本发明涉及分析化学领域，更具体的说是涉及一种甲苯磺酸索拉有关物质的检测方法。
背景技术：
：甲苯磺酸索拉非尼，英文名为SorafenibTosylate，适应症为适用于治疗不能手术的晚期肾细胞癌；治疗无法手术或远处转移的原发肝细胞癌。根据我们前期研发经验，甲苯磺酸索拉非尼目前已知的主要有关物质为杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G和杂质H，来自于合成原料、中间体以及降解产物，结构式如下：鉴于当前对甲苯磺酸索拉非尼产品的严格要求，在合成甲苯磺酸索拉非尼后需要进行有关物质含量的检测，以期达到标准要求。另参考相关文献，采用pH2.4磷酸盐缓冲盐-乙腈-乙醇梯度洗脱，但对甲苯磺酸峰与杂质A峰之间、主峰与其峰前相邻杂质F峰之间分离度较差，影响杂质的检查。现有的检测方法，由于存在色谱条件和方法欠佳，使得其在系统适用性、重复性、线性范围、定量限、检测限等方面较差。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种甲苯磺酸索拉非尼有关物质的检测方法，使其在系统适用性、专属性、重复性、线性范围、定量限、检测限等方面完全符合标准并具有较高的精密度。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种甲苯磺酸索拉非尼有关物质的检测方法，包括：取甲苯磺酸索拉非尼待测品配制供试品溶液，将供试品溶液稀释1000倍作为对照溶液，然后以磷酸二氢钾溶液为流动相A、以乙醇-乙腈(6:4)混合溶液为流动相B分别进行HPLC检测，，按照加校正因子的主成分自身对照法计算公式：有关物质的含量＝F×(A供/A对)×0.1％，计算获得有关物质的含量；针对现有检测方法色谱条件不够优化，致使影响甲苯磺酸索拉非尼有关物质杂质A和杂质F的检测，本发明调整色谱条件，以不加校正因子的主成分自身对照法为基础，提供了一种在系统适用性、重复性、线性范围、定量限、检测限等方面完全符合标准的新检测方法。作为优选，本发明所述检测方法包括：取甲苯磺酸索拉非尼待测品配制供试品溶液，将供试品溶液稀释1000倍作为对照品溶液，然后以磷酸二氢钾溶液溶液为流动相A、以乙醇-乙腈(6:4)混合溶液为流动相B分别进行HPLC检测，按照加校正因子的主成分自身对照法计算公式：有关物质的含量＝F×(A供/A对)×1％，计算获得有关物质的含量；其中，F为有关物质的相对校正因子，A供为供试品溶液有关物质的峰面积，A对为对照溶液主峰峰面积，所述相对校正因子为主成分线性回归方程的斜率和有关物质的线性回归方程的斜率的比值。所述相对校正因子是相对值，理论上不会变，但因实验误差的存在，会有微小变化，对最终的结果无影响。优选地，所述杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E和杂质F的相对校正因子分别为1.05、0.88、0.80、0.67、0.69和0.71。作为优选，梯度洗脱程序如下表：时间(min)流动相A(％)流动相B(％)06535105050265050276535456535作为优选，所述磷酸二氢钾溶液中磷酸二氢钾的物质的量为0.02mol/L；作为优选，所述乙腈乙醇混合溶液中乙腈乙醇的体积百分比为60:40；作为优选，所述HPLC检测的WatersSymmetryC18色谱柱的规格为100×4.6mm，5μm，它采用较小的粒径和长度是甲苯磺酸索拉非尼片现有技术中所采用的色谱柱2倍的色谱柱，使甲苯磺酸索拉非尼与其有关物质及各有关物质之间的分离度更高。作为优选，所述配制供试品溶液为采用混合溶液(洗脱相A:洗脱相B＝1:3)配制成浓度为0.2mg/mL的供试品溶液。更优选地，所述配制供试品溶液为：取甲苯磺酸索拉非尼约27.4mg，置100ml量瓶中，加混合溶液适量，超声是其溶解，放冷，用混合溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；作为优选，所述HPLC检测的检测波长为250nm；作为优选，所述HPLC检测的流速为1.0mL/min；作为优选，所述HPLC检测的进样量为20μl；作为优选，所述HPLC检测的柱温为35℃；作为优选，本发明所述检测方法还包括在HPLC检测之前进行系统适用性检测步骤：按照正式检测的色谱条件，分别进样空白溶液、系统适用性溶液，记录色谱图，通过调整色谱柱和色谱仪使空白溶液色谱图中无干扰峰，系统适用性溶液色谱图中索拉非尼与对甲苯磺酸、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、与杂质F之间的分离度不得小于1.5；所述空白溶液为洗脱相A:洗脱相B体积比为1:3的混合溶液，所述系统适用性溶液由以下方法配制而成：另取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F对照品各约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，加溶剂适量，超声使溶解，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备溶液；再取甲苯磺酸索拉非尼对照品适量(约相当于索拉非尼20mg)，精密称定，置100ml量瓶中，加溶剂适量，超声使溶解，放冷，再精密加入上述对照品贮备溶液1ml，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性试验溶液。