一种系统性红斑狼疮自身抗体检测装置制造方法
【专利摘要】本发明提供了一种系统性红斑狼疮自身抗体检测装置，包括芯片、试剂盒，所述试剂盒内设置有多孔板，所述芯片位于多孔板的板孔中，所述芯片上按照点阵排列固定有对照品、抗原蛋白。本发明所述检测装置能够缩短SLE的检测时间，降低检测成本，减少患者血清使用量，提高SLE的临床诊断效率。
【专利说明】一种系统性红斑狼疮自身抗体检测装置
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学领域，具体来说，涉及一种系统性红斑狼疮自身免疫抗体检测装置。
【背景技术】
[0002]系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus,简称SLE),是一种常见的慢性自体免疫性疾病。该病的特征是机体可产生自身抗体，从而导致皮肤损伤和器官功能障碍，可累及的器官包括心脏、肝、肾脏、肺、皮肤、血管、关节以及神经系统等。SLE从发病到确诊往往需要几年的时间，虽然目前还不能完全治愈，但早期诊断对减缓其发展是很重要的。由于SLE是由多种因素导致的，并常伴随有其它自身免疫性疾病，因此诊断该疾病需要进行多项检测，其中，SLE自身抗体的检测具有非常重要的意义。
[0003]与SLE相关的自身抗体主要有抗dsDNA抗体和抗Sm抗体，此外，还包括抗核糖体P蛋白，抗PCNA、Ul-nRNP、SS-A, SS-B等抗体。其中，抗dsDNA抗体的靶抗原是双螺旋DNA，该抗体可与DNA结合成为免疫复合物在肾小球基底膜沉积，或直接作用于肾小球抗原造成肾损伤。目前，抗dsDNA抗体具有较高的特异性，且与SLE的活动相平行，已被列为SLE的诊断标准之一。抗Sm抗体属于抗核抗体,也是一种SLE的高特异性抗体。抗核糖体P蛋白抗体是SLE的特异性抗体，其他疾病和正常人中很少见。抗PCNA抗体(抗增殖细胞核抗原抗体)是一种协调DNA复制的核蛋白，对SLE的诊断有着很高的价值。抗Ul-nRNP抗体(抗小核核糖核蛋白复合物抗体)在30-40%的SLE患者中可检出，且大多患者血清中同时伴有抗Sm抗体的出现。抗SS-A抗体与各类自身免疫性疾病相关，在100%的新生儿SLE患者中可出现。抗SS-B抗体见于10-20%的女性SLE患者。
[0004]目前，SLE的诊断通常采用免疫荧光或ELISA方法，分别选取若干上述SLE自身抗体作为检测指标，再根据经验对结果进行分析。该方法存在以下缺点:1、检测指标的选取和结果分析中，存在较多的人为因素，不具有普遍性，准确性也有待提高；2、一次只能分析一种检测指标，效率低，诊断时间长，费用较高。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种准确高效、成本低廉的系统性红斑狼疮自身抗体检测装置。
[0006]为实现本发明目的，本发明提供了一种系统性红斑狼疮自身抗体检测装置，包括:芯片、试剂盒，所述试剂盒内设置有多孔板，所述芯片位于多孔板的板孔中，所述芯片上按照点阵排列固定有对照品、抗原蛋白。
[0007]本发明所述对照品包括抗原稀释液、含量为40-60Pg/mL的羊抗人IgG、含量为28-35 Pg/mL的人IgG、含量为10_14Pg/mL的人IgG ;所述抗原蛋白包括dsDNA、sm、P。、P1,P2、PCNA、Ul-snRNP68/70、U-snRNP BB\ Ul-snRNP C, Ul-snRNP A, Ro/SS-A 52KD、Ro/SS-A60KD、La/SS-B、nucleolin。[0008]本发明所述抗原蛋白，其含量如下:dsDNA 0.3-0.4mg/mL> sm 0.1-0.2 mg/mL、P0 0.3-0.4mg/ mL、P1 0.12-0.18mg/mL、P2 0.3-0.5 mg/ mL、PCNA 0.25-0.3mg/mL、Ul-snRNP68/70 0.16-0.28 mg/mL, U-snRNP BB，0.13-0.28mg/mL、Ul-snRNP C0.15-0.2mg/ mL、Ul-snRNP A 0.25-0.35 mg/mL,Ro/SS-A 52KD 0.15-0.2 mg/mL,Ro/SS-A60KD 0.1-0.15 mg/ mL> La/SS-B 0.15-0.2 mg/ mL、nucleolin 0.1-0.15 mg/ mL
