正心泰片指纹图谱的建立方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及正心泰片指纹图谱的建立方法和应用。包括将正心泰片样品用溶剂提取制备样品的供试液，在一定的色谱条件下测试供试液液相色谱指纹图谱，并通过丹参酮ⅡA，葛根素两个指标性成分的含量作为质控标准来控制正心泰片的质量，从而达到控制正心泰片药品质量的目的。实验证明，本发明的指纹图谱多成分控制药品质量在药品生产中能起到很好的质量控制作用，是一种评价中药复方制剂生产质量的关键技术。
【专利说明】正心泰片指纹图谱的建立方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于药物分析检测领域，涉及一种正心泰片指纹图谱的建立方法和应用。【背景技术】
[0002]随着现代药物分析技术的发展，指纹图谱技术是当今国际公认的控制中药质量的质控模式，它在原药材的栽培、引种，中成药生产工艺的规范与优化，产品质量标准的制定等方面都提供全方位的质量保证。
[0003]近年来，国外对中草药产品的质量评价也在提倡指纹图谱。随着各种分析技术的创新和提高以及计算机应用技术的不断发展，世界各国对天然药物的了解和研究在不断深入，中药指纹图谱技术在国内已成为一种发展趋势，其研究的方法和技术更趋成熟完善，成为公认的控制中药和天然药质量最有效的方法和手段。日本汉方药在20世纪80年代就采用高效液相指纹图谱控制质量。欧共体也将指纹图谱监控技术应用于植物药质量控制，美国食品药品管理局(FDA)允许草药保健品申报资料时提供色谱指纹图，要求植物药在质量控制方面，必须制定指纹图谱的检测标准。世界卫生组织在1996年草药评价指导原则中规定:如果草药的活性成分不明，可以提供色谱指纹图以证明产品质量的一致性。英国、印度、加拿大等国家在植物药的研究中，也对指纹图谱十分重视。在许多国家的药典中，色谱指纹图谱已成为主要的分离分析方法。目前，国外许多研究机构对中药指纹图谱的研究主要为建立指纹图谱与药效的相关性研究，是以中药理论和新药研发研究体系为主的模式。
[0004]心脑血管疾病是严重危害人类的常见疾病。近年来，由于社会的发展，工作、生活、饮食结构及环境等的变化，心脑血管疾病呈上升趋势。近年来的研究发现，单味植物中药含有许多种化学成分，由数味药组成的中药复方，其化学成分就更加复杂，中药化学成分的复杂性，决定了它们有多靶点作用。由于复方的质量控制方法不够全面，难以全面的控制复方质量及药物疗效。因此，本研究针对正心泰片的质量控制方法进行改进，为进一步更好的治疗心脑血管疾病提供保障。
[0005]正心泰片是由黄芪、葛根、槲寄生、丹参、山楂、川芎制成的片剂制剂，临床上用于治疗冠心病、心绞痛各类疾病等，功能是补气活血，通脉益肾，其效果已经得到临床的验证，而是否能够保证药物的质量以及正心泰片中有效成分的含量，是决定正心泰片疗效的基础。如果单纯用丹参的活性成分来说明正心泰片的内在质量，具有一定的片面性。要控制正心泰片的功效，必须对它的物质群整体予以控制。现在，对丹参中活性成分丹参酮、丹酚酸的测定方法较多，对葛根中活性成分葛根素测定方法较多，但如何能够用一种方法同时控制复方中多种药材的有效成分含量，从更宏观的角度对正心泰片片剂制剂进行质量控制的宏观质量控制方法尚未见报道。因而获得一种有效控制正心泰片质量的方法一直是业内追求的目标。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供正心泰片指纹图谱的建立方法和应用，通过此测定方法，可控制正心泰片质量。
[0007]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的，一种正心泰片指纹图谱的建立方法，其特征在于，采用液相色谱法检测正心泰片中丹参酮II A、葛根素的含量；所述液相色谱的条件如下:
[0008]色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶TC-C18为填充相；
[0009]流动相:体积比9:91-59:41的乙腈和水溶液，进行梯度洗脱；
[0010]流速:0.5-1.5mT,/min ；
[0011]柱温:25-40°C ;
[0012]紫外检测波长:271nm ;
[0013]理论塔板数按葛根素计算，应不低于4000-6000。
[0014]上述正心泰片指纹图谱的建立方法，具体包括如下步骤:
[0015]S1、制备对照品溶液:取丹参酮II A、葛根素，加甲醇制成每ImL含0.16mg丹参酮
IIA、0.084mg葛根素的溶液；
