检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgA抗体的方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性抗体IgA的方法。方法步骤为：1）猪流行性腹泻病毒抗原的制备和96孔聚苯乙烯反应板包被；2）采集待测母猪的血液，处理后获得血清一抗；3）将血清一抗稀释后，按编号加入抗原包被的反应板上，37℃饱和湿度反应1小时，洗涤；4）将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgA抗体稀释后，按顺序加入到反应板上，37℃饱和湿度避光反应2小时，洗涤；5）将TMB显色剂，按顺序加入到反应板上，避光反应25分钟，加入终止液；6）放入酶标仪中，读取OD650数据，判定结果。本发明适用于猪群大面积的猪流行性腹泻IgA抗体调查。
【专利说明】检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgA抗体的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgA抗体的方法【背景技术】。
【背景技术】
[0002]猪流行性腹湾是由猪流行性腹湾病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)引起的猪的一种急性肠道传染病，以水泻、呕吐和脱水为特征。其病理特征表现为肠管扩张，内容物稀薄，呈黄色、泡沫状，肠壁弛缓，缺乏弹性，变薄有透明感，肠粘膜绒毛严重萎缩，胃底粘膜潮红充血或斑点状出血，胃内容物呈鲜黄色并混有大量乳白色凝乳块(或絮状小片)，对养猪业危害极大。
[0003]猪流行性腹泻病毒经口和鼻感染后进入小肠，可在猪群中持续存在，各种年龄的猪都易感。哺乳仔猪、架子猪和育肥猪的发病率可达100%，尤其以哺乳仔猪最为严重且预后不良，多数不能耐过而死亡。育肥猪尽管发病率较高，但死亡率较低。母猪的发病率在15%?90%。本病主要在冬季多发，夏季也可发生。该病具有传染性强，发病迅速、仔猪死亡率高等特点。1973年首次在我国上海发生。2006先后多次在我国多地爆发流行，给养猪业造成了重大经济损失。
[0004]猪在感染PEDV后，在免疫学中起主要作用的免疫球蛋白是IgG和IgA。PEDV首先激发粘膜局部体液免疫反应，而后又可刺激全身免疫；粘膜局部免疫以IgA为主，全身体液免疫以IgG为主。IgG的分子量较大，不容易穿过肠壁进入肠腔，它们对胃酸和消化酶的抵抗力较差。IgA也叫分泌抗体，分子量较小，它们在黏膜免疫中起主要作用，可以抵御胃酸和消化酶的消化，并且与肠黏膜有亲和作用所以IgA在肠道中起重要的作用。
[0005]猪出生时体内无免疫球蛋白，出生后通过初乳获得免疫抗体。初乳中免疫球蛋白主要是IgG，也有多量的IgA，新生仔猪吮吸初乳后通过肠上皮进入循环，这样为新生仔猪提供了像母猪那样的血清抗体。所以，在仔猪哺乳期，进入消化道的病毒是通过与母乳中的抗体在肠道中不断中和而起主要保护作用的。而原先进入体内循环的抗体再通过肠腔与进入消化道内的病毒起作用就次要了，这种免疫机理就是被动免疫，也称为乳汁免疫。
[0006]目前，由于周龄内仔猪本身免疫系统尚未完全发育成熟，所以只能通过免疫妊娠母猪，以期通过乳汁使仔猪获得母源性抗体，达到预防新生仔猪感染PEDV的目的。采集免疫后妊娠母猪血液样本，分离血清，并检测特异性的血清IgA抗体，是目前预防与监控初生仔猪流行性腹泻主要的手段，对妊娠母猪流行性腹泻疫苗免疫效果评价、哺乳仔猪免疫程序制定、流行状态监测均具有重要意义。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgA抗体的方法。
[0008]一种检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgA抗体的方法，包括如下步骤: 1)猪流行性腹泻病毒抗原的制备和抗原包被96孔聚苯乙烯反应板；
2)将待测动物保定，从其前腔静脉处取血，将采集到的血液处理后获得血清一抗，保存备用;
3)将血清一抗，以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液1:5稀释后，按编号加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100ul，37°C饱和湿度反应I小时，以PBST洗涤备用；
4)将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgA抗体，以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液1:2000稀释后,按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加10ul,37°C饱和湿度避光反应2小时，以PBST洗涤备用；
5)将TMB显色剂按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加10ul，避光反应25分钟，随后每个反应孔加入10ul IM浓硫酸，终止反应；
6)放入酶标仪中，读取0D650数据，判定结果。
[0009]所述的步骤I)为:以pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释猪流行性腹泻病毒纯化抗原至5 X 16 TCID50/ml，以10ul/孔的浓度包被96孔聚苯乙烯ELISA反应板，并以质量百分比浓度5%的脱脂奶粉的PBST溶液封闭，获得ELISA反应的抗原基质，置于4°C备用。
[0010]所述的步骤3)为:以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液将待测猪血清中所含猪流行性腹泻病毒特异性IgA抗体1:5稀释后，按编号以10ul/孔的浓度加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，37°C饱和湿度反应I小时，以PBST洗涤备用；
