一种d-二聚体和fdp复合质控品及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种D-二聚体和FDP复合质控品及其制备方法。所述D-二聚体和FDP复合质控品的制备方法为：在钙离子存在的条件下，在血浆中加入凝血酶，使血浆完全凝固；捣碎凝固的血浆，加入酶溶液进行酶解反应以降解纤维蛋白，反应完全后，破坏酶活性以终止酶解反应，得到D-二聚体和FDP复合母液；用保护液D-二聚体和FDP复合母液进行稀释，使复合母液中D-二聚体和FDP达到目标浓度，获得复合质控品。本发明一次性制备可同时用于D-二聚体和FDP两个项目测试的复合质控品，制备方法简单、生产成本低。复合质控品冻干后复溶均一性好，15分钟即混合均匀，可替代进口产品同时用于D-二聚体和FDP的质量控制。
【专利说明】一种D-二聚体和FDP复合质控品及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于体外诊断试剂【技术领域】，尤其涉及一种D-二聚体和FDP复合质控品及 制备方法。
【背景技术】
[0002] 在血凝检验中，经常需要同时测定D-二聚体和纤维蛋白（原）降解产物（Fibrin/ FibringenDegradationPorducts，简称FDP)的含量。随着技术的发展，越来越多的血凝 检测通过自动化的血凝分析仪完成，为了监控仪器的运行情况，需要用到D-二聚体和纤维 蛋白（原）降解产物的质控品。
[0003] 从人血浆中直接分离D-二聚体、纤维蛋白（原）降解产物（FDP)来源有限、产量 低。从动物血浆中制备D-二聚体、纤维蛋白（原）降解产物质控品虽可解决来源问题，但 往往体系均一性不高。
[0004] 目前，已有D-二聚体质控品的报道。但没有同时含有D-二聚体和FDP的质控品， 因此，需要使用两种质控品，使用不便，且由于分别配制质控品的过程中的操作误差，影响 质控的准确度。
【发明内容】
[0005] 基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了D-二聚体和FDP复合质控 品及其制备方法。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
[0007] -种D-二聚体和FDP复合质控品的制备方法，包括如下步骤：
[0008] 1)在钙离子存在的条件下，在血浆中加入凝血酶，使血浆完全凝固；
[0009] 2)捣碎凝固的血浆，加入酶溶液进行酶解反应以降解纤维蛋白，反应完全后，破坏 酶活性以终止酶解反应，得到D-二聚体和FDP复合母液；
[0010] 3)用保护液对步骤2)得到的D-二聚体和FDP复合母液进行稀释，使复合母液中D-二聚体和FDP达到目标浓度，获得D-二聚体和FDP复合质控品。
[0011] 优选地，步骤1)中，采用钙离子溶液实现钙离子条件，所述钙离子溶液为浓度为 0.lmol/L-0. 5mol/L的氯化钙溶液，所述氯化钙溶液的加入体积为血浆体积的2% -10%。 本发明大大提高了钙离子的浓度，但是减少了加入的体积量，提升产物中高值质控品浓度。
[0012] 优选地，步骤1)中，所述凝血酶的用量为50IU-200IU/ml血浆。
[0013] 优选地，步骤2)中，35-38°C过夜酶解反应完全后，再升温至50°C-100°C保持2-8 小时，破坏酶活性以终止酶解反应。
[0014] 优选地，步骤2)中，所述酶溶液包括降解纤维蛋白的酶及其激活剂。降解纤维蛋 白的酶及其激活剂协同酶解，以控制降解反应，保证了获得D-二聚体和FDP稳定可控的浓 度。
[0015] 优选地，所述降解纤维蛋白的酶为葡激酶，所述激活剂为纤溶酶原。
[0016] 优选地，所述纤溶酶原的浓度为2mg/ml，所述葡激酶的浓度为lmg/ml，所述纤溶 酶原和葡激酶的体积用量比为1 :2。
[0017] 优选地，步骤1)中，所述血浆为外购人血浆来源商品化的纤维蛋白原（FIB)质控 品或牛血浆，优选采用商品化的纤维蛋白原（FIB)质控品。当采用牛血清时，所述牛血浆的 制备方法为：将牛的新鲜血液与〇. 109M的柠檬酸三钠以体积比9:1混合，2000g-3000g离 心20-40分钟，取上层，即得。
[0018] 优选地，步骤3)中，还包括D-二聚体和FDP达到目标浓度后冻干的步骤；步骤3) 中，所述保护液的成分为：磷酸盐1% -3% (w/v)，叠氮钠0.lg/1-lg/l，牛血清白蛋白20g/ L-50g/L，甘露醇 10g/L-30g/L。
[0019] 本发明还提供了上述制备方法制备得到的D-二聚体和FDP复合质控品。
