检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgG抗体的方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性抗体IgG的方法。方法步骤为：1）猪流行性腹泻病毒抗原的制备和96孔聚苯乙烯反应板包被；2）采集待测猪只的血液，处理后获得血清一抗；3）将血清一抗稀释后，按编号加入抗原包被的反应板上，37℃饱和湿度反应1小时，洗涤；4）将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体稀释后，按顺序加入到反应板上，37℃饱和湿度避光反应2小时，洗涤；5）将TMB显色剂，按顺序加入到反应板上，避光反应25分钟，加入终止液；6）放入酶标仪中，读取OD650数据，判定结果。本发明适用于猪群大面积的猪流行性腹泻IgG抗体调查。
【专利说明】检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgG抗体的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgG抗体的方法【背景技术】。
【背景技术】
[0002]猪流行性腹湾是由猪流行性腹湾病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)引起的猪的一种急性肠道传染病，以水泻、呕吐和脱水为特征。其病理特征表现为肠管扩张，内容物稀薄，呈黄色、泡沫状，肠壁弛缓，缺乏弹性，变薄有透明感，肠粘膜绒毛严重萎缩，胃底粘膜潮红充血或斑点状出血，胃内容物呈鲜黄色并混有大量乳白色凝乳块(或絮状小片)，对养猪业危害极大。
[0003]猪流行性腹泻病毒经口和鼻感染后进入小肠，可在猪群中持续存在，各种年龄的猪都易感。哺乳仔猪、架子猪和育肥猪的发病率可达100%，尤其以哺乳仔猪最为严重且预后不良，多数不能耐过而死亡。育肥猪尽管发病率较高，但死亡率较低。母猪的发病率在15%?90%。本病主要在冬季多发，夏季也可发生。该病具有传染性强，发病迅速、仔猪死亡率高等特点。1973年首次在我国上海发生。2006先后多次在我国多地爆发流行，给养猪业造成了重大经济损失。
[0004]猪流行性腹泻，仅凭临床症状难以做出诊断，波及所有年龄猪(包括哺乳仔猪)的急性PED在临诊上不能与TGE相区分。实验室内通过直接显示PEDV或其抗原或抗体的检测可做出病原学诊断。直接IF和免疫组化技术用于哺乳仔猪小肠切片中PEDV的检测，但仅适于急性腹泻初期，尤其是发病3天内捕杀的患病仔猪小肠切片检测。对于自然死亡的仔猪由于其小肠绒毛严重萎缩，故对其检测结果不可靠。对腹泻仔猪粪便进行直接电镜观察可见PEDV粒子，但若病毒纤突丧失或不清晰，直接电镜检查较为困难。ELISA方法用于检测血样中的特异性抗体,既敏感、有可靠,且可检测大量样本，同时也适于母猪奶中免疫球蛋白的检测。
[0005]目前，疫苗免疫依然是我国猪流行性腹泻防控的最主要手段。采集免疫后猪血液样本，分离血清，并检测特异性的血清抗体，也是目前监控猪流行性腹泻主要的手段，对猪流行性腹泻疫苗免疫效果评价、免疫程序制定、流行状态监测均具有重要意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgG抗体的方法。
[0007]—种检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgG抗体的方法，包括如下步骤:
1)猪流行性腹泻病毒抗原的制备和抗原包被96孔聚苯乙烯反应板；
2)将待测动物保定，从其前腔静脉处取血，将采集到的血液处理后获得血清一抗，保存备用;
3)将血清一抗，以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液1:50稀释后，按编号加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100ul，37°C饱和湿度反应I小时，以PBST洗涤备用；
4)将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体，以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液1:10000稀释后,按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加10ul，37°C饱和湿度反应2小时，以PBST洗涤备用；
5)将TMB显色剂按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加10ul，避光反应25分钟，随后每个反应孔加入10ul IM浓硫酸，终止反应；
6)放入酶标仪中，读取0D650数据，判定结果。
[0008]所述的步骤I)为:以pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释猪流行性腹泻病毒纯化抗原至16 TCID50/ml,以10ul/孔的浓度包被96孔聚苯乙烯ELISA反应板，并以质量百分比浓度5%的脱脂奶粉的PBST溶液封闭，获得ELISA反应的抗原基质，置于4°C备用。
[0009]所述的步骤3)为:以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液将待测猪血清中所含猪流行性腹泻病毒特异性IgG抗体1:50稀释后，按编号以10ul/孔的浓度加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，37°C饱和湿度反应I小时，以PBST洗涤备用；
