牛肉中氟诺喹酮类药物残留的测定方法
【专利摘要】本发明公开了牛肉中氟诺喹酮类药物残留的测定方法，包括以下步骤：精确称取牛肉试样，加入超声提取溶剂后萃取，将萃取液离心，得到的离心后上清液过反相固相萃取柱净化，再以5mL甲醇洗脱，得到的洗脱液在温度60℃下用氮吹仪吹干，再以流动相溶解后，以0.22μm滤膜过滤到进样瓶里，上带有荧光检测器的高效液相色谱仪进行测定即可。本发明的有益效果为：本发明提供的牛肉中氟诺喹酮类药物残留的测定方法，对萃取时间和提取液用量两个最主要的因素进行了优化，得到了最佳的超声萃取时间和提取液物料比，具有提取效果好，耗时短，灵敏度、精密度和准确度好等优点，适合用于牛肉样品中氟喹诺酮类药物残留的快速检测。
【专利说明】牛肉中氟诺喹酮类药物残留的测定方法
[0001]
【技术领域】
[0002] 本发明涉及肉制品药物残留的测定方法，具体涉及牛肉中氟诺喹酮类药物残留的 测定方法。
【背景技术】
[0003] 氟喹诺酮是一类抗菌药，作用机制是：抑制细菌DNA螺旋酶，阻碍DNA复制。氟喹 诺酮类对G-杆菌，包括绿脓杆菌均有良好抗菌作用，对G+球菌也具一定抗菌活性，尤其对 耐药G-杆菌，仍可呈现敏感。临床用于治疗尿路、肠道、呼吸道以及皮肤软组织、腹腔、骨关 节等感染。任何药物都有副作用，氟喹诺酮也不例外，而且由于氟喹诺酮类药物的广 泛应用，常常有不合理用药和滥用药情况发生，氟喹诺酮药物的不良反应主要发生在人 类，动物则反应不大，但动物用药后的药物残留可以通过食物链传播，同样会引起人类 不良反应现象的发生，影响人类健康，为此，对动物体内氟喹诺酮的残留检测已越来越 引起人们的重视。
[0004] 超声波提取分离主要是依据物质中有效成分和有效成分群体的存在状态、极性、 溶解性等设计的一项学科。合理利用超声波振动的方法进行提取的新工艺，使溶剂快速地 进入固体物质中，将其物质所含的有机成分尽可能完全地溶于溶剂之中，得到多成分混合 提取液。利用超声波技术来强化提取分离过程，可有效提高提取分离率，缩短提取时间、节 约成本、甚至还可以提高产品的质量和产量。超声波提取(也称为超声波萃取）以其提取 温度低、提取率高、提取时间短的独特优势被具有创新意识者应用于中药材和各种动、植物 有效含量的提取，是替代传统剪切工艺方法实现高效、节能、环保式提取的现代高新技术手 段。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种牛肉中氟诺喹酮类药 物残留的测定方法。
[0006] 为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：牛肉中氟诺喹酮类药物残留的测 定方法，包括以下步骤： 1) 精确称取牛肉试样1. 99-2.Olg，放入50mL的具塞磨口锥形瓶中，按照每lg牛肉试 样加入2. 5mL-12. 5mL的比例加入超声提取溶剂，盖紧塞子后置于超声清洗仪上进行萃取， 萃取时间为5-25min，得到萃取液； 2) 将步骤1)得到的萃取完毕后的萃取液立即离心，离心转速为8000r/m，离心时间 6min，得到离心后上清液； 3) 将步骤2)得到的离心后上清液过反相固相萃取柱净化，再以5mL甲醇洗脱，得到洗 脱液； 4)将步骤3)得到的洗脱液在温度60°C下用氮吹仪吹干，再以流动相溶解后，以 0. 22ym滤膜过滤到进样瓶里，上带有荧光检测器的高效液相色谱仪进行测定即可。
[0007] 进一步的，上述的牛肉中氟诺喹酮类药物残留的测定方法，所述步骤1)中，牛肉试 样重量为2g;超声提取溶剂为按照体积比计乙腈：10%三氯乙酸溶液为30 :70 ;所述超声提 取溶剂的加入比例为每lg牛肉试样加入7. 5mL超声提取溶剂；所述萃取时间为20min。
[0008] 进一步的，上述的牛肉中氟诺喹酮类药物残留的测定方法，所述步骤3)中，反相固 相萃取柱需先用3mL甲醇和3mL水依次活化。
[0009] 进一步的，上述的牛肉中氟诺喹酮类药物残留的测定方法，所述步骤4)中，流动相 为按照体积比计柠檬酸/乙酸铵缓冲液：乙腈为82 :18,流速为0. 8mL/min，柱温为25°C，进 样体积为20yL，荧光检测器激发波长为280nm，发射波长为450nm。
[0010] 本发明的有益效果为：本发明提供的牛肉中氟诺喹酮类药物残留的测定方法，是 将超声萃取技术应用到牛肉中氟喹喏酮类药物残留的检测当中，采用超声萃取技术来提取 牛肉当中残留氟喹喏酮类药物，并对萃取时间和提取液用量两个最主要的因素进行了优 化，得到了最佳的超声萃取时间和提取液物料比，超声提取的样品经固相萃取净化后，用带 有荧光检测器的高效液相色谱仪进行测定，该方法具有提取效果好，耗时短，灵敏度、精密 度和准确度好等优点，适合用于牛肉样品中氟喹诺酮类药物残留的快速检测。该方法的回 收率在62-97%之间，相对标准偏差RSD< 15%，最低检出限为介于4. 05-13. 3i!g/kg之间。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1为牛肉加标25iig/kg的色谱图。