在系统适用性的试验中，和索拉非尼最接近的有关物质F，其和索拉非尼的分离度为1.8左右，大于标准要求的1.5，和对甲苯磺酸最接近的有关物质A，其和对甲苯磺酸的分离度为1.9左右，大于标准要求的1.5，表明本发明所述检测方法可以完好的分离出各有关物质峰和索拉非尼主成分峰，各峰之间无干扰，利于检测。在专属性的试验中，在经酸、碱、氧化、高温、光照降解后的样品图谱中，主峰的纯度因子均大于阈值，符合标准要求。在定量限的试验中，相当于样品浓度0.02％的有关物质样品信噪比在10以上，保证样品中0.02％以上的有关物质可以定量检测；在检测限的试验中，相当于样品浓度0.007％的杂质样品信噪比在3以上，保证样品中0.007％以上的有关物质可以被检测到，证明本发明的灵敏度很高。在线性范围的试验中，本发明所述检测方法针对各有关物质的线性范围均符合至少在LOQ值～指标150％的范围内的标准，且回归系数均在0.9998-1.000之间，证明呈良好的线性关系。在重复性试验中，6次测定的杂质峰数一致，杂质之和的绝对偏差为1.26％，不超过质量标准限度的50％，证实本发明所述检测方法具有良好的精密度。在回收率试验中，本发明所述检测方法针对各有关物质的平均回收率结果均在98％-105％之间，符合验证方案要求，证明该方法具有良好的精密度。在中间精密度试验中，本发明所述检测方法针对不同分析人员不同分析仪器的三组6次测得的各有关物质个数一致，各杂质含量的RSD均不大于2％，杂质之和的RSD为1.38％，符合验证方案要求，证明该方法具有良好的中间精密度。在耐用性试验中，当流动相A的pH值、流动相B比例或柱温来评估当测定条件有微小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。证明该方法具有良好的耐用性。由以上技术方案可知，本发明采用乙腈-乙醇-磷酸二氢钾溶液梯度洗脱体系，使得索拉非尼的色谱峰可以和其他有关物质峰分离度更高，且峰型对称性较高，利于有关物质的检出，具有较高系统适应性，同时在专属性、定量限、检测限、线性范围以及重复性上都表现出无可比拟的优势，具有较高的精密度。附图说明图1、甲苯磺酸索拉非尼有关物质检查空白溶液液相色谱图；图2、甲苯磺酸索拉非尼有关物质检查系统适用性溶液液相色谱图；图3、无降解处理甲苯磺酸索拉非尼供试品溶液液相色谱图；图4、0.5MHCl降解处理甲苯磺酸索拉供试品溶液液相色谱图；图5、0.5MNaOH降解处理甲苯磺酸索拉非尼供试品溶液液相色谱图；图6、氧化降解处理甲苯磺酸索拉非尼供试品溶液液相色谱图；图7、强光降解处理甲苯磺酸索拉非尼供试品溶液液相色谱图；图8、高温降解处理甲苯磺酸索拉非尼供试品溶液液相色谱图。具体实施方式本发明公开了一种甲苯磺酸索拉非尼有关物质的检测方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述检测方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。依照本发明所述检测方法，其主要针对已知的杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E和杂质F的检测，但对于未知的杂质，本发明所述检测方法也可先假设未知杂质与索拉非尼的响应值一致，即相对校正因子为1.0，然后进行验证试验，由验证结果反推假设为真，从而检测出未知杂质的含量。本发明所述检测方法在实施方式中采用的色谱仪为岛津高效液相色谱仪，色谱柱为WatersSymmetryC18(4.6×100mm，3.5μm)。下面结合实施例，进一步阐述本发明。实施例1：本发明所述检测方法的色谱条件及色谱系统仪器：岛津高效液相色谱仪色谱柱：WatersSymmetryC18(4.6×100mm，3.5μm)流动相A：pH3.0磷酸盐缓冲液(取2.72g磷酸二氢钾，加水溶解并稀释至1000ml，以磷酸调节pH值至3.0)；流动相B：乙腈:乙醇＝60:40；检测波长：250nm；流速：1.0ml/min；进样量：20μl；柱温：35℃表1：洗脱程序时间(分钟)流动相A(％)流动相B(％)06535105050265050276535456535供试品溶液制备：取甲苯磺酸索拉非尼约27.4mg，置100ml量瓶中，加混合溶液适量，超声是其溶解，放冷，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；对照溶液制备：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml，置10ml量瓶中，用稀释溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。