一种电化学发光适配体传感器、其制备方法及其用途
一种电化学发光适配体传感器、其制备方法及其用途
【专利摘要】本发明涉及一种电化学发光适配体传感器、其制备方法及其用途，更具体而言，本发明涉及一种基于Eu(III)-MWCNTs作为发光材料构建的电化学发光适配体传感器、其制备方法，以及由该方法制备的电化学发光适配体传感器在测定凝血酶中的用途。本发明的电化学发光适配体传感器表现出优良的准确性、稳定性、重现性与高的灵敏度，对推广适配体传感器在疾病预防、疾病诊断和药物筛选中的实际应用具有重要的意义。
【专利说明】一种电化学发光适配体传感器、其制备方法及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种电化学发光适配体传感器、其制备方法及其用途，更具体而言，本发明涉及一种基于Eu (III)-多壁碳纳米管(MWCNTs)作为发光材料构建的电化学发光适配体传感器、其制备方法，以及由该方法制备的电化学发光适配体传感器在测定凝血酶中的用途。
【背景技术】
[0002]凝血酶是由凝血酶原活化变成的丝氨酸蛋白质水解酶。它在炎症、血液凝固和创伤愈合等方面发挥着极其重要的作用，常用于毛细血管出血的局部止血和外科手术后组织的愈合。凝血酶的浓度及活性作为衡量凝血机制的重要指标之一，对早期诊断、疗效及愈后判断具有十分重要的意义。因此建立准确、快速、高灵敏检测凝血酶浓度的方法是十分必要的。在传统检测方法中，凝血酶的检测主要是利用抗体与抗原之间的特异作用，然而由于抗体在制备、保存等方面存在缺点，因此在一定程度上限制了它的发展。适配体与抗体类似，除了可以与很多目标分子高亲和力、高特异性地结合，而且还具有许多抗体无法比拟的优点，例如:(I)目标分子范围广泛；(2)体外筛选、化学合成；(3)分子量小；(4)性质稳定。这对提高传感器的使用寿命、稳定性、再生性等非常有利。由于适配体具有以上提及的许多优点，将适体一配体识别技术与其他分析方法结合而发展形成了各种形式的适配体传感器，主要有荧光适配体传感器、电化学适配体传感器以及电化学发光(ECL)适配体传感器等。其中电化学发光适配体传感器集成了电化学发光传感器和适配体两方面的优势，既具有电化学发光传感器的高灵敏度、仪器简单、可进行原位发光分析等优点，又具有适配体的高选择性和特异性，从而提高了传感器的灵敏度、选择性和稳定性，在凝血酶检测方面具有广阔的应用前景。
[0003]目前，常见的电化学发光物质主要有钌联吡啶及其衍生物、鲁米诺及其衍生物、发光纳米材料。近期，通过对发光纳米粒子在生物体内循环和安全性的研究，人们发现除了含毒性元素的纳米粒子(如CdSe量子点)在生物体内具有毒副作用外，其他生物相容性好的纳米材料(如ZnO、S12, Au等)也表现出了毒性，而且交叉学科的研究证实了在同样尺寸下发光纳米材料中的碳纳米材料在生物体内毒性表现最低，所以目前发光碳纳米材料被认为是一种非常理想的具有应用前景的检测材料，备受人们的广泛关注。发光功能化碳纳米材料不仅在化学稳定性、生物相容性、低毒性等方面都具有明显的优势，此外还具有光学性能稳定、水溶性好、易功能化等优点。因此开发既具有载体功能又具有发光功能的碳纳米材料在生命科学和材料科学研究中具有重要意义，而Eu (III)-MWCNTs作为发光材料用于构建检测凝血酶的电化学发光适配体传感器尚未见报道。
[0004]本发明将金掺杂的石墨烯滴涂到玻碳电极表面，用于固定捕获探针，Eu(III)-MWCNTs作为发光材料，利用杂交链式反应信号放大和基于核酸外切酶RecJf的目标物循环信号放大策略，制备了检测凝血酶的电化学发光适配体传感器，测试结果显示，上述方法制备的电化学发光适配体传感器的灵敏度、选择性和稳定性高，基于上述发现，发明人完成了本发明。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是提供一种电化学发光适配体传感器，所述电化学发光适配体传感器包括:工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰金掺杂的石墨烯、捕获探针与凝血酶适配体的混合溶液、巯基己醇(MCH)、含0.15U/μ L RecJf 的凝血酶、NH2-DNAl 和 NH2_DNA2 的混合溶液和 Eu (III) -MWCNTs。
[0006]本发明的再一个目的在于提供一种电化学发光适配体传感器的制备方法，所述方法制备的传感器灵敏度高、重现性好。
[0007]本发明的另一目的是提供所述电化学发光适配体传感器在测定凝血酶中的用途。
[0008]为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的。
[0009]本发明的电化学发光适配传感器包括:工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰金掺杂的石墨烯、捕获探针与凝血酶适配体的混合溶液、巯基己醇、含0.15 U/μ L RecJf的凝血酶、NH2-DNAl和NH2_DNA2的混合溶液和Eu (III) -MWCNTs0所述工作电极与参比电极、对电极组成电化学发光适配体传感器来检测凝血酶。所述参比电极为Ag/AgCl电极，所述对电极为钼丝电极。所述捕获探针为5’ -SH- (CH2)「ΑΛΤ TGG AGT CAC CCC AAC CTG CCC TAC CAC GGA CT-3’，凝血酶适配体为5’-AAA AGT CCG TGG TAG GGC AGG TGG GGG TGA CT-(CH2) 6_3’。所述 NH2-DNAl 片段序列为 5，-NH2- (CH2) 6-AGT CAC CCC AAC CTG CCC TAC CAC GGA CTT GM ACA GTC CGT GGT AGGGCA GGT TGG GGT GAC TCC AAT T-(CH2) 6-NH2_3，，NH2_DNA2 片段序列为 5，-NH2-(CH2) 6_GTTTCA AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGA CTA ATT GGA GTC ACC CCA ACC TGC CCT ACCACG GAC T- (CH2) 6_ΝΗ2_3，。
