一种毛蚶蛋白质的含量测定方法
【专利摘要】本发明涉及一种毛蚶蛋白质的含量测定方法，其特征在于先用凝胶色谱柱高效液相色谱法确定被测样品中的多肽是毛蚶多肽，再用定氮法测定含量。制剂中每g毛蚶提取物含毛蚶多肽不得少于0.12g，含量越高，疗效更好。这种方法可用于毛蚶提取物各种制剂的含量测定，使毛蚶制剂在生产和使用中有效的保证产品质量，进而保证药品疗效。
【专利说明】一种毛蚶蛋白质的含量测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及药品检测方法，具体涉及一种毛蚶蛋白质的含量测定方法，属药品【技术领域】。
【背景技术】
[0002]毛蚶肉含丰富的蛋白质、维生素及人体所必需的氨基酸，自古就有着食用、药用价值，《医林纂要》注“蚶肉补心血、散瘀血、除烦醒酒、破结消痰”，《日华子本草》注“蚶肉益血色”。近年来，研究报道显示毛蚶有抗肿瘤作用，具有清除体内自由基、提高机体免疫力的功效。毛蚶肉制剂对肺癌、肾癌、胃癌、肝癌等多种癌症具有较好的治疗作用，且安全性良好。
[0003]根据文献报道毛蚶多肽是毛蚶的主要生物活性成分之一，具有保肝、抗肿瘤、调节免疫的功效。暨南大学博士生导师于荣敏教授2011年I月5日报道，新鲜毛蚶去壳，经匀浆、离心、透析、冻干后制得毛蚶多肽提取物，法测定对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响及对小鼠NK细胞杀伤活性的影响；对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响；小鼠脾淋巴细胞周期的变化；对主要细胞因子IFN-Y和IL-4分泌水平的影响。结果毛蚶多肽提取物能够显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖，增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红活性和小鼠NK细胞杀伤活性；促进脾淋巴细胞G0/G1期向DNA合成期(s期)转化；协同ConA作用，能够增加IFN-Y的分泌，并且能够抑制IL-4的分泌。中国药科大学窦昌贵等报道，用毛蚶肉水解液小鼠灌胃，结果:对四氯化碳、硫代乙胺和强的松龙引起的血清谷丙转氨酶活性升高均有明显的降低作用，表明毛蚶水解液对实验性肝损伤有显著的保护作用。
[0004]我们试验发现毛蚶多肽可明显抑制乙肝表面抗原和E抗原的表达，并对乙肝DNA有抑制作用。
[0005]蛋白质是生命活动的基本物质，所有动植物生命体都含有蛋白质和多妝，在无法确定蛋白质来源的情况下，就不能保证药品的有效性，不能准确测定蛋白质的含量，就无法在生产和使用中保证产品质量，进而药品疗效得不到保证。
[0006]现有文献还没有毛蚶多肽专属性和含量测定的报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种毛蚶多肽的含量测定方法，使毛蚶制剂在生产和使用中有效的保证产品质量。
[0008]一种毛蚶蛋白质多肽的含量测定方法，其特征在于先用凝胶色谱柱高效液相色谱法确定被测样品中的多肽是毛蚶多肽，再用定氮法测定含量，具体步骤如下:
(1)色谱条件及系统适应性:用亲水球形高聚物为填充剂的凝胶色谱柱；以0.05mol/L的磷酸盐缓冲液为流动相；检测波长为280 nm ;柱温:25°C ;流速0.4ml/min ;检测波长280nm ;理论板数按蛋白质分子量100000计算不低于5000 ；
(2)称取样品IOgJP12倍水超声提取30 min，离心10 min，取上层液，滤过，滤液按体积分数60% (w/v)加入硫酸铵，O?4°C放置过夜，离心，取沉淀，加水IOml溶解，以1%的碳酸氢铵溶液为透析液，用截留分子量为3500的透析膜，O?4°C条件下充分透析，将透析膜内溶液转移至50ml量瓶内，用水定容，O?4°C保存，即得毛蚶多肽溶液；
(3)取毛蚶多肽溶液10μ1，注入液相色谱仪，测定，记录图谱；图谱中如果在保留时间15.6min±5%之内有毛蚶多肽的特征峰，其分子量为88070，则继续进行以下操作，如无则判为伪品；
(4)称取样品0.5-2g，加20-40倍水，超声使分散均匀，加10-20%三氯乙酸15_40ml，混匀，静置20-50分钟，过滤，取滤纸及滤渣干燥，照《中国药典》2010年版一部附录IX L第一法，氮测定法测定毛蚶多肽的含量；
我们经过反复试验发现，制剂中每g毛蚶提取物含多肽不得少于0.12g，含量越高，疗效更好。
