一种EHV-1血清抗体检测试剂盒及制备方法和应用与流程

技术特征：

1.一种EHV-1血清抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，具体采用如下方法步骤获得：

(1)制备NC膜：NC膜分别包被纯化的EHV-1gD包涵体蛋白和猪免疫球蛋白IgG，其中EHV-1gD包涵体蛋白和猪免疫球蛋白IgG两种蛋白都采用滴加蛋白质溶液于NC膜自然晾干方法进行包被，纯化的EHV-1gD包涵体蛋白做为检测抗原，猪免疫球蛋白IgG为质检蛋白，其中，采用以EHV-1新疆株本地株基因组为模板设计合成特异性引物：

UP：5'-GGTGGATCCATGAAATGCAACCCGAAG-3'

Down:5'-GGCCTCGAGTTACACAAACGTAGAGTTGCTCTT-3'

在上游引物引入BamH I、下游引物引入Xho I酶切位点，并在下游引物引入TAA终止密码子，通过PCR反应扩增去除N端信号肽及C端跨膜区的gD部分基因，将gD部分基因克隆至pET28a原核表达载体上构建pET28a-gD重组质粒，转化至BL21(DE3)感受态细胞内，利用含有50ug/mL卡纳青霉素的固体LB培养基筛选阳性克隆株，LB液体培养基中培养阳性克隆株至OD600＝0.6时，加入0.9mmol/L IPTG在25℃条件下进行诱导表达6h后收集细菌，菌体超声破碎后离心收集包涵体沉淀，利用PBST洗涤3-5次既可获得gD包涵体蛋白；

(2)组装试剂盒：按盒底-吸水材料-NC膜-盒盖的顺序组装起来，先将吸水材料放置在试剂盒底部，再将NC膜放置在吸水材料上方，最后将盒盖封闭盒体，试剂盒采用由长方体作为试剂盒的外壳，预制的NC膜和滤纸构成试剂盒内芯，试剂盒包括，盒盖、NC膜、吸水材料和盒底，盒盖中央设有直径为0.5cm的加样孔，盒底设有一层吸水材料，NC膜位于吸水材料垂直上方，其中，NC膜分别包被纯化的EHV-1gD包涵体蛋白和猪免疫球蛋白IgG，试剂盒的盒体呈长3.0cm、宽3.0cm、高0.5cm的长方体结构。

2.如权利要求1所述的一种EHV-1血清抗体检测试剂盒在EHV-1血清抗体检测中的应用，其特征在于，具体应用方法如下：

(1)使用试剂盒前，将试剂盒装置水平放置，往试剂盒的NC膜先滴加含有终浓度为2％BSA和0.05％Tween20的PBS封闭液2滴，滴加量为100ul，进行封闭；

(2)等待NC膜上封闭液全部渗入NC膜后，加入1滴被检马血清，滴加量为50ul；

(3)待马血清完全渗入NC膜后，加入金标蛋白A稀释液，滴加量为100ul；

(4)待稀释液完全渗入NC膜后，加入2滴PBST进行洗涤，滴加量为100ul，重复3次；

(5)结果观察：质控点及被检点全部出现橙红色斑点为阳性；质控点出现橙红色斑点，被检点未出现橙红色斑点，结果为阴性；质控点及被检测点都未出现橙红色斑点渗滤试剂盒装置失效，即可准确快捷有效检测出EHV-1阳性血清。