[0020] 本发明还提供一种D-二聚体和FDP复合质控品，含有0. 1?5mg/L的D-二聚体 和 1 ?60mg/L的FDP。
[0021] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0022] 1、本发明的D-二聚体和FDP复合质控品的制备方法可一次性制备同时用于D-二 聚体和FDP两个项目测试的复合质控品，制备方法简单、生产成本低，每毫升血浆可制得 100毫升以上质控品；制备得到的复合质控品冻干后复溶均一性好，15分钟即混合均匀，可 替代进口产品同时用于D-二聚体和FDP的质量控制。
[0023] 2、本发明的D-二聚体和FDP复合质控品的制备方法通过在血浆中加入凝血酶促 进凝血，凝固更完全，此时血浆中可溶的纤维蛋白原完全转化为不溶的纤维蛋白，以便后续 控制降解的效果更佳，达到稳定的降解可控目的；
[0024] 3、本发明的D-二聚体和FDP复合质控品的制备方法采用商品化的人源血浆质控 品质量更稳定，生物风险低；采用牛血浆作为原材料则成本低廉，易于获取。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1为本发明实施例1的一种D-二聚体和FDP复合质控品的制备方法的流程示 意图。
【具体实施方式】
[0026] 为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结 合具体图示进一步阐述本发明。
[0027] 参照图1，一种D-二聚体和FDP复合质控品的制备方法，包括如下步骤：
[0028] 1)在钙离子存在的条件下，在血浆中加入凝血酶，室温下使血浆自然发生凝血过 程至完全凝固；此时血浆中可溶的纤维蛋白原完全转化为不溶的纤维蛋白。
[0029] 血浆采用外购人血浆来源商品化的纤维蛋白原（FIB)质控品或牛血浆。优选采用 商品化的纤维蛋白原（FIB)质控品。当采用牛血浆时，牛血浆来自动物屠宰场的新鲜血液， 制备方法为将血液与〇. 109M的柠檬酸三钠以9:1混合，2000g-3000g离心30分钟，上层即 为牛血浆。
[0030] 钙离子溶液为0.lmol/L-0. 5mol/L的氯化钙试剂，钙离子溶液的加入体积为血浆 体积的2% -10%。凝血酶用量为50IU-200IU/ml血浆。
[0031] 2)捣碎凝固的血浆，加入可以降解纤维蛋白的酶溶液，混合均匀后37°C过夜进行 酶解反应，反应完全后，升高温度至50°C-100°C，静置2-8小时彻底破坏酶活性以终止酶解 反应，得到D-二聚体和FDP复合母液；
[0032] 降解纤维蛋白的酶溶液至少包含纤溶酶原和葡激酶，纤溶酶原的终浓度不低于 1μg/ml血浆。纤溶酶原的活性单位优选10万IU/ml-40万IU/ml。葡激酶作为纤溶酶原 的激活剂，其活性单位优选50万IU/ml-350万IU/ml。
[0033] 3)用保护液对步骤2)得到的D-二聚体和FDP复合母液进行稀释，使用D-二聚 体和FDP检测试剂盒对稀释后的质控液进行测试，调整稀释比例使复合母液中D-二聚体和 FDP达到目标浓度，分装为小瓶后进行冻干，获得D-二聚体和FDP复合质控品。保护液的 成分包括磷酸盐1% -3% (w/v)，叠氮钠0·lg/1-lg/l，牛血清白蛋白20g/L-50g/L，甘露醇 10g/L-30g/L。该组分的保护液优选用于冻干，本领域技术人员能够理解，如果质控液不进 行冻干，可以采用其他组分的保护液，常规的具有稳定蛋白作用的保护液都可以用于本申 请的实施方式中，例如〇.lmol/L的PBS缓冲液（pH7. 0)、0. 9%的氯化钠、10%的牛血清白蛋 白。
[0034] 实施例1一种D-二聚体和FDP复合质控品的制备方法
[0035] 1)氯化钙溶液配制：称取0. 22g CaCl2. 2H20,加入5ml纯化水，搅拌使其溶解，得到 0· 3mol/L的氯化妈溶液。
[0036] 纤维蛋白凝块准备：取2个批号的外购FIB质控品各10支，每支分别加入Iml 纯化水复溶15分钟，中间间隔摇匀使之充分溶解，按批号分组，分别作为组l(10ml)、组 2(10ml);另取分别来自3头牛的新鲜牛血各9ml，与分别ImlO. 109M的柠檬酸三钠混合， 2000g离心30分钟，小心抽取上清液，3头牛得到的牛血浆分别记为组3、组4、组5。5组血 浆分别加入Iml0. 3mol/L的氯化钙溶液和500IU的凝血酶，摇匀，室温放置4小时，得到5 组交联的纤维蛋白凝块。
[0037] 2) D-二聚体和FDP复合母液的制备：
[0038]a.取1支纤溶酶原（活性单位是30万IU/ml)，加入Iml纯化水，使其溶解，得到 2mg/ml的纤溶酶原，待用。
