一种超敏感超顺磁性纳米免疫微球及其检测GP73抗原的方法与流程

本发明属于诊断试剂技术领域，涉及磁性免疫体外诊断试剂，特别涉及一种表面偶联有GP73单克隆抗体的超顺磁性纳米免疫微球，及利用该微球采用双抗体夹心酶免法或化学发光法检测人血清或血浆中GP73抗原的方法。

背景技术：
肝癌是常见的恶性肿瘤之一,“早诊、早治”是防治肝癌的关键。目前临床上对肝癌的诊断方法主要是影像学和血清标志物甲胎蛋白(AFP)的检测，早期肝癌直径小，影像学几乎检测不到，AFP诊断敏感性较低(25％)，会漏检一部分早期肝癌患者。高尔基体蛋白73(GP73)被认为是目前最好的肝癌早期诊断血清学标志物之一，其检测敏感性和特异性均高于AFP。国内外已有的GP73试剂均为传统的酶联免疫方法，该方法的不足之处在于检测灵敏度较低，反应时间较长。磁性纳米微球具有超顺磁性，具有巨大的比表面积和可以偶联多种生物分子的特点。在无外加磁场时磁性纳米微球均匀分散在溶液中，使抗原-抗体快速、高效反应，在外加磁场的作用下，超顺磁性纳米微球可快速移动，通过吸附、洗涤、解吸附等操作步骤从复杂的生物化学混合物体系中分离得到目标分子；传统的酶联免疫方法是通过物理吸附将生物分子固定在酶标板表面，因而限制了该方法的敏感性和稳定性。磁性纳米微球有巨大的比表面积，可偶联更大量的生物分子，并且通过双功能化学试剂将生物分子共价偶联在其表面，因而大大提高反应速度、检测灵敏度和稳定性。

技术实现要素：
为了解决现有技术中肝癌诊断试剂检测用时长、抗体固定容量小、灵敏度较低和稳定性较差的技术问题，为了解决传统酶联免疫方法中固定的抗体容量较小、反应时间较长、灵敏度相对较低和固定的抗体稳定性较低的技术问题，本发明提供一种GP73单克隆抗体及一种表面偶联有GP73单克隆抗体的超顺磁性纳米免疫微球，及利用该微球采用双抗体夹心酶免法或化学发光法检测人血清或血浆中GP73抗原的方法。用于产生所述GP73单克隆抗体的抗原具有下述氨基酸序列：AAAERGAVELKK。本发明提供的超顺磁性纳米免疫微球具有偶联更多抗体、免疫反应速度较快、特异性高、重复性好、成本低、实验条件要求简单等特点。本发明提供的超顺磁性纳米免疫微球，及利用该微球检测GP73抗原的方法，能够用于肝癌早期诊断。为达到上述目的，本发明的技术解决方案是：本发明提供一种用于检测GP73抗原的单克隆抗体，用于产生所述单克隆抗体的抗原具有下述氨基酸序列：AAAERGAVELKK(参见序列1)。进一步的，所述单克隆抗体是CGMCC保藏编号9806的GP73单克隆抗体杂交瘤细胞产生的抗体。用于检测GP73抗原的抗体称为GP73抗体。所述GP73单克隆抗体具有高免疫活性。GP73抗体针对GP73抗原的超保守部位(PCSite)，因此具有高度敏感性和特异性。本发明还提供一种超顺磁纳米免疫微球，所述纳米免疫微球包括纳米微球，所述纳米微球上偶联有所述GP73单克隆抗体。所述超顺磁纳米免疫微球可简称为磁性免疫微球。所述GP73单克隆抗体通过双功能化学试剂共价偶联在磁性纳米微球表面。所述双功能化学试剂是戊二醛，或，EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)碳二亚胺。进一步的，所述超顺磁纳米免疫微球中，所述纳米微球包括微球核心和无机小分子，所述无机小分子覆盖在微球核心的表面形成无机小分子层，所述纳米微球通过无机小分子偶联所述抗体。所述微球核心表面覆盖薄层无机小分子，可减少非特异性吸附。所述微球表面利用-NH2，-COOH，或PEI(聚醚酰亚胺)进行表面化学修饰。