所述的步骤4)为:以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体1:10000稀释后，按顺序以10ul/孔的浓度加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，37°C饱和湿度反应2小时，以PBST洗涤备用；
所述的步骤6)为:将终止后的96孔聚苯乙烯反应板，放入预热的酶标仪中，读取各反应孔的0D650数值，并根据以下公式判定结果:已知阴性样品的OD值< 0.4，而且已知阳性样品的OD值> 1.0 ;在上述条件成立的情况下，如果待检血清或初乳样品与已知阳性样品OD值的比值S/P彡0.5，则判为阳性；否则判为阴性。
[0010]本发明提供的猪流行性腹泻病毒血液IgG抗体采集和检测方法，相对于传统的猪流行性腹泻病毒检测方法，具有以下优点:1)可以对整个猪群实行大面积采样，避免猪群的屠宰采样；2)血液样品对温度、环境、污染物的抵抗力更强，运输和保存更方便；3)猪流行性腹泻病毒血液IgG抗体检测比抗原检测更快速、敏感、可靠；4)量化猪群的猪流行性腹泻免疫水平，所得数据更准确客观全面；5)可监控猪群的猪流行性腹泻免疫动态，预知猪群的免疫动向及管理。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1是检测猪血液中猪流行性腹泻病毒IgG特异性抗体的方法的过程示意图。
【具体实施方式】
[0012]检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgG抗体的方法包括如下步骤:
1)猪流行性腹泻病毒抗原的制备和抗原包被96孔聚苯乙烯反应板；
2)将待测动物保定，从其前腔静脉处取血，将采集到的血液处理后获得血清一抗，保存备用;
3)将血清一抗，以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液1:50稀释后，按编号加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100ul，37°C饱和湿度反应I小时，以PBST洗涤备用； 4)将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体，以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液1:10000稀释后,按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加10ul，37°C饱和湿度反应2小时，以PBST洗涤备用；
5)将TMB显色剂按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加10ul，避光反应25分钟，随后每个反应孔加入10ul IM浓硫酸，终止反应；
6)放入酶标仪中，读取0D650数据，判定结果。
[0013]所述的步骤I)为:以pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释猪流行性腹泻病毒纯化抗原至16 TCID50/ml,以10ul/孔的浓度包被96孔聚苯乙烯ELISA反应板，并以质量百分比浓度5%的脱脂奶粉的PBST溶液封闭，获得ELISA反应的抗原基质，置于4°C备用。
[0014]所述的步骤3)为:以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液将待测猪血清中所含猪流行性腹泻病毒特异性IgG抗体1:50稀释后，按编号以10ul/孔的浓度加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，37°C饱和湿度反应I小时，以PBST洗涤备用；
所述的步骤4)为:以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体1:10000稀释后，按顺序以10ul/孔的浓度加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，37°C饱和湿度反应2小时，以PBST洗涤备用；
所述的步骤6)为:将终止后的96孔聚苯乙烯反应板，放入预热的酶标仪中，读取各反应孔的0D650数值，并根据以下公式判定结果:已知阴性样品的OD值< 0.4，而且已知阳性样品的OD值> 1.0 ;在上述条件成立的情况下，如果待检血清样品与已知阳性样品OD值的比值S/P彡0.5，则判为阳性；否则判为阴性。
实施例
[0015]I)以商品化的猪流行性腹泻病毒，17 TCID50/ml (半数细胞感染量/毫升)浓度，感染Vero细胞，培养72小时后，收集病毒液，4000g离心lOmin，取上清；35000g离心lh，获得纯化病毒，并滴定TCID50。将抗原以pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释至16 TCID50/ml，以10ul/孔的浓度包被96孔聚苯乙烯ELISA反应板，饱和湿度下，4°C孵育16h。随后弃去包被液，拍干ELISA板，加入以PBST (pH7.3 PBS, 0.05% tween-20)稀释的5%脱脂奶粉溶液(PBST溶)200ul/孔，于22-28°C封闭lh。弃去封闭液，拍干ELISA板，每孔加入350 ul洗液(PBST)，洗涤I minX3次，拍干ELISA板，置于4°C备用，见图1。
[0016]2)将猪进行保定，先用75%酒精棉球对前腔静脉入针处进行局部消毒，再用干棉球擦干，用大拇指自始至终压住前腔静脉近心端，然后用消毒过的针头急刺远心端的前腔静脉，血液流出第一、二滴弃去后，接血，使血液沿着瓶壁流入，采到7毫升血液后，松开大拇指，血液即停止流出，用5%碘酊棉球压一下针孔即达到消毒止血。给采得血液注明号码，立即静置使其凝固，然后带到实验室，冬季于温暖处，夏季置于冷暗处，使血清析出。经10-12小时，将析出的血清倒入另一只消毒空瓶中。将血清编码，用于初步保存和运输(常温下、6小时内，或4°C下、72小时内运至实验室)。将血清以3000g离心5min，取上清，获得血清一抗，并与4°C (<7d)或-20°C (<60d)保存备用。