毛蚶提取物经真空干燥后的样品蛋白质含量为60%，在毛蚶有效成分研究时，我们发现，小分子量的多肽为抗肿瘤的主要成分，而大分子量的蛋白生物活性低，药理效果较差。而大分子量的毛蚶蛋白质和魁蚶、泥蚶、花蛤、扇贝提取物，其所含的多肽分子量不同于毛蚶多肽，用凝胶色谱柱高效液相色谱法测定，图谱中在保留时间15.6min±5%之内无毛蚶多肽的特征峰，因此用本发明的方法测定毛蚶多肽的含量专属性强，能够保证用毛蚶制备的药品有效和质量可控。
[0009]为了便于理解本发明，特通过下面试验例进一步说明:
一、两批毛蚶提取物片剂样品含量测定
(1)色谱条件及系统适应性:用亲水球形高聚物为填充剂的凝胶色谱柱；以0.05mol/L的磷酸盐缓冲液为流动相；检测波长为280 nm ;柱温:25°C ;流速0.4ml/min ;检测波长280nm ;理论板数按蛋白质分子量100000计算不低于5000 ；
(2)称取样品各IOg,分别加12倍水超声提取30min,离心10 min,取上层液,滤过,滤液按体积分数60% (w/v)加入硫酸铵，O?4°C放置过夜，离心，取沉淀，加水IOml溶解，以1%的碳酸氢铵溶液为透析液，用截留分子量为3500的透析膜，O?4°C条件下充分透析，将透析膜内溶液转移至50ml量瓶内，用水定容，O?4°C保存，即得毛蚶多肽溶液；
(3)取毛蚶多肽溶液10μ 1，注入液相色谱仪，测定，记录图谱；毛蚶提取物制剂片剂A样品图谱中在保留时间15.537min有一尖锐的特征峰，其分子量为88070 ;毛蚶提取物制剂片剂B样品特征图谱中在保留时间15.698min有一尖锐的特征峰，其分子量为88070。结果显示两批毛蚶提取物片剂均是用毛蚶制得。继续进行含量测定；
(4)称取样品各0.5-2g，分别加20-40倍水，超声使分散均匀，加10-20%三氯乙酸15-40ml，混匀，静置20-50分钟，过滤，取滤纸及滤渣干燥，照《中国药典》2010年版一部附录IX L第一法，氮测定法测定毛蚶多肽的含量，计算得:制剂A样品中每g毛蚶多肽0.45g ；制剂B样品中每g毛蚶多肽0.15。
[0010]二、两批毛蚶提取物片剂药效比较
试验方法:选取健康小鼠10只，接种肺癌细胞株(2*105/只)，接种14d后，无菌条件下剥离肿瘤，用组织匀浆器制成细胞悬液。将健康小鼠30只，随机分为3组，各组均尾静脉接受上述制备的细胞悬液0.2ml (含细胞数1*105/只)。分别给予制剂A、B 0.25g/kg静脉注射，空白对照组注射等量生理盐水。各组均每日一次，连续10天。
[0011]观察项目:停药后观察各组体重质量变化，生存天数，按以下公式计算生存延长率LS=[(用药组生存天数/对照组生存天数)]-1*100%。处死动物称肺重，计算肺重指数。肺重指数=小鼠肺重(mg) /体重量(IOg)之比*100%。
[0012]结果见表:
【权利要求】
1.一种毛蚶蛋白质多肽的含量测定方法，其特征在于先用凝胶色谱柱高效液相色谱法确定被测样品中的多肽是毛蚶多肽，再用定氮法测定含量。
2.根据权利要求1的凝胶色谱柱高效液相色谱法确定被测样品中的多肽是毛蚶多肽，其特征在于具体步骤如下: (1)色谱条件及系统适应性:用亲水球形高聚物为填充剂的凝胶色谱柱；以0.05mol/L的磷酸盐缓冲液为流动相；检测波长为280 nm ;柱温:25°C ;流速0.4ml/min ;检测波长280nm ;理论板数按蛋白质分子量100000计算不低于5000 ； (2)称取样品IOgJP12倍水超声提取30 min，离心10 min，取上层液，滤过，滤液按体积分数60% (w/v)加入硫酸铵，O?4°C放置过夜，离心，取沉淀，加水IOml溶解，以1%的碳酸氢铵溶液为透析液，用截留分子量为3500的透析膜，O?4°C条件下充分透析，将透析膜内溶液转移至50ml量瓶内，用水定容，O?4°C保存，即得毛蚶多肽溶液； (3)取毛蚶多肽溶液10μ1，注入液相色谱仪，测定，记录图谱；图谱中如果在保留时间15.6min±5%之内有毛蚶多肽。
3.根据权利要求1的定氮法测定含量方法，其特征在于称取样品0.5-2g，加20-40倍水，超声使分散均匀，加10-20%三氯乙酸15-40ml，混匀，静置20-50分钟，过滤，取滤纸及滤渣干燥，照《中国药典》2010年版一部附录IX L第一法，氮测定法测定毛蚶多肽的含量。
4.根据权利要求1或权力要求3的一种毛蚶蛋白质多肽的含量测定方法，其特征在于制剂中每g毛蚶提取物含毛蚶多肽不得少于0.12g，含量越高，疗效更好。
5.根据权利要求1或权利要求2或权利要求3或权利要求4的一种毛蚶蛋白质多肽的含量测定方法，其特征在于可用于毛蚶提取物各种制剂的含量测定。
【文档编号】G01N33/48GK103954704SQ201410186505
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年5月6日 优先权日:2014年5月6日
【发明者】苏静, 王丽, 赵颖, 许翠萍, 张晶 申请人:济南康众医药科技开发有限公司