所述微球核心的材质是四氧化三铁，所述微球核心的直径尺寸为6-12nm；所述微球的直径为10～30nm。进一步的，所述微球核心的直径尺寸为8nm。所述的超顺磁纳米免疫微球中，所述无机小分子是二氧化硅(SiO2)。本发明还提供一种用于检测GP73的多克隆抗体，用于产生所述多克隆抗体的抗原选自下述氨基酸序列的片段：QMKEVKEQCEERIEEVTKKGNEAVASRDLSENNDQRQQLQALSEPQPRLQAAGLPHTEVPQGKGNVLGNSKSQTPAPSSEVVLDSKRQVEKEETNEIQVVNEEPQRDRLPQEPGREQVVEDRPVGGRGFGGAGELGQTPQVQAALSVSQENPEMEGPERDQLVIPDGQEEEQEAAGEGRNQQKLRGEDDYNMDENEAESETDKQAALAGNDRNIDVFNVEDQKRDTINLLDQREKRNHTL(参见序列5)。用于检测GP73抗原的多克隆抗体称为GP73多克隆抗体。所述GP73多克隆抗体上偶联酶标记物。进一步的，用于产生所述多克隆抗体的抗原为下述氨基酸序列中至少两种氨基酸序列的组合：MKEVKEQCE(参见序列2)；EAVASRDLS(参见序列3)；PERDQLVIP(参见序列4)。本发明还提供一种制备上述纳米免疫微球的方法，所述方法包括下述步骤：(1)取50-200μl超顺磁性纳米微球；(2)对微球表面进行化学修饰；(3)将双功能化学试剂共价偶联在磁性纳米微球表面；(4)用洗涤液进行洗涤；a.将超顺磁性纳米微球加入400-800μl洗涤液，并使之分散；b.磁性分离，弃上清液；(5)加入浓度为0.5～3mg/ml的GP73单克隆抗体溶液，恒温振荡反应；(6)磁性分离，弃上清液；(7)用相同洗涤液进行洗涤；a.每次加入洗涤液400-800μl，并使之分散；b.磁性分离，弃上清液；c.重复以上洗涤步骤2-3次；d.加入0.5～2ml贮存液，4℃保存备用。所述洗涤液为0.01～0.2M的碳酸盐缓冲液，PH＝8.0～9.5；或0.01～0.2M的三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液，PH＝7.0～7.6。所述GP73单克隆抗体的溶液采用碳酸盐缓冲液，PH＝8.0～9.5；或0.01～0.2M的三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液，PH＝7.0～7.6。所述贮存液为0.01～0.2M的PB，PH＝7.0～8.0；或0.01～0.2M的Tris-HCl，PH＝7.0～8.0；所述贮存液中均加入防腐剂，所述防腐剂为0.01～0.2％的NaN3或者0.01～0.2％的硫柳汞。所述防腐剂的浓度单位为重量(克)体积比(毫升)。所述第(5)步中恒温振荡反应的温度为4～40℃，反应时间为10～60分钟，振动速度为180～200rpm。本发明还提供一种杂交瘤细胞株，其是CGMCC保藏编号9806的GP73单克隆抗体杂交瘤细胞株。本发明还提供一种利用所述的超顺磁性纳米免疫微球检测GP73抗原的方法(简称显色检测法)，所述方法包括下述步骤：(1)将试管置于试管架上，设阳性对照试管孔2孔，阴性对照试管孔3孔，空白对照孔1孔；(2)在待检样品试管中加入10～50μl样品稀释液和5～100μl的待检样品，阳性对照管和阴性对照管中分别加入阳性对照样品和阴性对照样品50～100μl；(3)充分混匀已加贮存液的含有GP73单克隆抗体的超顺磁性纳米免疫微球溶液后，用加样器向各反应试管中加入5～50μl该微球溶液，混匀，4～40℃反应0.5～2小时；(4)各试管加入5～50μl已偶联GP73多克隆抗体的酶标记物，混匀，4～40℃反应0.5～2小时；(5)用相同洗涤液洗涤各管至少2次：a.