本发明所述试剂盒中还配置有样本稀释液、浓缩洗液、酶标二抗、显色剂。
[0009]本发明所述样本稀释液为pH7.4的磷酸盐缓冲液，其中含有质量浓度为1%的BSA、质量浓度为0.05%的Proclin300 ;所述浓缩洗液，其成分以质量体积比浓度计为:NaC18%、KC10.2%, Na2HPO4 2.135%、KH2PO4 0.24% ;所述酶标二抗为HRP标记的山羊抗人IgG，所述显色剂为沉淀型TMB。
[0010]本发明所述芯片，其材质最好为醋酸纤维素膜。
[0011]本发明所述抗原蛋白在检测SLE自身抗体时，具有优良的特异性和灵敏度。本发明以抗原稀释液为阴性对照点、羊抗人IgG为阳性反应对照点、高浓度人IgG为阳性显示对照点、低浓度人IgG为阴性显示对照点；实验时，阴性对照点不与血清样本反应，最终不显色；而对于阳性反应对照点，无论血清样本中是否含有SLE相关抗体，只要加入血清，其中的IgG就能与羊抗人IgG反应最终显色。阳性和阴性显示对照点是芯片的判读标准点，显色程度低于阴性显示对照点即为阴性，高于阳性显示对照点即为阳性，显色程度介于两者之间即为弱阳性。当仅有一种抗体阳性时，建议考虑其他临床表现做相应诊断。本发明对照品的设置使检测结果更容易判读，从而能够方便地得出样本血清中SLE自身抗体的表达情况。检测时，将样本血清稀释后使其与芯片反应，芯片上的抗原蛋白即可捕获血清中相应的SLE自身抗体，通过加入酶标二抗与已被捕获在芯片上的SLE自身抗体结合，再加入可与酶标二抗反应的显色剂，就可以将血清中的SLE自身抗体的情况显示在膜芯片上。反应原理示意图见附图3-5。
[0012]本发明的芯片具有高集成性，以酶联免疫反应为基础，将14种SLE相关蛋白点制在一个芯片上，可同时获得多项检测指标，为SLE的临床诊断提供了更多的参考。与分别检测各项指标相比，减少了实验操作，缩短了检测时间，便于进行大批样本的筛查，同时节约了成本，也减少了患者血清的使用量，从而极大地提高了 SLE临床诊断的效率。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为芯片内对照品和抗原蛋白的分布不意图。
[0014]图1中，数字f 14及汉字阳、阳’、阴、阴’的含义为:阳:阳性反应对照-羊抗人 IgG ；阴:阴性反应对照-抗原稀释液；1:dsDNA ；2:sm ；3:P0 ；4 =P1 ；5:P2 ；6 =PCNA ；7:Ul-snRNP 68/70 ；8:U_snRNP BB’；9:Ul_snRNP C ；10:Ul_snRNP A ；11:Ro/SS-A(60KD)； 12:Ro/SS-A (52KD) ；13:La/SS_B ；14:nucleolin ;阳’:阳性显示对照-高浓度人 IgG ;阴’:阴性显示对照-低浓度人IgG。
[0015]图2为每张醋酸纤维素膜上芯片阵列的排布示意图。
[0016]图3为SLE自身抗体检测原理示意图。
[0017]图4为阳性反应对照原理示意图。
[0018]图5为显示对照原理示意图。[0019]图3飞中:1、酶标二抗，2、膜载体，3、被测抗体，4、抗原，5、人IgG，6、羊抗人IgG。
[0020]图6为多孔板中芯片分布示意图。
[0021]图6中:7、多孔反应板，8、膜芯片。
[0022]图7为SLE患者血清检测结果示意图。
【具体实施方式】
[0023]下面用具体实施例来进一步说明本发明的内容，但并不以任何方式意味着对本发明进行限制。下列实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0024]实施例1 (一)芯片的制作:
步骤1:将0.2Mffl孔径的醋酸纤维素膜裁剪至25cmX 75cm，放置在点样仪的卡槽中。