[0010]本发明的电化学发光适配体传感器的制备方法包括以下步骤:
a、合成Eu(In)-MWCNTs纳米材料；
b、制备电化学发光适配体传感器工作电极； d、制作电化学发光适配体传感器工作曲线。
[0011]其中，步骤a的合成Eu(Iii)-MWCNTs纳米材料，具体包括以下步骤:
①稀土配合物Eu(TTA)3的合成:将含有1.0 mo I/L KOH的乙醇溶液和五水硝酸铕混合，然后加入15 mL的乙醇和2-噻吩甲酰三氟丙酮(与五水硝酸铕的物质的量之比3:1)，混合溶液在搅拌下加热至60 °C反应6 h。冷却至室温后加水继续搅拌30 min，得到的固体用乙醇重结晶，经空气中干燥后放于五氧化二磷干燥器中干燥24 h即得到白色的稀土配合物 Eu (TTA)3O
[0012]②Eu(III)-MWCNTs的合成:将羧基化的多壁碳纳米管、无水二氯甲烷(DCM)和草酰氯(体积比为40:1)混合后在室温下搅拌12 h，通过减压蒸馏去除DCM后得到酰氯功能化的MWCNTs并真空干燥2 h。将上述得到的酰氯功能化的MWCNTs重新分散在20 mL DCM中，超声10 min,然后加入含有6，6- 二氨基-2，2-联吡啶(与羧基化的多壁碳纳米管的质量之比为3:1)的10 mL DCM,混合物在室温下搅拌24 h，过滤，并用15 mL的DCM冲洗3次，真空干燥后得到稀土配合物修饰的多壁碳纳米管。称取稀土配合物修饰的多壁碳纳米管，上述步骤①制备的Eu(TAA)3 (质量之比为1:2)和10 mL DCM混合，在室温下搅拌28 h后过滤，用150 mL DCM洗涤，真空干燥后得到Eu (III)-MWCNTs。
[0013]步骤b的制备电化学发光适配体传感器工作电极的方法，具体包括以下步骤:
①将玻碳电极表面进行抛光处理使其表面光洁；
②配制浓度为Img/mL的金掺杂的石墨烯溶液。然后将金掺杂的石墨烯溶液滴到电极上，室温晾干；
③将捕获探针与凝血酶适配体混合溶液滴到电极表面，4V孵化12 h；
④再在电极表面修饰2mmol/L的MCH溶液以消除电极的非特异性活性位点。用pH为7.4的PBS溶液对电极进行清洗，晾干后，滴上一系列不同浓度的凝血酶(含0.15 U/μ LRecJf)溶液，放置 40 min ；
⑤将NH2-DNAl和NH2-DNA2的混合溶液修饰到电极上，放置Ih；
⑥EDC和NHS(50 mmol/L)加入到1.5 mg/mL Eu (III)-MWCNTs中得到混合溶液并将其滴到电极上，放置2 h，即得到电化学发光适配体传感器的工作电极。
[0014]步骤c的制作电化学发光适配体传感器工作曲线，步骤如下:
①将参比电极一Ag/AgCl电极、对电极一钼丝电极和上述制备的工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增光的高压设置为800 V，扫描电压设置为-2.0?O V ;
②pH7.4的PBS缓冲溶液(含0.10 mol/L的K2S2O8)作为底液，通过电化学发光法检测不同浓度的凝血酶产生的电化学发光信号强度；根据所得的电化学发光强度与凝血酶浓度的线性关系，绘制工作曲线。
[0015]本发明的另一方面提供上述方法制备的电化学发光适配体传感器在测定凝血酶中的用途。
[0016]本发明的有益成果:
(I)本发明的发明人首次将Eu (III) -MWCNTs作为新型发光材料引入到凝血酶的电化学发光适配体传感器的制备当中，利用Eu(III)-MWCNTs具有高的量子产率、低毒性和长的发光寿命，使所制作的传感器有更高的灵敏度。
[0017](2)在本发明的制备方法中，利用核酸外切酶RecJf选择性地剪切目标物凝血酶特异性结合的适配体，从而释放出来凝血酶，释放出的凝血酶将继续和其适配体结合，这样可使一个待测目标物凝血酶产生多个信号单元，放大了检测信号，提高了传感器的灵敏度。
[0018](3)NH2-DNA1和NH2_DNA2片段序列在电极表面通过碱基互补配对进行杂交链式反应形成一条长的双链DNA，利用氨基和羧基的作用，从而引入更多的Eu(III) - MWCNTs发光材料，因此进一步增强了 ECL的信号。
[0019](4)该传感器集成了适配体和电化学发光传感器两方面的优势，因此本发明的电化学发光适配体传感器表现出了优良的准确性、稳定性、重现性与高的灵敏度，对推广适配体传感器在疾病预防、疾病诊断和药物筛选中的实际应用具有重要的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]下面结合【专利附图】
【附图说明】和具体实施例对本发明做进一步详细描述。