每次加入洗涤液400-800μl，并使之分散，b.磁性分离，弃上清液；(6)各管加入50～200μl3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)显色液，混匀，4～40℃反应10～30分钟；(7)各管加入50～200μl终止液，混匀，磁性分离，将上清液移至专用于酶标仪上进行吸光度值(OD)测量的酶标板孔中，在酶标仪上用450nm和630nm进行双波长测定各孔OD值。本发明还提供另一种利用上述的超顺磁性纳米免疫微球检测GP73抗原的方法(简称化学发光检测法)，所述方法包括下述步骤：(1)将试管置于试管架上，设阳性对照试管孔2孔，阴性对照试管孔3孔，空白对照孔1孔；(2)在待检样品试管中加入10～50μl样品稀释液和5～100μl的待检样品，阳性对照管和阴性对照管中各加入阳性对照样品和阴性对照样品50～100μl；(3)充分混匀已加贮存液的上述的含有GP73单克隆抗体的超顺磁性纳米免疫微球溶液后，各管加入5～50μl该微球溶液，混匀，4～40℃反应0.5～2小时；(4)各管加入5～50μl已偶联上述的GP73多克隆抗体的酶标记物，混匀，4～40℃反应0.5～2小时；(5)用相同洗涤液洗涤各管至少2次：a.每次加入洗涤液400-800μl，并使之分散；b.磁性分离，弃上清液；(6)各管加入50～200μl化学发光物质溶液，该化学发光物质是：3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(AMPPD)；(7)用化学发光仪器检测各孔的信号值。上述检测GP73抗原的方法中，所述样品稀释液为0.01～0.2M的PBST，PH＝5.0～8.0；或0.01～0.2M的Tris-HCl，PH＝4.0～7.8；或0.001～10M的CBS，PH＝9.0～11.0；或0.001～10M的醋酸盐缓冲液，PH＝3.0～7.0；或0.001～10M的柠檬酸缓冲液，PH＝3.0～8.0。所述洗涤液为0.01～0.2M的PBST，PH＝7.0～8.0；或0.01～0.2M的Tris-HCl，PH＝7.0～7.6。所述终止液为0.01～4M的H2SO4，或0.01～4M的HCl，或0.01～4M的柠檬酸。上述检测GP73抗原的方法中，所述超顺磁性纳米免疫微球上偶联的GP73单克隆抗体与酶标记物上偶联的GP73多克隆抗体识别不同的GP73抗原表位。上述检测GP73抗原的方法中，酶标记物偶联的GP73多克隆抗体与GP73抗原可溶性切割片段特异性结合。因此，本发明提供的GP73多克隆抗体针对血浆中游离的GP73具有高度特异性和敏感性。本发明提供的GP73多克隆抗体是利用酶标记的多克隆抗体，能够多方位地与GP73抗原的不同表位相结合，因此提高检测的灵敏度。本发明还提供一种用于检测GP73抗原的试剂盒，所述试剂盒包括上述的超顺磁纳米免疫微球，和上述的GP73多克隆抗体。上述试剂盒利用纯化的大肠杆菌表达的GP73全长融合蛋白作为标准品，系列稀释后定量检测血浆中GP73。本发明提供的超顺磁纳米微球上偶联的GP73单克隆抗体针对GP73超保守部位(PCSite)下游，例如下游的12个氨基酸，该表位在不同种属生物进化过程中仍然保守，而且在GP73被裂解后，作为细胞外部分可在血浆中检测到。因此，针对该部位的单克隆抗体具有最佳的敏感性，大大提高了人群自然变异GP73的检出率。