buffer,加水补至总体积 160uL, Vortex 震荡 5s，加入 10uL Click-iT Component B(CuS04), Vortex 震荡 5s,力口入 lOuL click it reaction buffer additive 1, Vortex 震荡 5s，放置 2-3 min,但不超过 5 min,加入 20uL Click-iT reaction buffer additive 2，Vortex震荡5s，将EP管置于旋转混合仪上旋转20 min反应，反应完成后在 实施例1中被叠氮基标记而未降解的蛋白质被生物素标记，在不同的时间点取得蛋白裂解 液，用于测量不同时间点降解所剩蛋白的蛋白量。
[0024] 实施例3 利用均相时间分辨荧光共振原理对生物素分子偶联的目标蛋白进行定量： 链霉亲和素（Streptavidin)和生物素（Biotin)具有特异性结合的性质，在反应中 加入荧光基团标记了的链霉亲和素和目标蛋白抗体，利用均相时间分辨荧光共振原理 (HTRF)，对未降解而被标记了的目标蛋白进行1?通量、1?精度、特异性的定量，从而准确地 检测蛋白降解。
[0025] 在384孔板中加入含有一定量被生物素标记的蛋白样，加入溶解在含400 mM氟离 子缓冲液中的含有荧光受体D2标记的链霉亲和素（Str印tavidin-D2, L 4 ng/μ 1)和铽穴 状化合物（Terbium Cryptate)标记的目标蛋白特异性抗体（2B7-Tb，0. 023 ng/μ 1)，孵育 1?2小时候后在PerkinElmer Envision仪器上检测突光共振信号，只有既被生物素标记， 又能被目标蛋白抗体特异性结合的蛋白，才会产生荧光共振信号，由此，可根据不同降解时 长蛋白样的荧光共振信号可以定量反映蛋白降解速度。
【权利要求】
1. 一种检测细胞内蛋白质降解的方法，其特征在于，其包括步骤： (1) 将细胞内新合成的蛋白质的甲硫氨酸标记上叠氮小分子基团； (2) 在降解过程中的不同时间点，利用CuAAC反应将特定的可被识别的分子偶联在蛋 白质的叠氮小分子基团上； (3) 利用均相时间分辨荧光共振原理（HTRF)对偶联了步骤（2)中可被识别的分子的目 标蛋白进行定量，从而确定目标蛋白的降解速率。
2. 按权利要求1所述的检测细胞内蛋白质降解的方法，其特征在于，所述的步骤（1) 中，利用甲硫氨酸类似物L-azidohomoalanine将细胞内新合成的蛋白质的甲硫氨酸标记 上叠氮小分子基团。
3. 按权利要求1所述的检测细胞内蛋白质降解的方法，其特征在于，所述的步骤（2) 中，洗去细胞外的L-azidohomoalanine后，在不同的时间点裂解细胞，通过CuAAC反应将特 定的可被识别的分子偶联在未降解的被标记了的蛋白质的叠氮小分子基团上。
4. 按权利要求1所述的检测细胞内蛋白质降解的方法，其特征在于，所述的步骤（3) 中，在反应体系中加入荧光共振基团标记了的目标蛋白抗体以及识别化合物，利用均相时 间分辨荧光共振原理高通量高精度特异性地对目标蛋白进行定量，从而确定目标蛋白的降 解速率。
5. 按权利要求3所述的检测细胞内蛋白质降解的方法，其特征在于，所述的可被识别 的分子是生物素。
6. 按权利要求3所述的检测细胞内蛋白质降解的方法，其特征在于，所述的识别化合 物是，能特异性地结合步骤（2)中通过CuAAC反应偶联的分子基团的化合物。
7. 按权利要求3所述的检测细胞内蛋白质降解的方法，其特征在于，所述的识别化合 物是识别生物素的链霉亲和素。
8. 按权利要求4所述的检测细胞内蛋白质降解的方法，其特征在于，所述方法中，可用 的突光共振包括，含稀土族元素试或铕的突光供体标记的目标蛋白抗体，以及XL665或D2 荧光受体标记的链霉亲和素，或含稀土族元素试或铕的荧光供体标记的链霉亲和素，以及 XL665或D2突光受体标记的目标蛋白抗体。
【文档编号】G01N21/64GK104155452SQ201310179334
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2013年5月15日 优先权日:2013年5月15日
【发明者】鲁伯埙, 崔笑添 申请人:复旦大学