[0021]图1为本发明的(a)不存在凝血酶和核酸外切酶RecJf, (b)存在凝血酶(浓度为5.0X 10_9 mol/L)而不存在核酸外切酶RecJf, (c)存在凝血酶(浓度为5.0X 10_9 mol/U和核酸外切酶RecJf时的光强-电位图。
[0022]为了考察核酸外切酶RecJf是否具有放大ECL信号的作用，本实验对比研究了有无核酸外切酶RecJf存在时的光强-电位曲线图。从图1中可以看出，无目标物凝血酶存在时，ECL的强度较低(曲线a)。当有凝血酶存在而无核酸外切酶RecJf时发光信号有所增强(曲线b)。当在凝血酶中加上核酸外切酶RecJf后发光信号明显增强(曲线c)，表明核酸外切酶RecJf确实具有放大发光信号的作用。
【具体实施方式】
[0023]本发明使用的凝血酶购自Sigma公司，捕获探针、凝血酶适配体、NH2-DNAl片段序列和NH2-DNA2片段序列均购自上海生工生物工程有限公司，羧基化的多壁碳纳米管购自南京先丰纳米材料科技有限公司，核酸外切酶RecJf购自美国NEB公司，K2S2O8购自上海爱建设试剂厂有限公司，巯基己醇购自阿拉丁试剂有限公司，无水乙醇(分析纯)购自天津市福宁精细化工有限公司，铁氰化钾购于国药集团化学试剂有限公司，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)U-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)购自上海思域化工有限公司，磷酸二氢钾、磷酸氢二钠均购于天津市广成化学试剂有限公司，除了玻碳电极用超纯水清洗外，整个实验过程用的均是二次水。
[0024]CHI760D电化学工作站购自上海辰华仪器有限公司，MP1-F流动注射化学发光检测仪购自西安瑞迈分析仪器有限公司。
[0025]实施例1制备电化学发光适配体传感器
(I)合成Eu(In)-MWCNTs纳米材料
稀土配合物Eu(TTA)3的合成:将9mL含有1.0 mo I/L KOH的乙醇溶液和1.28 g (3mmol)的五水硝酸铕混合,然后加入15 mL的乙醇和2 g 2-噻吩甲酰三氟丙酮(9 mmol),混合溶液在搅拌下加热至60 °C反应6 h。冷却至室温后加水继续搅拌30 min，得到的固体用乙醇重结晶，经空气中干燥后放于五氧化二磷干燥器中干燥24 h即得到白色的稀土配合物 Eu (TTA)3；
Eu(III)-MWCNTs的合成:在50 mL的圆底烧瓶中将100 mg的羧基化的多壁碳纳米管、20 mL的无水二氯甲烷(DCM)和0.5 mL的草酰氯混合后在室温下搅拌12 h，通过减压蒸馏去除DCM后得到酰氯功能化的MWCNTs并真空中干燥2 h。将上述得到的酰氯功能化的MWCNTs重新分散在20 mL DCM中，超声10 min，然后加入含有300 mg的6，6-二氨基-2，2-联吡啶的10 mL DCM,混合物在室温下搅拌24 h，过滤，并用15 mL的DCM冲洗3次，真空干燥后得到稀土配合物修饰的多壁碳纳米管。称取50 mg稀土配合物修饰的多壁碳纳米管、100 mg上述步骤①制备的Eu(TAA)3和10 mL DCM混合，在室温下搅拌28 h后将所得物过滤，用150 mL DCM洗涤，真空干燥后得到Eu (III)-MWCNTs。
[0026](2)制备电化学发光适配体传感器工作电极
①将直径为4mm的玻碳电极用1.0、0.3、0.05 mm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2?0.6 V扫描，使峰电位差小于110 mV，用超纯水清洗电极表面，吹干；
②配制浓度为Img/mL的金掺杂的石墨烯溶液。然后取6 KL金掺杂的石墨烯溶液滴到电极上，室温晾干； ③将10yL 2 μ mol/L的捕获探针与凝血酶适配体混合溶液滴到电极表面，4 V孵化 12 h ;
④再在电极表面修饰5μ L 2 mmol/L的MCH溶液以消除电极的非特异性活性位点。用PH为7.4的PBS溶液对电极进行清洗，晾干后，滴上10 μ L—系列不同浓度的凝血酶(含0.15 U/μ L RecJf)溶液，放置 40 min ；
⑤将10μ L I μ mol/L的NH2-DNAl和NH2_DNA2的混合溶液修饰到电极上，放置Ih ；
⑥EDC和NHS(50 mmol/L)加入到1.5 mg/mL Eu (III)-MWCNTs中得到混合溶液，取其6 PL滴到电极上，放置2 h，即得到电化学发光适配体传感器的工作电极。
[0027](3)制作电化学发光适配体传感器工作曲线
将参比电极一Ag/AgCl电极、对电极一钼丝电极和上述制备的工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增光的高压设置为800 V，扫描电压设置为-2.0?O V ;
PH 7.4的PBS缓冲溶液(含0.10 mol/L的K2S2O8)作为底液，通过电化学发光法检测不同浓度的凝血酶产生的电化学发光信号强度；根据所得的电化学发光强度与凝血酶浓度的线性关系，绘制工作曲线。
[0028]实施例2凝血酶的检测
按照实施例1所述的步骤制备电化学发光适配体传感器用于凝血酶的检测。凝血酶的线性范围为 5 ΧΙΟ—9 ?1.0 ΧΙΟ—12 mol/L，检出限为 0.23 pmol/L。
[0029]将实施例2得到的结果和文献进行了对比。通过对比可以发现，本发明的电化学发光适配体传感器的检出限较低，线性范围较宽，具有较高的灵敏度，这为凝血酶的实际测定奠定了基础。
[0030]实施例3人血清中凝血酶的检测