所述的步骤4)为:以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgA抗体1:2000稀释后，按顺序以10ul/孔的浓度加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，37°C饱和湿度反应2小时，以PBST洗涤备用；
所述的步骤6)为:将终止后的96孔聚苯乙烯反应板，放入预热的酶标仪中，读取各反应孔的0D650数值，并根据以下公式判定结果:已知阴性样品的OD值< 0.3，而且已知阳性样品的OD值> 0.8 ;在上述条件成立的情况下，如果待检血清样品与已知阳性样品OD值的比值S/P彡0.25，则判为阳性；否则判为阴性。
[0011]本发明提供的猪流行性腹泻病毒血清IgA抗体检测方法，具有以下优点:1)可以对整个猪群实行大面积采样，避免猪群的屠宰采样；2)血液样品对温度、环境、污染物的抵抗力更强，运输和保存更方便；3)量化哺乳仔猪获得母源免疫水平，所得数据更准确客观全面；4)猪流行性腹泻病毒血液IgA抗体检测比IgG抗体检测更能代表哺乳仔猪获得母源免疫水平；5)可监控妊娠母猪的猪流行性腹泻免疫动态，预知哺乳仔猪群的免疫动向及管理；6)猪流行性腹泻病毒血清IgA抗体检测与初乳IgA抗体检测的符合率在94%以上。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1是检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性抗体的方法的过程示意图。
【具体实施方式】
[0013]检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgA抗体的方法包括如下步骤:
1)猪流行性腹泻病毒抗原的制备和抗原包被96孔聚苯乙烯反应板；
2)将待测动物保定，从其前腔静脉处取血，将采集到的血液处理后获得血清一抗，保存备用;
3)将血清一抗，以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液1:5稀释后，按编号加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100ul，37°C饱和湿度反应I小时，以PBST洗涤备用；
4)将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgA抗体，以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液1:2000稀释后,按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加10ul,37°C饱和湿度反应2小时，以PBST洗涤备用；
5)将TMB显色剂按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加10ul，避光反应25分钟，随后每个反应孔加入10ul IM浓硫酸，终止反应；
6)放入酶标仪中，读取0D650数据，判定结果。
[0014]所述的步骤I)为:以pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释猪流行性腹泻病毒纯化抗原至5 X 16 TCID50/ml，以10ul/孔的浓度包被96孔聚苯乙烯ELISA反应板，并以质量百分比浓度5%的脱脂奶粉的PBST溶液封闭，获得ELISA反应的抗原基质，置于4°C备用。
[0015]所述的步骤3)为:以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液将待测猪血清中所含猪流行性腹泻病毒特异性IgA抗体1:5稀释后，按编号以10ul/孔的浓度加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，37°C饱和湿度反应I小时，以PBST洗涤备用；
所述的步骤4)为:以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgA抗体1:2000稀释后，按顺序以10ul/孔的浓度加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，37°C饱和湿度避光反应2小时，以PBST洗涤备用；
所述的步骤6)为:将终止后的96孔聚苯乙烯反应板，放入预热的酶标仪中，读取各反应孔的0D650数值，并根据以下公式判定结果:已知阴性样品的OD值< 0.3，而且已知阳性样品的OD值彡0.8 ;在上述条件成立的情况下，如果待检血清样品与已知阳性样品OD值的比值S/P彡0.25，则判为阳性；否则判为阴性。
实施例
[0016]I)以商品化的猪流行性腹泻病毒，17 TCID50/ml (半数细胞感染量/毫升)浓度，感染Vero细胞，培养72小时后，收集病毒液，4000g离心lOmin，取上清；35000g离心lh，获得纯化病毒，并滴定TCID50。将抗原以pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释至5X 16 TCID50/ml,以10ul/孔的浓度包被96孔聚苯乙烯ELISA反应板，饱和湿度下，4°C孵育16h。随后弃去包被液，拍干ELISA板，加入以PBST (pH7.3 PBS, 0.05% tween-20)稀释的5%脱脂奶粉200ul/孔，于22-28°C封闭lh。弃去封闭液，拍干ELISA板，每孔加入350 ul洗液(PBST)，洗涤I minX3次，拍干ELISA板，置于4°C备用，见图1。