【具体实施方式】
[0012] 本发明所用试剂及仪器： 仪器： KQ-600DE型超声清洗仪：昆山超声清洗仪器厂； XS205型电子天平：MettlerToledo公司； 组织均楽仪：美国waters公司； H-2050R型湘雅离心机； 氮吹仪：美国waters公司； Waters2695型高效液相色谱仪(配有突光检测器）：美国waters公司； SunFireTMC18柱：4.6 mmX250mm，5um，美国waters公司。
[0013]试剂： 柠檬酸、乙酸铵、三氯乙酸和氢氧化钠均为分析纯试剂：购自上海国药集团； 甲醇、乙腈：色谱纯，购自比利时fisher公司； 实验用水为超纯水； 环丙沙星、恩诺沙星、达氟沙星和沙拉沙星标准品：购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。
[0014] 柠檬酸/乙酸铵缓冲液制备方法：称取10. 6g柠檬酸和7. 9g乙酸铵，用纯水定容 至ljlmL，滴加三乙胺lmL，过0. 22iim滤膜备用即可。
[0015] 超声提取液制备方法：体积比为30:70的乙腈一 10%三氯乙酸溶液，量取300mL 乙腈和700mL10%三氯乙酸溶液互溶。
[0016] 实施例1 : 1、超声提取： 精确称取试样2. 0±0. 01g，放入50mL的具塞磨口锥形瓶中，加入一定量的提取液为 提取液，盖紧塞子，置于超声清洗仪上进行萃取，萃取完毕后将萃取液立即离心，上清液过 固相萃取小柱净化，甲醇洗脱，洗脱液在60°C下用氮吹仪吹干。最后用流动相溶解，过滤到 进样瓶里面，上高效液相色谱仪测定。
[0017] 2、液相色谱仪器方法： 流动相为柠檬酸/乙酸铵缓冲液-乙腈（V:V=82:18)，流速为1.0mL/min，柱温25°C， 进样体积20yl，荧光检测器激发波长：280nm，发射波长450nm。
[0018] 3、超声提取条件的优化： 氟喹诺酮类药物具有相似的化学性质和物理性质，因此选择环丙沙星为代表，采用牛 肉样品中加标环丙沙星标准溶液（25yg/kg)，经处理后，测定环丙沙星色谱峰峰面积，峰面 积可以反应最佳的提取条件。
[0019] 1)提取时间： 其他条件不变，分别设定超声提取时间为5min、lOmin、15min、20min和25min为单因素 条件，测定不同超声提取时间下的加标环丙沙星牛肉样品的色谱峰峰面积，超声提取提取 时间对提取效果的影响结果如表1所示。随着超声提取时间的延长，样品中环丙沙星的检 出峰面积逐渐增大；20min后，渐趋稳定。随着超声时间的延长会造成阿维菌素类药物的 损失，因此15min为最佳超声萃取时间。
[0020] 表 1
【权利要求】
1. 牛肉中氟诺喹酮类药物残留的测定方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 精确称取牛肉试样1. 99-2. Olg，放入50mL的具塞磨口锥形瓶中，按照每lg牛肉试 样加入2. 5mL-12. 5mL的比例加入超声提取溶剂，盖紧塞子后置于超声清洗仪上进行萃取， 萃取时间为5-25min，得到萃取液； 2) 将步骤1)得到的萃取完毕后的萃取液立即离心，离心转速为8000r/m，离心时间 6min，得到离心后上清液； 3) 将步骤2)得到的离心后上清液过反相固相萃取柱净化，再以5ml甲醇洗脱，得到洗 脱液； 4) 将步骤3)得到的洗脱液在温度60°C下用氮吹仪吹干，再以流动相溶解后，以 0. 22 y m滤膜过滤到进样瓶里，上带有荧光检测器的高效液相色谱仪进行测定即可。
2. 根据权利要求1所述的牛肉中氟诺喹酮类药物残留的测定方法，其特征在于，所述 步骤1)中，牛肉试样重量为2g ;超声提取溶剂为按照体积比计乙腈：10%三氯乙酸溶液为 30 :70 ;所述超声提取溶剂的加入比例为每lg牛肉试样加入7. 5mL超声提取溶剂；所述萃 取时间为20min。
3. 根据权利要求2所述的牛肉中氟诺喹酮类药物残留的测定方法，其特征在于，所述 步骤3)中，反相固相萃取柱需先用3ml甲醇和3ml水依次活化。
4. 根据权利要求3所述的牛肉中氟诺喹酮类药物残留的测定方法，其特征在于，所述 步骤4)中，流动相为按照体积比计柠檬酸/乙酸铵缓冲液：乙腈为82 :18,流速为0. 8mL/ min，柱温为25°C，进样体积为20 y L，荧光检测器激发波长为280nm，发射波长为450nm。
【文档编号】G01N30/02GK104330497SQ201410666699
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年11月20日 优先权日:2014年11月20日
【发明者】熊琳, 高雅琴, 李维红, 郭天芬, 杨晓玲 申请人:中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所