[0039]b.取1支的葡激酶（活性单位是200IU/ml)，加入Iml纯化水，使其溶解30分钟， 得到lmg/ml的葡激酶，待用。
[0040] c.分别剪碎5组纤维蛋白凝块，各加入200μ1纤溶酶原和400μ1葡激酶，37°C， 120rpm摇床过夜。
[0041] d.检查过夜后的质控原液已完全溶解，置70°C水浴两小时后，冷却至室温，获得5 组D-二聚体和FDP复合母液，待用。
[0042] 3)保护液制备：称取Na2HPO4. 12H20 200g，叠氮钠3g，牛血清白蛋白350g，甘露醇 180g，加IOL纯化水搅拌至溶解，调pH值至7. 4,待用。
[0043]D-二聚体质控液制备：取5组各Iml的D-二聚体和FDP复合母液，用保护液分别 按1:400进行稀释获得质控液，使用D-二聚体和FDP检测试剂盒对稀释后的质控液进行测 试，按Iml每瓶进行分装，低温冻干，得到组1、组2、组3、组4、组5的D-二聚体和FDP复合 质控品。本领域技术人员能够理解，质控物有高值、中值、低值之分，根据需要改变稀释比 例，即可获得目标浓度的复合质控液。
[0044] 根据需要，可以获得含有0. 1?5mg/ml的D-二聚体和1?60mg/ml的FDP的复 合质控品。
[0045] 对上述组1、组2、组3、组4、组5的D-二聚体和FDP复合质控品进行下述检测：
[0046] 1)溶解性检测
[0047] 随机抽取冻干后5组各1瓶复合质控品，分别采用Iml纯化水溶解，间隔1分钟-2 分钟倒置轻微摇匀，观察各瓶均在15分组内溶解混合均匀，结果如下表1 :
[0048] 表 1
[0049]
[0050] 2)批间差检--
【权利要求】
1. 一种D-二聚体和FDP复合质控品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 在钙离子存在的条件下，在血浆中加入凝血酶，使血浆完全凝固； 2) 捣碎凝固的血浆，加入酶溶液进行酶解反应以降解纤维蛋白，反应完全后，破坏酶活 性以终止酶解反应，得到D-二聚体和FDP复合母液； 3) 用保护液对步骤2)得到的D-二聚体和FDP复合母液进行稀释，使复合母液中D-二 聚体和FDP达到目标浓度，获得D-二聚体和FDP复合质控品。
2. 根据权利要求1所述的D-二聚体和FDP复合质控品的制备方法，其特征在于，步骤 1)中，采用钙离子溶液实现钙离子条件，所述钙离子溶液为浓度为〇. lmol/L-O. 5mol/L的 氯化钙溶液，所述氯化钙溶液的加入体积为血浆体积的2% -10%。
3. 根据权利要求1所述的D-二聚体和FDP复合质控品的制备方法，其特征在于，步骤 1) 中，所述凝血酶的用量为50IU-200IU/ml血浆。
4. 根据权利要求1所述的D-二聚体和FDP复合质控品的制备方法，其特征在于，步骤 2) 中，35-38°C过夜酶解反应完全后，再升温至50°C _100°C保持2-8小时，破坏酶活性以终 止酶解反应。
5. 根据权利要求1所述的D-二聚体和FDP复合质控品的制备方法，其特征在于，步骤 2) 中，所述酶溶液含有降解纤维蛋白的酶及其激活剂。
6. 根据权利要求5所述的D-二聚体和FDP复合质控品的制备方法，其特征在于，所述 降解纤维蛋白的酶为葡激酶，所述激活剂为纤溶酶原；所述纤溶酶原的浓度为2mg/ml，所 述葡激酶的浓度为lmg/ml，所述纤溶酶原和葡激酶的体积用量比为1 :2。
7. 根据权利要求1所述的D-二聚体和FDP复合质控品的制备方法，其特征在于，步骤 1)中，所述血浆为外购人血浆来源商品化的纤维蛋白原质控品或牛血浆，所述牛血浆的制 备方法为：将牛的新鲜血液与0. 109M的柠檬酸三钠以体积比9:1混合，2000g-3000g离心 20-40分钟，取上层，即得。
8. 根据权利要求1所述的D-二聚体和FDP复合质控品的制备方法，其特征在于，步骤 3) 中，还包括D-二聚体和FDP达到目标浓度后冻干的步骤；步骤3)中，所述保护液的成分 为：磷酸盐1% -3% (w/v)，叠氮钠0? lg/1-lg/l，牛血清白蛋白20g/L-50g/L，甘露醇10g/ L_30g/L。
9. 权利要求1至8任一项所述的制备方法制备得到的D-二聚体和FDP复合质控品。
10. -种D-二聚体和FDP复合质控品，其特征在于，所述复合质控品含有0. 1?5mg/L 的D-二聚体和1?60mg/L的FDP。
【文档编号】G01N1/28GK104458367SQ201410619619
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月6日 优先权日:2014年11月6日
【发明者】艾峰, 肖国伟, 潘仁斌 申请人:上海长岛生物技术有限公司