[0017]2)将猪进行保定，先用75%酒精棉球对前腔静脉入针处进行局部消毒，再用干棉球擦干，用大拇指自始至终压住前腔静脉近心端，然后用消毒过的针头急刺远心端的前腔静脉，血液流出第一、二滴弃去后，接血，使血液沿着瓶壁流入，采到7毫升血液后，松开大拇指，血液即停止流出，用5%碘酊棉球压一下针孔即达到消毒止血。给采得血液注明号码，立即静置使其凝固，然后带到实验室，冬季于温暖处，夏季置于冷暗处，使血清析出。经10-12小时，将析出的血清倒入另一只消毒空瓶中。血清编码后，用于初步保存和运输(常温下、6小时内，或4°C下、72小时内运至实验室)。将唾液以3000g离心15min，取上清，获得唾液一抗，并与4°C (<7d)或-20°C (<60d)保存备用。
[0018]3)将处理备用的血清一抗，以3%脱脂奶粉溶液(PBST溶)1:5稀释后，按编号加入抗原包被的反应板上，10ul/孔，每个样品3个重复，同时设置阴性和阳性抗体对照各2个孔。饱和湿度下，22-28°C孵育lh。随后弃去包被液，拍干ELISA板，每孔加入PBST 350 ul洗液(PBST)，洗涤I minX4次，拍干ELISA板，备用，见图1。
[0019]4)将辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗猪IgA抗体，以3%脱脂奶粉溶液(PBST溶)为稀释液，作1:2000倍稀释后，按10ul/孔加入到上述一抗包被的反应孔中，22-28°C /饱和湿度反应2h，随后弃去包被液，拍干ELISA板，每孔加入PBST 350 ul洗液(PBST)，洗涤IminX5次，拍干ELISA板，备用，见图1。
[0020]5)将TMB显色液按10ul/孔加入到上述反应孔中，室温避光反应25min，随后加入10ul/孔终止液(IM浓硫酸)，终止反应，见图1。
[0021]6)将终止后的反应板，放入预热的酶标仪中，读取各反应孔的0D650数值，并根据以下公式判定结果:已知阴性样品的OD值彡0.3，而且已知阳性样品的OD值彡0.8;在上述条件成立的情况下，如果待检血清样品与已知阳性样品OD值的比值S/P ^ 0.25，则判为阳性；否则判为阴性。
【权利要求】
1.一种检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgA抗体的方法，其特征在于包括如下步骤: 1)猪流行性腹泻病毒抗原的制备和抗原包被96孔聚苯乙烯反应板； 2)将待测动物保定，从其前腔静脉处取血，将采集到的血液处理后获得血清一抗，保存备用; 3)将血清一抗，以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液1:5稀释后，按编号加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100ul，37°C饱和湿度反应1小时，以PBST洗涤备用； 4)将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgA抗体，以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液1:2000稀释后,按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加lOOul,37°C饱和湿度避光反应2小时，以PBST洗涤备用； 5)将TMB显色剂按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加lOOul，避光反应25分钟，随后每个反应孔加入lOOul 1M浓硫酸，终止反应； 6)放入酶标仪中，读取0D650数据，判定结果。
2.根据权利要求1所述的一种检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgA抗体的方法，其特征在于，所述的步骤1)为:以pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释猪流行性腹泻病毒纯化抗原至5X106 TCID50/ml，以lOOul/孔的浓度包被96孔聚苯乙烯ELISA反应板，并以质量百分比浓度5%的脱脂奶粉的PBST溶液封闭，获得ELISA反应的抗原基质，置于4°C备用。
3.根据权利要求1所述的一种检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgA抗体的方法，其特征在于，所述的步骤3)为:以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液将待测猪血清中所含猪流行性腹泻病毒特异性IgA抗体1:5稀释后，按编号以lOOul/孔的浓度加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，37°C饱和湿度反应1小时，以PBST洗涤备用。
4.根据权利要求1所述的一种检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgA抗体的方法，其特征在于，所述的步骤4)为:以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgA抗体1:2000稀释后，按顺序以lOOul/孔的浓度加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，37°C饱和湿度避光反应2小时，以PBST洗涤备用。
5.根据权利要求1所述的一种检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgA抗体的方法，其特征在于，所述的步骤6)为:将终止后的96孔聚苯乙烯反应板，放入预热的酶标仪中，读取各反应孔的0D650数值，并根据以下公式判定结果:已知阴性样品的0D值< 0.3，而且已知阳性样品的0D值> 0.8 ;在上述条件成立的情况下，如果待检血清样品与已知阳性样品0D值的比值S/P彡0.25，则判为阳性；否则判为阴性。
【文档编号】G01N33/569GK104330558SQ201410531753
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月11日 优先权日:2014年10月11日
【发明者】李龙, 于少芳, 曹洋洋 申请人:杭州贝尔塔生物技术有限公司