[0017]3)将处理备用的血清一抗，以3%脱脂奶粉溶液(PBST溶)1:50稀释后，按编号加入抗原包被的反应板上，10ul/孔，每个样品3个重复，同时设置阴性和血清阳性抗体对照各2孔。饱和湿度下，22-28°C孵育lh。随后弃去包被液，拍干ELISA板，每孔加入PBST 350ul洗液(PBST)，洗涤I minX4次，拍干ELISA板，备用，见图1。
[0018]4)将辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗猪IgG-FC抗体，以3%脱脂奶粉溶液(PBST溶)为稀释液，作1:10000倍稀释后，按10ul/孔加入到上述一抗包被的反应孔中，22-280C /饱和湿度反应2h，随后弃去包被液，拍干ELISA板，每孔加入PBST 350 ul洗液(PBST)，洗涤I minX5次，拍干ELISA板，备用，见图1。
[0019]5)将TMB显色液按10ul/孔加入到上述反应孔中，室温避光反应25min，随后加入10ul/孔终止液(IM浓硫酸)，终止反应，见图1。
[0020]6)将终止后的反应板，放入预热的酶标仪中，读取各反应孔的0D650数值，并根据以下公式判定结果:已知阴性样品的OD值彡0.4，而且已知阳性样品的OD值彡1.0 ;在上述条件成立的情况下，如果待检血清样品与已知阳性样品OD值的比值S/P ^ 0.5，则判为阳性；否则判为阴性。
【权利要求】
1.一种检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgG抗体的方法，其特征在于包括如下步骤: 1)猪流行性腹泻病毒抗原的制备和抗原包被96孔聚苯乙烯反应板； 2)将待测动物保定，从其前腔静脉处取血，将采集到的血液处理后获得血清一抗，保存备用; 3)将血清一抗，以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液1:50稀释后，按编号加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加lOOul，37°C饱和湿度反应1小时，以PBST洗涤备用； 4)将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体，以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液1:10000稀释后,按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加lOOul，37°C饱和湿度避光反应2小时，以PBST洗涤备用； 5)将TMB显色剂按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加lOOul，避光反应25分钟，随后每个反应孔加入lOOul 1M浓硫酸，终止反应； 6)放入酶标仪中，读取0D650数据，判定结果。
2.根据权利要求1所述的一种检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgG抗体的方法，其特征在于，所述的步骤1)为:以pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释猪流行性腹泻病毒纯化抗原至106 TCID50/ml,以lOOul/孔的浓度包被96孔聚苯乙烯ELISA反应板，并以质量百分比浓度5%的脱脂奶粉的PBST溶液封闭，获得ELISA反应的抗原基质，置于4°C备用。
3.根据权利要求1所述的一种检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgG抗体的方法，其特征在于，所述的步骤3)为:以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液将待测猪血清中所含猪流行性腹泻病毒特异性IgG抗体1:50稀释后，按编号以lOOul/孔的浓度加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，37°C饱和湿度反应1小时，以PBST洗涤备用。
4.根据权利要求1所述的一种检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgG抗体的方法，其特征在于，所述的步骤4)为:以质量百分比浓度3%的脱脂奶粉的PBST溶液将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体1:10000稀释后，按顺序以lOOul/孔的浓度加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，37°C饱和湿度反应2小时，以PBST洗涤备用。
5.根据权利要求1所述的一种检测猪血液中猪流行性腹泻病毒特异性IgG抗体的方法，其特征在于，所述的步骤6)为:将终止后的96孔聚苯乙烯反应板，放入预热的酶标仪中，读取各反应孔的0D650数值，并根据以下公式判定结果:已知阴性样品的0D值< 0.4，而且已知阳性样品的0D值彡1.0;在上述条件成立的情况下，如果待检血清样品与已知阳性样品0D值的比值S/P彡0.5，则判为阳性；否则判为阴性。
【文档编号】G01N33/569GK104330559SQ201410531939
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月11日 优先权日:2014年10月11日
【发明者】李龙, 于少芳, 曹洋洋 申请人:杭州贝尔塔生物技术有限公司