[0025]步骤2:在室温、相对湿度60%的条件下，使用德国Gesim公司NanoPlotter2.1型点样仪，将 14 种抗原蛋白(dsDNA、sm、P。、P1' P2、PCNA、Ul_snRNP68/70、U-snRNP BB，、Ul-snRNP C, Ul-snRNP A, Ro/SS-A 52KD, Ro/SS-A 60KD、La/SS-B、nucleolin)和 4 种对照品(阴性反应对照-抗原稀释液、阳性反应对照-羊抗人IgG、阳性显示对照-高浓度人IgG、阴性显示对照-低浓度人IgG)按照阵列排布点制在醋酸纤维素膜上。各抗原蛋白和对照品的点样位置见附图1，点间距0.7mm,点制量约10nL，每种样品重复喷点3次，每横排点制两种蛋白，阵列呈6X9排布，构成一个芯片，见附图1。每张醋酸纤维素膜上点制16个芯片，芯片位置分布见附图2。点制完成后，在室温放置过夜使蛋白充分固定于醋酸纤维素膜上。
[0026]步骤3:将点样后的醋酸纤维素膜置于含有1%BSA，2%蔗糖的封闭液中，在室温下振荡1.5h,取出，室温干燥。
[0027]步骤4:将芯片按照点制位置裁下，得到1.0cmX 1.0cm的芯片，然后将所得芯片分别放置在24孔多孔板的板孔中，见附图6，于4°C下保存。
[0028]上述芯片上，所述抗原蛋白的含量如下:dsDNA 0.3-0.4mg/mL> sm 0.1-0.2 mg/mL、P0 0.3-0.4mg/ mL、P1 0.12-0.18mg/mL、P2 0.3-0.5 mg/ mL、PCNA 0.25-0.3mg/mL、Ul-snRNP68/70 0.16-0.28 mg/mL, U-snRNP BB，0.13-0.28mg/mL、Ul-snRNP C0.15-0.2mg/ mL、Ul-snRNP A 0.25-0.35 mg/mL,Ro/SS-A 52KD 0.15-0.2 mg/mL,Ro/SS-A60KD 0.1-0.15 mg/ mL、La/SS-B 0.15-0.2 mg/ mL、nucleolin 0.1-0.15 mg/ mL。所述对照品的含量如下:阳性反应对照-羊抗人IgG 40-6( g/mL、阳性显示对照-高浓度人IgG28-35 Pg/mL、阴性显示对照-低浓度人IgG 10_14Pg/mL。
[0029](二)试剂的配制:
样本稀释液:含l%BSA+0.05防腐剂(Proclin 300)的磷酸盐缓冲液(pH7.4)。每个试剂盒配备25mL。
[0030]浓缩洗液:NaCl8g ,KCl 0.2g, Na2HPO4 2.135g, KH2PO4 0.24g,溶于 IOOmL 水中，每个试剂盒配备20mL。使用时稀释10倍。
[0031]酶标二抗:HRP标记的山羊抗人IgG。
[0032]显色试剂:沉淀型TMB。
[0033]将上述多孔板、样本稀释液、洗液、酶标二抗、显色试剂放置于试剂盒中，得到本发明所述系统性红斑狼疮自身抗体检测装置。
[0034]实施例2
SLE自身抗体的检测:
样本准备:采用实施例1制备的系统性红斑狼疮自身抗体检测装置中的样本稀释液，将系统性红斑狼疮患者的血清样本按1:500稀释，得到稀释后的样本；
样本反应:取稀释后的样本lmL，加入多孔板的板孔中，与芯片孵育反应，加盖，于室温振荡1.5h ；
漂洗:将浓缩洗液用蒸馏水稀释10倍，得到漂洗液，将板孔中的液体吸走，加入漂洗液ImL,振荡5min后，吸走液体,重复漂洗两次；
酶标二抗结合:采用上述漂洗液，将HRP-山羊抗人IgG以1:1000稀释后，向每个板孔中加入lmL，室温振荡1.5h，吸走液体，再加入漂洗液lmL，室温振荡漂洗3次；
显色:加入沉淀型TMB显色剂，室温反应lOmin，观察反应结果。检测结果的示意图见图7。其中，阳性反应对照点显示较深的蓝色，阴性反应对照点不显色，阳性显示对照点显示较深的蓝色(与阳性反应对照点相同)，阴性显示对照点显示较弱的蓝色。其他检测点显示颜色若> 阳性显示对照则判读为强阳性，若显示颜色介于阴性显示对照和阳性显示对照之间判读为弱阳性，监测点显示颜色<阴性显示对照则判读为阴性。芯片上，前6种抗原蛋白特异性较高，对系统性红斑狼疮的诊断意义重大，后6种抗原对应的抗体在其他自身免疫性疾病中也有出现，可作为辅助诊断的参考指标。
[0035]实施例3