[0016]S2、制备供试品溶液:取正心泰片，除去包衣，研细；以一克粉末，加20ml含30%甲醇的乙酸乙酯溶液；超声处理后，补足溶剂重量；0.45um微孔滤膜过滤，获得所述供试品溶液；
[0017]S3、测定:吸取所述对照品与所述供试品溶液各5yL，注入液相色谱仪，进行测定，得到指纹图谱。
[0018]其中，步骤S3中液相色谱的条件如下:
[0019]色谱柱:Agilent250mmX4.6mm，5 u m ;
[0020]流速:lmL/min;
[0021]柱温:25°C。
[0022]优选方式下，步骤S2中超声处理的参数为:功率250W，频率25kHz，处理20分钟。
[0023]此外，所述梯度洗脱程序按如下体积比设置进行:
[0024]0分钟时，流动相为9%的乙腈和91%的水溶液；
[0025]10分钟时，流动相为10%的乙腈和90%的水溶液；
[0026]15分钟时，流动相为11%的乙腈和89%的水溶液；
[0027]40分钟时，流动相为11%的乙腈和89%的水溶液；
[0028]42分钟时，流动相为17%的乙腈和83%的水溶液；
[0029]105分钟时，流动相为59%的乙腈和41%的水溶液。
[0030]所述建立的指纹图谱中包括20个特征峰，其中峰2为葛根素，峰20为丹参酮II A0
[0031]本发明还提供了一种上述权利要求所述正心泰片指纹图谱建立方法的应用，建立的指纹图谱用于检测正心泰片的质量。
[0032]本发明以正心泰片中有效成分丹参中丹参酮II A，葛根中葛根素为主建立起来的HPLC指纹图谱，代表着正心泰片大部分药理活性，能有效地表征正心泰片的质量。从而实现对正心泰片最大可能的化学成分进行检测，有利于对中药质量的全方面监控。
[0033]以正心泰片中丹参葛根各有效成分指纹图形作为一个整体看待，避免了因只测定一个药材而判定正心泰片整体质量的片面性，又减少了为质量达标而认为处理的可能性。本发明为完整、准确评价正心泰片的质量提供了新的对照标准，将为提高正心泰片及其他以丹参、葛根为主要成分制剂的质量及疗效做出贡献。
[0034]本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。
[0035]本发明正心泰片的检测方法，是通过大量实验所得到的切实可行的方法，具有重复性。可通过将上述方法测定方法建立的正心泰片指纹图谱作为标准指纹图谱，其测定方法可作为含有丹参、葛根制剂有效成分测定的标准指纹图谱，以鉴定其有效成分。
[0036]本发明结合液相色谱指纹图谱发展潮流，找到了合适的正心泰片指纹图谱检测方法，包括将正心泰片样品用溶剂提取制备样品的供试液，在一定的色谱条件下测试供试液液相色谱指纹图谱，并通过丹参酮II A，葛根素两个指标性成分的含量作为质控标准来控制正心泰片的质量，从而达到控制正心泰片药品质量的目的。实验证明，本发明的指纹图谱多成分控制药品质量在药品生产中能起到很好的质量控制作用，是一种评价中药复方制剂生产质量的关键技术。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1是正心泰片HPLC指纹图谱。
[0038]图2是混合对照品HPLC指纹图谱。
【具体实施方式】
[0039]本发明正心泰片指纹图谱的建立方法，其中高效液相色谱的条件如下:色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充相；流动相为体积比为9:91-59:41的乙腈和水溶液进行梯度洗脱；流速:0.5-1.5mL/min ;柱温:25-40°C ;紫外检测波长:271nm ;理论塔板数按葛根素计算，应不低于4000。
[0040]优选地，所述方法还包括通过以下方法制备对照品溶液:取丹参酮II A，葛根素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每ImL含0.16mg的丹参酮II A，0.084mg的葛根素溶液，作为对照品溶液。
[0041]优选地，所述方法还包括通过以下方法制备供试品溶液:取正心泰片，除去包衣，研细，约1.0g，精密称定，加20ml含30%甲醇的乙酸乙酯溶液，称重，超声处理(功率250W，频率25kHz) 20分钟，补足重量，0.45 um微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。
[0042]在一个优选的实施方案中，本发明提供的方法包括如下步骤:
[0043](I)对照品溶液的制备:取丹参酮II A，葛根素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每ImL含0.16mg的丹参酮II A，0.084mg的葛根素溶液，作为对照品溶液；
[0044](2)供试品溶液的制备:取正心泰片，除去包衣，研细，约1.0g，精密称定，加20ml含30%甲醇的乙酸乙酯溶液，称重，超声处理(功率250W，频率25kHz) 20分钟，补足重量，
0.45 um微孔滤膜过滤，作为供试品溶液；
[0045](3)测定:精密吸取对照品与供试品溶液各L，注入高效液相色谱仪，根据以下色谱条件进行测定，得到指纹图谱:
[0046]色谱柱:AgilentTC-C18 (250mmX 4.6mm, 5 u m);
[0047]流动相:体积比为9:91-59:41的乙腈和水溶液，进行梯度洗脱；
[0048]流速:lmL/min;
[0049]柱温:25°C;[0050]紫外检测波长:271nm。
[0051]优选地，所述梯度洗脱程序按如下体积比设置进行；
[0052]0分钟时，流动相为9%的乙腈和91%的水溶液；
[0053]10分钟时，流动相为10%的乙腈和90%的水溶液；
[0054]15分钟时，流动相为11%的乙腈和89%的水溶液；
[0055]40分钟时，流动相为11%的乙腈和89%的水溶液；
[0056]42分钟时，流动相为17%的乙腈和83%的水溶液；
[0057]105分钟时，流动相为59%的乙腈和41%的水溶液；
[0058]优选地，所述建立的指纹图谱中包括20个特征峰，其中峰2为葛根素，峰20为丹参酮II A0
[0059]以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0060]以下各实施例中所使用的对照品如下:丹参酮II A，购自中国药品生物制品检定所，批号:110766-200417 ;葛根素，购自中国药品生物制品检定所，批号:110752_200511。
[0061]以下各实施例中所使用的色谱仪为美国AgilentllOO系列。
[0062]实施例1供试品溶液的制备
[0063]本实施例从以下几个方面对供试品溶液的制备方法进行了考查。
[0064]1、提取溶剂
[0065]以乙酸乙酯，70%甲醇的乙酸乙酯溶液，50%甲醇的乙酸乙酯溶液，30%甲醇的乙酸乙酯溶液，甲醇为提取溶剂，采用超声提取方法，对同一批供试品进行了提取溶剂考察。
[0066]70%甲醇的乙酸乙酯溶液，50%甲醇的乙酸乙酯溶液对葛根素的提取率过低，甲醇对丹参酮II A提取率过低，因此选用对丹参酮II A、葛根素提取率相对较高的30%甲醇的乙酸乙酯溶液作为供试品提取溶剂。
[0067]2、供试品取样量
[0068]分别精密称取正心泰片包衣0.5g,0.75g, 1.0g, 1.25g,加20ml含30%甲醇的乙酸乙酯溶液，称重，超声处理(功率250W，频率25kHz) 20分钟，制备供试品。
[0069]结果表明，取样量0.5g-0.75g，图谱(未示出)中较多色谱峰响应值相应较低，而取样量1.0gU.25g各色谱峰成分在图谱中均能明显显示，考虑色谱柱的保护，选择1.0g作为供试品取样量。
[0070]3、提取时间考察
[0071]丹参酮II A不稳定，因此考察提取时间时分别考察了超声时间10、20、30分钟的提取效果。
[0072]结果发现，超声处理(功率250W，频率25kHz) 20分钟时丹参酮II A色谱峰相对响应值较高，因此选择超声20分钟的方法制备供试品。
[0073]实施例2色谱条件与系统适用性试验考察
[0074]本实施例从以下各方面对正心泰片指纹图谱的色谱条件和与系统适用性进行了
试验考察。
[0075]1、指纹图谱检测方法的选择
[0076]文献调研表明，正心泰片中所含主要成分均有较好的紫外吸收，因此选用HPLC-UV检测方法进行指纹图谱研究。
[0077]2、指纹图谱检测波长的选择
[0078]文献研究表明，正心泰片六味药中所含有效成分紫外吸收波长特征各不相同，采用二极管阵列检测器对样品进行全波长检测，并同时收集250nm (葛根素最大吸收)、271nm(丹参酮II A)。
[0079]结合考察，在271nm波长处葛根素和丹参酮II A的信息量最大且色谱峰容易观察，因此最后确定271nm为正心泰片指纹图谱的检测波长。
[0080]4、色谱柱考察
[0081]分别考察了Agilent、Diamonsil 及 Kromasil 三种色谱柱。
[0082]结果表明，在同样条件下，Agilent色谱柱对样品各色谱峰的分离度最佳，大部分色谱峰能达到基本分离，因此选用Agilent TC-C18 (250mmX 4.6mm, 5 y m)色谱柱进行正心泰片指纹图谱的测定。