对人血清中的凝血酶进行了测定和加标回收实验，根据实施例2所得工作曲线，计算血清中凝血酶的含量。三次测定结果表明，人体血样的三次测定结果分别为0.589,0.618、0.603 nmol/L，平均凝血酶含量为0.603 nmol/L。同时采用标准加入法，其凝血酶的加入量为0.500 nmol/L,得到的平均回收率为96.8%，相对标准偏差为2.4%。说明本发明的制备方法得到的电化学发光适配体传感器具有较高的准确度和精密度。
【权利要求】
1.一种电化学发光适配体传感器的制备方法,所述电化学发光适配体传感器包括:工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰金掺杂的石墨烯、捕获探针与凝血酶适配体的混合溶液、巯基己醇(MCH)、含0.15 U/μ L RecJf的凝血酶、NH2-DNAl和NH2-DNA2的混合溶液和Eu(III)-多壁碳纳米管(MWCNTs)，所述参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为钼丝电极，所述捕获探针为5’-SH-(CH2)6-AAT TGG AGT CACCCC AAC CTG CCC TAC CAC GGA CT-3’，凝血酶适配体为 5’ -AAA AGT CCG TGG TAG GGC AGGTGG GGG TGA CT-(CH2) 6_3’，所述 NH2-DNAl 片段序列为 5’-NH2-(CH2) 6_AGT CAC CCC AACCTG CCC TAC CAC GGA CTT GAA ACA GTC CGT GGT AGG GCA GGT TGG GGT GAC TCC AATT-(CH2) 6-NH2-3’，NH2-DNA2 片段序列为 5’-NH2-(CH2)6-GTT TCA AGT CCG TGG TAG GGC AGGTTG GGG TGA CTA ATT GGA GTC ACC CCA ACC TGC CCT ACC ACG GAC T-(CH2) 6_NH2_3’ ； 其特征在于，所述制备方法包括以下步骤: a、合成Eu(In)-MWCNTs纳米材料； b、制备电化学发光适配体传感器工作电极； C、制作电化学发光适配体传感器工作曲线； 其中，步骤a合成Eu(III)-MWCNTs纳米材料的具体步骤如下: ①稀土配合物Eu(TTA)3的合成:将含有1.0 mo I/L KOH的乙醇溶液和五水硝酸铕混合，然后加入15 mL的乙醇和2-噻吩甲酰三氟丙酮(与五水硝酸铕的物质的量之比3:1)，混合溶液在搅拌下加热至60 °C反应6 h，冷却至室温后加水继续搅拌30 min，得到的固体用乙醇重结晶，经空气中干燥后放于五氧化二磷干燥器中干燥24 h即得到白色的稀土配合物 Eu (TTA)3； ②Eu(III)-MWCNTs的合成:将羧基化的多壁碳纳米管、无水二氯甲烷(DCM)和草酰氯(体积比为40:1)混合后在室温下搅拌12 h，通过减压蒸馏去除DCM后得到酰氯功能化的MWCNTs并真空干燥2 h，将上述得到的酰氯功能化的MWCNTs重新分散在20 mL DCM中，超声10 min，然后加入含有6，6-二氨基-2，2-联吡啶(与羧基化的多壁碳纳米管的质量之比为3:1)的1mL DCM,混合物在室温下搅拌24 h，过滤，并用15 mL的DCM冲洗3次，真空干燥后得到稀土配合物修饰的多壁碳纳米管，称取稀土配合物修饰的多壁碳纳米管，上述步骤①制备的Eu (TAA)3 (质量之比为1:2)和10 mL DCM混合，在室温下搅拌28 h后过滤，用150 mL DCM洗涤，真空干燥后得到Eu (III)-MWCNTs ； 步骤b制备电化学发光适配体传感器工作电极的具体步骤如下: ①将玻碳电极表面进行抛光处理使其表面光洁； ②配制浓度为Img/mL的金掺杂的石墨烯溶液,然后将金掺杂的石墨烯溶液滴到电极上，室温晾干； ③将捕获探针与凝血酶适配体混合溶液滴到电极表面，4V孵化12 h； ④再在电极表面修饰2mmol/L的MCH溶液以消除电极的非特异性活性位点，用pH为7.4的PBS溶液对电极进行清洗，晾干后，滴上一系列不同浓度的凝血酶(含0.15 U/μ LRecJf)溶液，放置 40 min ； ⑤将NH2-DNAl和NH2-DNA2的混合溶液修饰到电极上，放置Ih； ⑥EDC和NHS(50 mmol/L)加入到1.5 mg/mL Eu (III)-MWCNTs中得到混合溶液并将其滴到电极上，放置2 h，即得到电化学发光适配体传感器的工作电极； 步骤C制作电化学发光适配体传感器工作曲线的具体步骤如下: ①将参比电极一Ag/AgCl电极、对电极一钼丝电极和上述制备的工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增光的高压设置为800 V，扫描电压设置为-2.0?O V ; ②pH7.4的PBS缓冲溶液(含0.10 mol/L的K2S2O8)作为底液，通过电化学发光法检测不同浓度的凝血酶产生的电化学发光信号强度；根据所得的电化学发光强度与凝血酶浓度的线性关系，绘制工作曲线。
2.如权利要求1所述的电化学发光适配体传感器在测定凝血酶中的用途。
【文档编号】G01N21/76GK104374765SQ201410647639
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月17日 优先权日:2014年11月17日
【发明者】吴丹, 魏琴, 胡丽华, 庞雪辉, 马洪敏 申请人:济南大学