收集某三甲医院风湿免疫科以SLICC系统性红斑狼疮标准确诊的SLE患者的血清23份，体检正常人的血清30份，应用本发明所述的系统性红斑狼疮自身抗体检测装置，参照实施例2所述方法进行检测。检测结果显示，阳性样本的检出率为19/23=82.6%，阴性样本的检测符合率30-2/30=93.3%(两例样本均检出dsDNA阳性)。在国际风湿病学会制定的系统性红斑狼疮诊断标准中，11项参考指标中仅有2项涉及抗体异常,疾病的诊断还需要参考多项患者临床症状，因此通过本发明的检测装置可筛查出80%以上的疾病患者，表明该检测装置已经能够为临床诊断提供有效的辅助。
[0036]实施例4
抗原蛋白点样浓度的设置:
将本发明所述14种抗原蛋白以及人IgG和羊抗人IgG分别梯度稀释成7个浓度(0.1-1.2mg/mL不等)，分别点制在膜芯片上，之后与20份SLE阳性血清反应，显色后获得灰度值。对于每种抗原蛋白来说，每个抗原蛋白浓度值与其所对应的20个灰度值的平均值可做成回归直线。在14份抗原蛋白浓度-灰度曲线上，选取各自线性范围共有的某一最佳灰度值作为阳性显示对照点的灰度Cutoff值，该灰度值对应的抗原蛋白浓度即为14种抗原蛋白的最佳点样浓度，此灰度值对应在人IgG的浓度-灰度曲线上，即可获得阳性显示对照的点样浓度。同理获得阳性反应对照的点样浓度。
[0037]对于阴性显示对照浓度的确定参照以下方法:用上述确定好的抗原蛋白浓度点制芯片，并点制梯度浓度的人IgG，使用20份健康体检人群的血清进行芯片反应，获得阴性反应的显色灰度值，计算均值，综合考虑标准差和变异系数的情况下得出阴性Cutoff值，通过对应人IgG的浓度-灰度曲线，得到阴性显示对照点人IgG的点样浓度。
【权利要求】
1.一种系统性红斑狼疮自身抗体检测装置，其特征在于包括:芯片、试剂盒，所述试剂盒内设置有多孔板，所述芯片位于多孔板的板孔中，所述芯片上按照点阵排列固定有对照品、抗原蛋白。
2.根据权利要求1所述系统性红斑狼疮自身抗体检测装置，其特征在于:所述对照品包括抗原稀释液、含量为40-60μg/mL的羊抗人1gG、含量为28-35 Pg/mL的人IgG、含量为 10-14Pg/mL 的人 1gG ;所述抗原蛋白包括 dsDNA、sm、P、P1' P2、PCNA, Ul_snRNP68/70、U-snRNP BB’、Ul-snRNP C、Ul_snRNP A、Ro/SS_A 52KD.Ro/SS-A 60KD、La/SS-B、nucleolin。
3.根据权利要求2所述系统性红斑狼疮自身抗体检测装置，其特征在于:所述抗原蛋白，其含量如下:dsDNA 0.3-0.4mg/mL、sm 0.1-0.2 mg/mL、P0 0.3-0.4mg/ mL、P10.12-0.18mg/mL、P2 0.3-0.5 mg/ mL、PCNA 0.25-0.3mg/ mL、Ul_snRNP68/70 0.16-0.28mg/mL、U-snRNP BB，0.13-0.28mg/mL、Ul-snRNP C 0.15-0.2mg/ mL、Ul-snRNP A0.25-0.35 mg/mL、Ro/SS-A 52KD 0.15-0.2 mg/mL、Ro/SS-A 60KD 0.1-0.15 mg/ mL、La/SS-B 0.15-0.2 mg/ mL> nucleolin 0.1-0.15 mg/ mL。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述系统性红斑狼疮自身抗体检测装置，其特征在于:所述试剂盒中还配置有样本稀释液、浓缩洗液、酶标二抗、显色剂。
5.根据权利要求4所述系统性红斑狼疮自身抗体检测装置，其特征在于:所述样本稀释液为PH7.4的磷酸盐缓冲液，其中含有质量浓度为1%的BSA、质量浓度为0.05%的Proclin300 ;所述浓缩洗液，其成分以质量体积比浓度计为=NaCl 8%、KCl 0.2%、Na2HPO42.135%,KH2PO4 0.24% ;所述酶标二抗为HRP标记的山羊抗人IgG，所述显色剂为沉淀型TMB。
6.根据权利要求5所述系统性红斑狼疮自身抗体检测装置，其特征在于:所述芯片，其材质为醋酸纤维素膜。
【文档编号】G01N33/68GK103439517SQ201310411463
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月11日 优先权日:2013年9月11日
【发明者】刘薇, 修贺明 申请人:河北省健海生物芯片技术有限责任公司