酶标记物上偶联的GP73多克隆抗体，针对胞浆内游离GP73酸性区末端的序列。因此，对血浆中游离的GP73具有高度特异性和敏感性；利用多克隆抗体针对多个表位，使酶标信号获得扩大，提高了检测的灵敏度。本发明以超顺磁性纳米微球作为反应和分离的固相载体，合成表面偶联GP73单克隆抗体的超顺磁性免疫微球，该微球与被检人血清或血浆中GP73抗原特异性结合，形成抗原-抗体复合物，再和标记物标记的GP73多克隆抗体特异性抗体结合，应用相应的检测系统，定性或定量检测人血清或血浆中GP73特异性抗原。本发明所获得的细胞株能够特异性的分泌针对GP73抗原的单克隆抗体，所产生的抗体具有较好的灵敏度和较高的特异性。本发明提供的GP73单克隆抗体，具有较好的灵敏度和较高的特异性。与现有技术相比，本发明将磁性纳米微球与效价高、特异性强的GP73单克隆抗体结合，解决了传统酶联免疫方法中固定的抗体容量较小、反应时间较长、灵敏度相对较低和固定的抗体稳定性较低的技术问题，具有偶联更多抗体、免疫反应速度较快、特异性高、重复性好、成本低、实验条件要求简单等特点。具体的，本发明具有下述优点：1、检测速度快，约1小时左右，特异性高，稳定性和重复性好。2、采用超顺磁性纳米微球作为反应和分离载体，明显提高了检测的灵敏度和稳定性，可检测的最低抗原浓度为100pg/ml，灵敏度达90.5％，特异性84％，AUROC：0.909。4℃储存，稳定性好。检测过程中：(1)在无外加磁场时，磁性纳米微球均匀分散在溶液中，使抗原和抗体的反应类似于均相反应，加速了抗原-抗体复合物的形成；(2)在外加磁场的作用下，超顺磁性纳米微球可快速移动，通过吸附、洗涤、解吸附等操作步骤从复杂的生物化学混合物体系中分离得到目标分子；(3)磁性纳米微球有巨大的比表面积，可偶联更大量的生物分子，检测灵敏度高，范围宽，对于高浓度的标本无需稀释可直接定量测定，避免了稀释误差和基质效应；(4)GP73单克隆抗体通过双功能化学试剂共价偶联在磁性纳米微球表面，偶联条件温和，最大限度保持了GP73单克隆抗体的免疫活性，大大提高了检测敏感性和方便性，易于实现大规模制备GP73单克隆抗体的磁性纳米免疫微球并应用于检测人血清或血浆中的GP73抗原。3、本发明采用针对GP73保守部位的单克隆抗体偶联磁性纳米微球，可明显提高检测的特异性和敏感性；采用针对GP73可溶性片段的多克隆抗体偶联酶作为检测抗体，可大大提高血浆中GP73的检出率，并充分扩大检测信号，使GP73的检测有很好的特异性和敏感性。附图说明图1是GP73的超保守部位结构示意图；图2是GP73胞外区结构示意图；图3是利用本发明提供的免疫微球及GP73多克隆抗体检测样品中的GP73抗原的ROC曲线图；图4是制备超顺磁纳米免疫微球及利用该免疫微球及GP73多克隆抗体检测样品中的GP73抗原的方法的流程示意图。图5是本发明提供的超顺磁性纳米免疫微球的稳定性检测结果示意图；图6是GP73单克隆抗体腹水肝癌细胞染色免疫荧光图。具体实施方式为了更易理解本发明提供的技术方案，下文将本发明的较佳的实施例，并配合图式做详细说明如下：如图1所示，GP73超保守部位(PCSite)下游12个氨基酸：EGRVRRAAAERG，该表位在不同种属生物进化过程中仍然保守。人：LQTRIMELEGRVRRAAAERG(参见序列6)黑猩猩：LQTRIMELEGRVRRAAAERG(参见序列7)小家鼠：LQTRIVELEGRVRRAAAERG(参见序列8)褐家鼠：LQTRIVELEGRVRRAAAERG(参见序列9)原鸡：LQSRIMELEGK...