【专利摘要】本发明涉及一种电化学发光适配体传感器、其制备方法及其用途，更具体而言，本发明涉及一种基于Eu(III)-MWCNTs作为发光材料构建的电化学发光适配体传感器、其制备方法，以及由该方法制备的电化学发光适配体传感器在测定凝血酶中的用途。本发明的电化学发光适配体传感器表现出优良的准确性、稳定性、重现性与高的灵敏度，对推广适配体传感器在疾病预防、疾病诊断和药物筛选中的实际应用具有重要的意义。
【专利说明】一种电化学发光适配体传感器、其制备方法及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种电化学发光适配体传感器、其制备方法及其用途，更具体而言，本发明涉及一种基于Eu (III)-多壁碳纳米管(MWCNTs)作为发光材料构建的电化学发光适配体传感器、其制备方法，以及由该方法制备的电化学发光适配体传感器在测定凝血酶中的用途。
【背景技术】
[0002]凝血酶是由凝血酶原活化变成的丝氨酸蛋白质水解酶。它在炎症、血液凝固和创伤愈合等方面发挥着极其重要的作用，常用于毛细血管出血的局部止血和外科手术后组织的愈合。凝血酶的浓度及活性作为衡量凝血机制的重要指标之一，对早期诊断、疗效及愈后判断具有十分重要的意义。因此建立准确、快速、高灵敏检测凝血酶浓度的方法是十分必要的。在传统检测方法中，凝血酶的检测主要是利用抗体与抗原之间的特异作用，然而由于抗体在制备、保存等方面存在缺点，因此在一定程度上限制了它的发展。适配体与抗体类似，除了可以与很多目标分子高亲和力、高特异性地结合，而且还具有许多抗体无法比拟的优点，例如:(I)目标分子范围广泛；(2)体外筛选、化学合成；(3)分子量小；(4)性质稳定。这对提高传感器的使用寿命、稳定性、再生性等非常有利。由于适配体具有以上提及的许多优点，将适体一配体识别技术与其他分析方法结合而发展形成了各种形式的适配体传感器，主要有荧光适配体传感器、电化学适配体传感器以及电化学发光(ECL)适配体传感器等。其中电化学发光适配体传感器集成了电化学发光传感器和适配体两方面的优势，既具有电化学发光传感器的高灵敏度、仪器简单、可进行原位发光分析等优点，又具有适配体的高选择性和特异性，从而提高了传感器的灵敏度、选择性和稳定性，在凝血酶检测方面具有广阔的应用前景。
[0003]目前，常见的电化学发光物质主要有钌联吡啶及其衍生物、鲁米诺及其衍生物、发光纳米材料。近期，通过对发光纳米粒子在生物体内循环和安全性的研究，人们发现除了含毒性元素的纳米粒子(如CdSe量子点)在生物体内具有毒副作用外，其他生物相容性好的纳米材料(如ZnO、S12, Au等)也表现出了毒性，而且交叉学科的研究证实了在同样尺寸下发光纳米材料中的碳纳米材料在生物体内毒性表现最低，所以目前发光碳纳米材料被认为是一种非常理想的具有应用前景的检测材料，备受人们的广泛关注。发光功能化碳纳米材料不仅在化学稳定性、生物相容性、低毒性等方面都具有明显的优势，此外还具有光学性能稳定、水溶性好、易功能化等优点。因此开发既具有载体功能又具有发光功能的碳纳米材料在生命科学和材料科学研究中具有重要意义，而Eu (III)-MWCNTs作为发光材料用于构建检测凝血酶的电化学发光适配体传感器尚未见报道。
[0004]本发明将金掺杂的石墨烯滴涂到玻碳电极表面，用于固定捕获探针，Eu(III)-MWCNTs作为发光材料，利用杂交链式反应信号放大和基于核酸外切酶RecJf的目标物循环信号放大策略，制备了检测凝血酶的电化学发光适配体传感器，测试结果显示，上述方法制备的电化学发光适配体传感器的灵敏度、选择性和稳定性高，基于上述发现，发明人完成了本发明。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是提供一种电化学发光适配体传感器，所述电化学发光适配体传感器包括:工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰金掺杂的石墨烯、捕获探针与凝血酶适配体的混合溶液、巯基己醇(MCH)、含0.15U/μ L RecJf 的凝血酶、NH2-DNAl 和 NH2_DNA2 的混合溶液和 Eu (III) -MWCNTs。
[0006]本发明的再一个目的在于提供一种电化学发光适配体传感器的制备方法，所述方法制备的传感器灵敏度高、重现性好。
[0007]本发明的另一目的是提供所述电化学发光适配体传感器在测定凝血酶中的用途。
[0008]为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的。
[0009]本发明的电化学发光适配传感器包括:工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰金掺杂的石墨烯、捕获探针与凝血酶适配体的混合溶液、巯基己醇、含0.15 U/μ L RecJf的凝血酶、NH2-DNAl和NH2_DNA2的混合溶液和Eu (III) -MWCNTs0所述工作电极与参比电极、对电极组成电化学发光适配体传感器来检测凝血酶。所述参比电极为Ag/AgCl电极，所述对电极为钼丝电极。所述捕获探针为5’ -SH- (CH2)「ΑΛΤ TGG AGT CAC CCC AAC CTG CCC TAC CAC GGA CT-3’，凝血酶适配体为5’-AAA AGT CCG TGG TAG GGC AGG TGG GGG TGA CT-(CH2) 6_3’。所述 NH2-DNAl 片段序列为 5，-NH2- (CH2) 6-AGT CAC CCC AAC CTG CCC TAC CAC GGA CTT GM ACA GTC CGT GGT AGGGCA GGT TGG GGT GAC TCC AAT T-(CH2) 6-NH2_3，，NH2_DNA2 片段序列为 5，-NH2-(CH2) 6_GTTTCA AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGA CTA ATT GGA GTC ACC CCA ACC TGC CCT ACCACG GAC T- (CH2) 6_ΝΗ2_3，。
