一种基于荧光素和巯基修饰的dna探针的电化学传感器的制造方法
【专利摘要】一种基于荧光素和巯基修饰的DNA探针的电化学传感器，包括电极和DNA探针，所述电极采用三电极系统，所述DNA探针的两端分别修饰有荧光素和巯基；所述金电极的表面沉积有金纳米颗粒；所述DNA探针上修饰的巯基与金纳米颗粒之间通过金-硫键结合；金纳米颗粒与DNA探针上修饰的荧光素通过表面吸附作用，使DNA探针形成了弓形结构。本发明所述的传感器通过电沉积效应，在金电极表面修饰上金纳米颗粒。这种纳米金修饰不仅大大增加了电极表面探针ssDNA的固载量，而且由于纳米金对荧光素的表面吸附作用，使探针形成了弓形结构。这种连接具有较高的电子传递效率，可提高杂交前后DPV信号的改变，进而提高检测灵敏度。
【专利说明】一种基于荧光素和巯基修饰的DNA探针的电化学传感器
【技术领域】
[0001]本发明涉及电化学生物传感器【技术领域】，特别涉及一种基于荧光素和巯基修饰的DNA探针的电化学传感器。
【背景技术】[0002]近来，许多电化学DNA (E-DNA)传感器和类似基于适体传的电化学(E-AB)传感器大量涌现，它们是基于探针DNA在动力学上的构象变化发展而来的一种新型的DNA传感器。其中探针DNA可以是线性或者环状DNA。探针DNA —般一端修饰巯基，一端修饰氧化还原标记物。通过金-硫键的作用自组装到金电极表面。与靶DNA杂交后，改变了探针DNA的构型，使得氧化还原标记物与电极表面的电子传递效率改变，从而改变了电信号，指示杂交。这种简单的传感器被广泛地应用于DNA、酶、金属离子和有机小分子等的研究。但是有些探针DNA的构象改变非常复杂，而对于一些简单的传感器，其灵敏度和选择性还需要进一步提闻，因此旨在进一步提闻传感器检测效率的研究具有广阔的如景。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种基于荧光素和巯基修饰的DNA探针的电化学传感器，包括电极和DNA探针，所述电极采用三电极系统，其中金电极为工作电极，甘汞电极为参比电极，钼丝为对电极；所述DNA探针的两端分别修饰有荧光素和巯基；所述金电极的表面沉积有金纳米颗粒；所述DNA探针上修饰的巯基与金纳米颗粒之间通过金-硫键结合；金纳米颗粒与DNA探针上修饰的荧光素通过表面吸附作用，使DNA探针形成了弓形结构。
[0004]一种如上所述的基于荧光素和巯基修饰的DNA探针的电化学传感器，金电极和DNA探针组装的具体方法如下:
[0005]I)使用清洗剂清洗金电极表面，再用二次水清洗，氮气吹干，然后在0.1mol.1-1的H2SO4溶液中扫描循环伏安直到稳定；之后将三电极系统插入到6mmol -1-1的HAuCl4(含0.1mol.L-1KNO3)溶液中进行电沉积，溶液中还含0.1mol.L-1KNO3, -400mV(vs.SCE)沉积300s，沉积完成后，用二次水清洗电极表面残留的溶液；
[0006]所述清洗剂为30%H202/70%H2S04，体积比。
[0007]2)将装配有荧光素和巯基的DNA探针溶液，浓度29 μ mo 1-1,滴涂在纳米金颗粒修饰的金电极表面，然后将电极放在空气流通的地方自然晾干过夜；此过程中用一个小烧杯罩在电极上，在里面放一个装满水的小烧杯保持烧杯罩中的湿度；完成后，用二次水清洗电极，氮气吹干，得到DNA探针修饰的金电极。
[0008]本发明所述的一种基于荧光素和巯基修饰的DNA探针的电化学传感器通过电沉积效应，在金电极表面修饰上金纳米颗粒。这种纳米金修饰不仅大大增加了电极表面探针ssDNA的固载量，而且由于纳米金对荧光素的表面吸附作用，使探针形成了弓形结构。这种连接具有较高的电子传递效率，可提高杂交前后DPV信号的改变，进而提高检测灵敏度。【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1为裸金电极表面的电镜扫描照片；