[0083]5、柱流速的考察
[0084]照HPLC色谱条件，分别考察了不同的柱流速(1.1mL/分钟，1.0mL/分钟，0.9mL/分钟)。
[0085]结果表明，柱流速各成分分离效果的影响不明显，仅个别色谱峰1.0mL/分钟的流速分离效果较好(图未示出)，因此选用柱流速为1.0mL/分钟。
[0086]6、柱温考察
[0087]照HPLC色谱条件，分别考察了 3种柱温(25°C、30°C、35°C)。
[0088]结果表明，柱温对各色谱峰成分分离效果的影响不明显，故选用接近室温的25°C作为柱温条件。
[0089]7、指纹图谱色谱条件2倍色谱峰采集时间考察
[0090]供试品溶液进样后，记录210分钟的色谱图，考察是否出峰完全(图未示出)。
[0091]结果表明，在此色谱条件下，105分钟以后未检测出色谱峰。
[0092]8、流动相空白考察
[0093]在HPLC色谱条件下，不进样单运行程序考察105分钟的色谱图，未检测到任何色谱峰(图未示出)，结果表明流动相空白对指纹图谱检测无影响。
[0094]空白溶剂影响的考察
[0095]在HPC色谱条件下记录空白溶剂(30%甲醇的乙酸乙酯溶液)105分钟的色谱图，未检测到任何色谱峰(图未示出)，结果表明空白溶剂对指纹图谱检测无影响。
[0096]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本【技术领域】的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种正心泰片指纹图谱的建立方法，其特征在于，采用液相色谱法检测正心泰片中丹参酮II A、葛根素的含量；所述液相色谱的条件如下: 色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶TC-C18为填充相； 流动相:体积比9:91-59:41的乙腈和水溶液，进行梯度洗脱；
流速:0.5-1.5mT,/mi n ；
柱温:25-40 0C ； 紫外检测波长:271nm; 理论塔板数按葛根素计算，应不低于4000-6000。
2.根据权利要求1所述正心泰片指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括如下步骤: 51、制备对照品溶液:取丹参酮IIA、葛根素，加甲醇制成每ImL含0.16mg丹参酮II A、0.084mg葛根素的溶液； 52、制备供试品溶液:取正心泰片，除去包衣，研细；以一克粉末，加20ml含30%甲醇的乙酸乙酯溶液；超声处理后，补足溶剂重量；0.45um微孔滤膜过滤，获得所述供试品溶液； 53、测定:吸取所述对照品与所述供试品溶液各5yL，注入液相色谱仪，进行测定，得到指纹图谱。
3.根据权利要求2所述正心泰片指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤S3中液相色谱的条件如下`
色谱柱:Agilent250mmX 4.6mm, 5 u m ； 流速:lmL/min ； 柱温:25°C。
4.根据权利要求2或3所述正心泰片指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤S2中超声处理的参数为:功率250W，频率25kHz，处理20分钟。
5.根据权利要求4中所述正心泰片指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序按如下体积比设置进行: 0分钟时，流动相为9%的乙腈和91%的水溶液； 10分钟时，流动相为10%的乙腈和90%的水溶液； 15分钟时，流动相为11%的乙腈和89%的水溶液； 40分钟时，流动相为11%的乙腈和89%的水溶液； 42分钟时，流动相为17%的乙腈和83%的水溶液； 105分钟时，流动相为59%的乙腈和41%的水溶液。
6.根据权利要求5中所述正心泰片指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述建立的指纹图谱中包括20个特征峰，其中峰2为葛根素，峰20为丹参酮II A。
7.—种上述权利要求所述正心泰片指纹图谱建立方法的应用，其特征在于，建立的指纹图谱用于检测正心泰片的质量。
【文档编号】G01N30/02GK103675117SQ201310545749
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】李彦冰, 康晓宇 申请人:大连天宇制药有限公司