[0010]本发明的电化学发光适配体传感器的制备方法包括以下步骤:
a、合成Eu(In)-MWCNTs纳米材料；
b、制备电化学发光适配体传感器工作电极； d、制作电化学发光适配体传感器工作曲线。
[0011]其中，步骤a的合成Eu(Iii)-MWCNTs纳米材料，具体包括以下步骤:
①稀土配合物Eu(TTA)3的合成:将含有1.0 mo I/L KOH的乙醇溶液和五水硝酸铕混合，然后加入15 mL的乙醇和2-噻吩甲酰三氟丙酮(与五水硝酸铕的物质的量之比3:1)，混合溶液在搅拌下加热至60 °C反应6 h。冷却至室温后加水继续搅拌30 min，得到的固体用乙醇重结晶，经空气中干燥后放于五氧化二磷干燥器中干燥24 h即得到白色的稀土配合物 Eu (TTA)3O
[0012]②Eu(III)-MWCNTs的合成:将羧基化的多壁碳纳米管、无水二氯甲烷(DCM)和草酰氯(体积比为40:1)混合后在室温下搅拌12 h，通过减压蒸馏去除DCM后得到酰氯功能化的MWCNTs并真空干燥2 h。将上述得到的酰氯功能化的MWCNTs重新分散在20 mL DCM中，超声10 min,然后加入含有6，6- 二氨基-2，2-联吡啶(与羧基化的多壁碳纳米管的质量之比为3:1)的10 mL DCM,混合物在室温下搅拌24 h，过滤，并用15 mL的DCM冲洗3次，真空干燥后得到稀土配合物修饰的多壁碳纳米管。称取稀土配合物修饰的多壁碳纳米管，上述步骤①制备的Eu(TAA)3 (质量之比为1:2)和10 mL DCM混合，在室温下搅拌28 h后过滤，用150 mL DCM洗涤，真空干燥后得到Eu (III)-MWCNTs。
[0013]步骤b的制备电化学发光适配体传感器工作电极的方法，具体包括以下步骤:
①将玻碳电极表面进行抛光处理使其表面光洁；
②配制浓度为Img/mL的金掺杂的石墨烯溶液。然后将金掺杂的石墨烯溶液滴到电极上，室温晾干；
③将捕获探针与凝血酶适配体混合溶液滴到电极表面，4V孵化12 h；
④再在电极表面修饰2mmol/L的MCH溶液以消除电极的非特异性活性位点。用pH为7.4的PBS溶液对电极进行清洗，晾干后，滴上一系列不同浓度的凝血酶(含0.15 U/μ LRecJf)溶液，放置 40 min ；
⑤将NH2-DNAl和NH2-DNA2的混合溶液修饰到电极上，放置Ih；
⑥EDC和NHS(50 mmol/L)加入到1.5 mg/mL Eu (III)-MWCNTs中得到混合溶液并将其滴到电极上，放置2 h，即得到电化学发光适配体传感器的工作电极。
[0014]步骤c的制作电化学发光适配体传感器工作曲线，步骤如下:
①将参比电极一Ag/AgCl电极、对电极一钼丝电极和上述制备的工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增光的高压设置为800 V，扫描电压设置为-2.0?O V ;
②pH7.4的PBS缓冲溶液(含0.10 mol/L的K2S2O8)作为底液，通过电化学发光法检测不同浓度的凝血酶产生的电化学发光信号强度；根据所得的电化学发光强度与凝血酶浓度的线性关系，绘制工作曲线。
[0015]本发明的另一方面提供上述方法制备的电化学发光适配体传感器在测定凝血酶中的用途。
[0016]本发明的有益成果:
(I)本发明的发明人首次将Eu (III) -MWCNTs作为新型发光材料引入到凝血酶的电化学发光适配体传感器的制备当中，利用Eu(III)-MWCNTs具有高的量子产率、低毒性和长的发光寿命，使所制作的传感器有更高的灵敏度。
[0017](2)在本发明的制备方法中，利用核酸外切酶RecJf选择性地剪切目标物凝血酶特异性结合的适配体，从而释放出来凝血酶，释放出的凝血酶将继续和其适配体结合，这样可使一个待测目标物凝血酶产生多个信号单元，放大了检测信号，提高了传感器的灵敏度。
[0018](3)NH2-DNA1和NH2_DNA2片段序列在电极表面通过碱基互补配对进行杂交链式反应形成一条长的双链DNA，利用氨基和羧基的作用，从而引入更多的Eu(III) - MWCNTs发光材料，因此进一步增强了 ECL的信号。
[0019](4)该传感器集成了适配体和电化学发光传感器两方面的优势，因此本发明的电化学发光适配体传感器表现出了优良的准确性、稳定性、重现性与高的灵敏度，对推广适配体传感器在疾病预防、疾病诊断和药物筛选中的实际应用具有重要的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]下面结合【专利附图】
【附图说明】和具体实施例对本发明做进一步详细描述。
[0021]图1为本发明的(a)不存在凝血酶和核酸外切酶RecJf, (b)存在凝血酶(浓度为5.0X 10_9 mol/L)而不存在核酸外切酶RecJf, (c)存在凝血酶(浓度为5.0X 10_9 mol/U和核酸外切酶RecJf时的光强-电位图。