[0010]图2为裸金电极在3mmol.L-1氯金酸溶液中，_200mV(vs.SCE)沉积300s后的电镜扫描照片；
[0011]图3为裸金电极在6mmol.I71氯金酸溶液中，_400mV(vs.SCE)沉积300s后的电镜扫描照片；
[0012]图4为裸金电极在6mmol.I71氯金酸溶液中，_400mV(vs.SCE)沉积400s后的电镜扫描照片；
[0013]图5为电极在0.1mol.T1H2SO4溶液中的循环伏安曲线:裸金电极(a);纳米金修饰电极(C)；
[0014]图6为裸金电极在杂交液中ssDNA-B的浓度为15nmol.1时杂交前后的DPV峰电流信号变化图； [0015]图7为金纳米颗粒修饰的金电极在杂交液中ssDNA-B的浓度为15nmol.1时杂交前后的DPV峰电流信号变化图；
[0016]图8为裸金电极在杂交液中ssDNA-B的浓度为5nmol -1时杂交前后的DPV峰电
流信号变化图；
[0017]图9为金纳米颗粒修饰的金电极在杂交液中ssDNA-B的浓度为5nmol -1时杂交前后的DPV峰电流信号变化图；
[0018]图10为紫外吸收值与目标DNA浓度的关系图；
[0019]图11为DPV信号降低率与目标ssDNA-B浓度的线性关系；
[0020]图12为不同目标ssDNA的DPV信号，(a)只固定探针ssDNA-A的DPV信号；(b)与50nmol.1 的 ssDNA-C 杂交的 DPV 信号；(b)与 50nmol.1 的 ssDNA-D 杂交的 DPV 信号；(d)与50nmol.1的ssDNA-B杂交的DPV信号；(e)未修饰ssDNA_A的纳米金修饰金电极的DPV信号。
【具体实施方式】
[0021]下文通过实施例对本发明做进一步说明。
[0022]实施例1
[0023]—种基于突光素和巯基修饰的DNA探针的电化学传感器，包括电极和DNA探针,所述电极采用三电极系统，其中金电极为工作电极，甘汞电极为参比电极，钼丝为对电极；所述DNA探针的两端分别修饰有荧光素和巯基；所述金电极的表面沉积有金纳米颗粒；所述DNA探针上修饰的巯基与金纳米颗粒之间通过金-硫键结合；金纳米颗粒与DNA探针上修饰的荧光素通过表面吸附作用，使DNA探针形成了弓形结构。
[0024]一种如上所述的基于荧光素和巯基修饰的DNA探针的电化学传感器，金电极和DNA探针组装的具体方法如下:
[0025]I)使用清洗剂清洗金电极表面，再用二次水清洗，氮气吹干，然后在0.1mol.1的H2SO4溶液中扫描循环伏安直到稳定；之后将三电极系统插入到6mmol -1的HAuCl4(含0.1mol.L-1KNO3)溶液中进行电沉积，溶液中还含0.1mol.L-1KNO3, -400mV(vs.SCE)沉积300s，沉积完成后，用二次水清洗电极表面残留的溶液；[0026]所述清洗剂为piranha溶液，其中30%H202/70%H2S04，体积比。
[0027]2)将装配有荧光素和巯基的DNA探针溶液，浓度29 μ mo 1.L-1,滴涂在纳米金颗粒修饰的金电极表面，然后将电极放在空气流通的地方自然晾干过夜；此过程中用一个小烧杯罩在电极上，在里面放一个装满水的小烧杯保持烧杯罩中的湿度；完成后，用二次水清洗电极，氮气吹干，得到DNA探针修饰的金电极。
[0028]实施例2
[0029]金电极上纳米金颗粒的生成过程通过SEM表征。通过控制沉积电压、溶液浓度和沉积时间可以控制电沉积纳米金的尺寸和数量。图1-4为裸金电极和金纳米颗粒修饰的金电极表面的扫描电镜。如图1所示，裸金电极表面基本光滑，没有纳米颗粒在其表面；当电压较低，氯金酸浓度较稀时，电沉积速度慢，沉积180s后金电极表面仅有一些小颗粒，如图2所示；在6mmol.L—1氯金酸溶液中，-400mV(vs.SCE)沉积300s后,可看到金电极表面覆盖了大量的金纳米颗粒，在这些金纳米颗粒之间有许多空隙，大大增加了金电极比表面积，如图3所示。随着沉积时间的延长，其效果仅是使沉积颗粒的尺寸增大，如图4所示。