[0022]为了考察核酸外切酶RecJf是否具有放大ECL信号的作用，本实验对比研究了有无核酸外切酶RecJf存在时的光强-电位曲线图。从图1中可以看出，无目标物凝血酶存在时，ECL的强度较低(曲线a)。当有凝血酶存在而无核酸外切酶RecJf时发光信号有所增强(曲线b)。当在凝血酶中加上核酸外切酶RecJf后发光信号明显增强(曲线c)，表明核酸外切酶RecJf确实具有放大发光信号的作用。
【具体实施方式】
[0023]本发明使用的凝血酶购自Sigma公司，捕获探针、凝血酶适配体、NH2-DNAl片段序列和NH2-DNA2片段序列均购自上海生工生物工程有限公司，羧基化的多壁碳纳米管购自南京先丰纳米材料科技有限公司，核酸外切酶RecJf购自美国NEB公司，K2S2O8购自上海爱建设试剂厂有限公司，巯基己醇购自阿拉丁试剂有限公司，无水乙醇(分析纯)购自天津市福宁精细化工有限公司，铁氰化钾购于国药集团化学试剂有限公司，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)U-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)购自上海思域化工有限公司，磷酸二氢钾、磷酸氢二钠均购于天津市广成化学试剂有限公司，除了玻碳电极用超纯水清洗外，整个实验过程用的均是二次水。
[0024]CHI760D电化学工作站购自上海辰华仪器有限公司，MP1-F流动注射化学发光检测仪购自西安瑞迈分析仪器有限公司。
[0025]实施例1制备电化学发光适配体传感器
(I)合成Eu(In)-MWCNTs纳米材料
稀土配合物Eu(TTA)3的合成:将9mL含有1.0 mo I/L KOH的乙醇溶液和1.28 g (3mmol)的五水硝酸铕混合,然后加入15 mL的乙醇和2 g 2-噻吩甲酰三氟丙酮(9 mmol),混合溶液在搅拌下加热至60 °C反应6 h。冷却至室温后加水继续搅拌30 min，得到的固体用乙醇重结晶，经空气中干燥后放于五氧化二磷干燥器中干燥24 h即得到白色的稀土配合物 Eu (TTA)3；
Eu(III)-MWCNTs的合成:在50 mL的圆底烧瓶中将100 mg的羧基化的多壁碳纳米管、20 mL的无水二氯甲烷(DCM)和0.5 mL的草酰氯混合后在室温下搅拌12 h，通过减压蒸馏去除DCM后得到酰氯功能化的MWCNTs并真空中干燥2 h。将上述得到的酰氯功能化的MWCNTs重新分散在20 mL DCM中，超声10 min，然后加入含有300 mg的6，6-二氨基-2，2-联吡啶的10 mL DCM,混合物在室温下搅拌24 h，过滤，并用15 mL的DCM冲洗3次，真空干燥后得到稀土配合物修饰的多壁碳纳米管。称取50 mg稀土配合物修饰的多壁碳纳米管、100 mg上述步骤①制备的Eu(TAA)3和10 mL DCM混合，在室温下搅拌28 h后将所得物过滤，用150 mL DCM洗涤，真空干燥后得到Eu (III)-MWCNTs。
[0026](2)制备电化学发光适配体传感器工作电极
①将直径为4mm的玻碳电极用1.0、0.3、0.05 mm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2?0.6 V扫描，使峰电位差小于110 mV，用超纯水清洗电极表面，吹干；
②配制浓度为Img/mL的金掺杂的石墨烯溶液。然后取6 KL金掺杂的石墨烯溶液滴到电极上，室温晾干； ③将10yL 2 μ mol/L的捕获探针与凝血酶适配体混合溶液滴到电极表面，4 V孵化 12 h ;
④再在电极表面修饰5μ L 2 mmol/L的MCH溶液以消除电极的非特异性活性位点。用PH为7.4的PBS溶液对电极进行清洗，晾干后，滴上10 μ L—系列不同浓度的凝血酶(含0.15 U/μ L RecJf)溶液，放置 40 min ；
⑤将10μ L I μ mol/L的NH2-DNAl和NH2_DNA2的混合溶液修饰到电极上，放置Ih ；
⑥EDC和NHS(50 mmol/L)加入到1.5 mg/mL Eu (III)-MWCNTs中得到混合溶液，取其6 PL滴到电极上，放置2 h，即得到电化学发光适配体传感器的工作电极。
[0027](3)制作电化学发光适配体传感器工作曲线
将参比电极一Ag/AgCl电极、对电极一钼丝电极和上述制备的工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增光的高压设置为800 V，扫描电压设置为-2.0?O V ;
PH 7.4的PBS缓冲溶液(含0.10 mol/L的K2S2O8)作为底液，通过电化学发光法检测不同浓度的凝血酶产生的电化学发光信号强度；根据所得的电化学发光强度与凝血酶浓度的线性关系，绘制工作曲线。
[0028]实施例2凝血酶的检测
按照实施例1所述的步骤制备电化学发光适配体传感器用于凝血酶的检测。凝血酶的线性范围为 5 ΧΙΟ—9 ?1.0 ΧΙΟ—12 mol/L，检出限为 0.23 pmol/L。
[0029]将实施例2得到的结果和文献进行了对比。通过对比可以发现，本发明的电化学发光适配体传感器的检出限较低，线性范围较宽，具有较高的灵敏度，这为凝血酶的实际测定奠定了基础。
[0030]实施例3人血清中凝血酶的检测
对人血清中的凝血酶进行了测定和加标回收实验，根据实施例2所得工作曲线，计算血清中凝血酶的含量。三次测定结果表明，人体血样的三次测定结果分别为0.589,0.618、0.603 nmol/L，平均凝血酶含量为0.603 nmol/L。同时采用标准加入法，其凝血酶的加入量为0.500 nmol/L,得到的平均回收率为96.8%，相对标准偏差为2.4%。说明本发明的制备方法得到的电化学发光适配体传感器具有较高的准确度和精密度。
【权利要求】
1.一种电化学发光适配体传感器的制备方法,所述电化学发光适配体传感器包括:工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰金掺杂的石墨烯、捕获探针与凝血酶适配体的混合溶液、巯基己醇(MCH)、含0.15 U/μ L RecJf的凝血酶、NH2-DNAl和NH2-DNA2的混合溶液和Eu(III)-多壁碳纳米管(MWCNTs)，所述参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为钼丝电极，所述捕获探针为5’-SH-(CH2)6-AAT TGG AGT CACCCC AAC CTG CCC TAC CAC GGA CT-3’，凝血酶适配体为 5’ -AAA AGT CCG TGG TAG GGC AGGTGG GGG TGA CT-(CH2) 6_3’，所述 NH2-DNAl 片段序列为 5’-NH2-(CH2) 6_AGT CAC CCC AACCTG CCC TAC CAC GGA CTT GAA ACA GTC CGT GGT AGG GCA GGT TGG GGT GAC TCC AATT-(CH2) 6-NH2-3’，NH2-DNA2 片段序列为 5’-NH2-(CH2)6-GTT TCA AGT CCG TGG TAG GGC AGGTTG GGG TGA CTA ATT GGA GTC ACC CCA ACC TGC CCT ACC ACG GAC T-(CH2) 6_NH2_3’ ； 其特征在于，所述制备方法包括以下步骤: a、合成Eu(In)-MWCNTs纳米材料； b、制备电化学发光适配体传感器工作电极； C、制作电化学发光适配体传感器工作曲线； 其中，步骤a合成Eu(III)-MWCNTs纳米材料的具体步骤如下: ①稀土配合物Eu(TTA)3的合成:将含有1.0 mo I/L KOH的乙醇溶液和五水硝酸铕混合，然后加入15 mL的乙醇和2-噻吩甲酰三氟丙酮(与五水硝酸铕的物质的量之比3:1)，混合溶液在搅拌下加热至60 °C反应6 h，冷却至室温后加水继续搅拌30 min，得到的固体用乙醇重结晶，经空气中干燥后放于五氧化二磷干燥器中干燥24 h即得到白色的稀土配合物 Eu (TTA)3； ②Eu(III)-MWCNTs的合成:将羧基化的多壁碳纳米管、无水二氯甲烷(DCM)和草酰氯(体积比为40:1)混合后在室温下搅拌12 h，通过减压蒸馏去除DCM后得到酰氯功能化的MWCNTs并真空干燥2 h，将上述得到的酰氯功能化的MWCNTs重新分散在20 mL DCM中，超声10 min，然后加入含有6，6-二氨基-2，2-联吡啶(与羧基化的多壁碳纳米管的质量之比为3:1)的1mL DCM,混合物在室温下搅拌24 h，过滤，并用15 mL的DCM冲洗3次，真空干燥后得到稀土配合物修饰的多壁碳纳米管，称取稀土配合物修饰的多壁碳纳米管，上述步骤①制备的Eu (TAA)3 (质量之比为1:2)和10 mL DCM混合，在室温下搅拌28 h后过滤，用150 mL DCM洗涤，真空干燥后得到Eu (III)-MWCNTs ； 步骤b制备电化学发光适配体传感器工作电极的具体步骤如下: ①将玻碳电极表面进行抛光处理使其表面光洁； ②配制浓度为Img/mL的金掺杂的石墨烯溶液,然后将金掺杂的石墨烯溶液滴到电极上，室温晾干； ③将捕获探针与凝血酶适配体混合溶液滴到电极表面，4V孵化12 h； ④再在电极表面修饰2mmol/L的MCH溶液以消除电极的非特异性活性位点，用pH为7.4的PBS溶液对电极进行清洗，晾干后，滴上一系列不同浓度的凝血酶(含0.15 U/μ LRecJf)溶液，放置 40 min ； ⑤将NH2-DNAl和NH2-DNA2的混合溶液修饰到电极上，放置Ih； ⑥EDC和NHS(50 mmol/L)加入到1.5 mg/mL Eu (III)-MWCNTs中得到混合溶液并将其滴到电极上，放置2 h，即得到电化学发光适配体传感器的工作电极； 步骤C制作电化学发光适配体传感器工作曲线的具体步骤如下: ①将参比电极一Ag/AgCl电极、对电极一钼丝电极和上述制备的工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增光的高压设置为800 V，扫描电压设置为-2.0?O V ; ②pH7.4的PBS缓冲溶液(含0.10 mol/L的K2S2O8)作为底液，通过电化学发光法检测不同浓度的凝血酶产生的电化学发光信号强度；根据所得的电化学发光强度与凝血酶浓度的线性关系，绘制工作曲线。
2.如权利要求1所述的电化学发光适配体传感器在测定凝血酶中的用途。
【文档编号】G01N21/76GK104374765SQ201410647639
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月17日 优先权日:2014年11月17日
【发明者】吴丹, 魏琴, 胡丽华, 庞雪辉, 马洪敏 申请人:济南大学
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