[0030]将使用本方法制备的纳米金修饰电极和裸金电极在0.1mol *L_1的H2SO4中制作循环伏安曲线，如图5所示，图中，裸金电极(a)的峰电流为0.24 μ A，纳米金修饰电极(c)的峰电流为1.4μ A。纳米金修饰电极的表面积为金电极的5.8倍，可见电沉积纳米金颗粒后可显著提高金电极的表面积。
[0031]实施例3
[0032]选择如下序列为探针，5’-T6-TAG GAA ACA CCA AAG ATG ATA TTT-T6_3’，将探针序列的两端分别修饰上荧光素和巯基，序列如下所示:
[0033]ssDNA-A:
[0034]5’ -F-T6-TAG GAA ACA CCA AAG ATG ATA TTT-T6-SH_3’，其中 F 代表荧光素。
[0035]ssDNA-B:
[0036]5，-AAA TAT CAT CTT TGG TGT TTC CTA-3’ (目标 DNA)
[0037]ssDNA-C:
[0038]5，-TAC GAG TTG AGA GCA AGC AGA GTT-3，(非互补 DNA)
[0039]ssDNA-D:
[0040]5’ -AAA TAT CAT CTT TTG TGT TTC CTA-3’(单碱基错配 DNA)
[0041]以上人工序列由北京赛百盛有限公司提供。
[0042]利用实施例1的方法将ssDNA-A序列分别修饰到裸金电极和纳米金修饰电极上，再分别将修饰好的电极分别单独插入到含有目标DNA的PBS缓冲溶液中，室温下杂交lh，然后将杂交后的电极拿出，用二次水清洗，氮气吹干。分别组成三电极系统进行DPV电化学检测。缓冲体系为磷酸缓冲体系(PBS) (IOOmmol -L-1磷酸缓冲溶液，1.5mol -L-1NaCl, ImmoI.L_1Mg2+, pH=7.2)。
[0043]表1DPV峰电流信号
[0044]
【权利要求】
1.一种基于突光素和巯基修饰的DNA探针的电化学传感器,其特征在于包括电极和DNA探针，所述电极采用三电极系统，其中金电极为工作电极，甘汞电极为参比电极，钼丝为对电极；所述DNA探针的两端分别修饰有荧光素和巯基；所述金电极的表面沉积有金纳米颗粒；所述DNA探针上修饰的巯基与金纳米颗粒之间通过金-硫键结合；金纳米颗粒与DNA探针上修饰的荧光素通过表面吸附作用，使DNA探针形成了弓形结构。
2.一种如权利要求1所述的基于荧光素和巯基修饰的DNA探针的电化学传感器，其特征在于金电极和DNA探针组装的具体方法如下: O使用清洗剂清洗金电极表面，再用二次水清洗，氮气吹干，然后在0.1mol.L—1的H2SO4溶液中扫描循环伏安直到稳定；之后将三电极系统插入到6mmol.L—1的HAuCl4(含.0.1mol.L-1KNO3)溶液中进行电沉积，溶液中还含0.1mol.L-1KNO3, -400mV(vs.SCE)沉积.300s，沉积完成后，用二次水清洗电极表面残留的溶液； 所述清洗剂为30%H202/70%H2S04 .2)将装配有荧光素和巯基的DNA探针溶液，浓度29 μ mo I.L_\滴涂在纳米金颗粒修饰的金电极表面，然后将电极放在空气流通的地方自然晾干过夜；此过程中用一个小烧杯罩在电极上，在里面放一个装满水的小烧杯保持烧杯罩中的湿度；完成后，用二次水清洗电极，氮气吹干，得到DNA探针修饰的金电极。
【文档编号】G01N27/30GK103698374SQ201310716662
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月23日 优先权日:2013年12月23日
【发明者】邢士超, 张少燕, 陈颖, 蒋钢, 苗志敏, 刘云国, 杨钊, 苏浩然 申请人:邢士超