按照上述色谱条件分别对供试品溶液和对照溶液进行HPLC检测，然后以加校正因子的主成分自身对照法计算公式：有关物质的含量＝F×(A供/A对)×0.1％，计算获得有关物质的含量；其中，F为有关物质的相对校正因子，A供为供试品溶液有关物质的峰面积，A对为对照溶液主峰峰面积，所述相对校正因子为主成份线性回归方程的斜率和有关物质的线性回归方程的斜率的比值。各有关物质的相对保留时间以及相对校正因子见表2表2:各有关物质的相对保留时间以及相对校正因子化合物相对保留时间相对校正因子控制限度杂质A0.121.05≤0.1％杂质B0.320.88≤0.1％杂质C0.570.80≤0.1％杂质D0.830.67≤0.1％杂质E0.910.69≤0.1％杂质F0.970.71≤0.1％实施例2：本发明所述检测方法系统适用性检测稀释液：流动相A-流动相B(1:3)(V/V)；空白溶液：稀释液杂质贮备溶液：取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E和杂质F各约20mg，精密称定，置100ml量瓶中，加稀释液适量，超声使溶解，放冷，用稀释液稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备溶液；系统适用性试验溶液：另取甲苯磺酸索拉非尼对照品约27.5mg,精密称定，置100ml量瓶中，加稀释液适量，超声使溶解，再精密加入上述贮备液1ml，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性试验溶液。按照实施例1色谱条件分别进样空白溶液、分离度溶液，记录色谱图，见说明书附图1和2，相应结果见表3。表3:系统适用性结果化合物名保留时间(min)拖尾因子分离度理论板数对甲苯磺酸1.4941.716--975.127杂质A1.9621.3321.926709.058杂质B5.2561.11510.7214324.884未知杂质5.7911.1071.7646537.141杂质C9.4391.01113.54722438.586杂质D13.7461.06117.73955405.555杂质E15.1630.9865.89260236.461杂质F16.2000.9964.30976297.460索拉非尼16.6591.0561.92676123.594未知杂质27.5651.12027.15538524.188根据说明书附图1、2和表3的结果可知，索拉非尼与其峰前相邻杂质F峰的最小分离度为1.9左右，符合系统适用性要求，且峰形较好，而空白溶液中也无干扰峰，相比现有方法出现的主峰与其峰前相邻杂质F峰之间及对甲苯磺酸峰与杂质A之间的分离度较差，本发明所述检测方法更有利于杂质的检出，精密度自然得到很大提高。实施例3：本发明所述检测方法专属性检测强降解试验是在模拟强酸、强碱、氧化、高温和光照的强降解条件，对甲苯磺酸索拉非尼进行破坏，目的是通过考察样品的降解产物和主峰以及已知杂质的分离情况，对比杂质的生成量与主成份的减少量，以此来评估分析方法的有效性和适用性。同时采用DAD检测器，进行峰纯度检查：降解试验所得的图谱中，当主成份的纯度因子大于阈值时，则可判断该色谱峰不包含其他杂质峰，色谱峰纯度符合要求，具体试验结果见表4，对应的色谱图说明书附图3-8。表4：专属性试验结果根据表4的结果可以明显看出，在强降解试验下，本发明所述检测方法依然可以完好地分离出各峰形，保证不出现重合峰的情况，且主峰的纯度因子均大于阈值，符合标准要求。实施例4：本发明所述检测方法定量限和检测限的检测对于有关物质，检测限(LOD)和定量限(LOQ)根据信噪比法来确定的。把实施例2已知浓度的杂质储备液稀释到低浓度的样品，测出的信号与基线噪声进行比较，算出能被可靠检出的最低浓度或百分比，结果见表5。表5：定量限和检测限结果注：相当于样品浓度的百分比为有关物质的检测限浓度或定量限浓度比上供试品溶液的浓度在定量限的数据中，相当于样品浓度0.02％的有关物质样品信噪比在10以上，保证样品中0.02％以上的有关物质可以定量检测；在检测限的数据中，相当于样品浓度0.007％的杂质样品信噪比在3以上，保证样品中0.007％以上的有关物质可以被检测到，证明本发明的灵敏度很高。实施例5：本发明所述检测方法的线性及范围检测对于甲苯磺酸索拉非尼各杂质，在相当于供试品溶液浓度0.02％至0.15％的范围内取6个浓度点进行研究。线性关系以测得的峰面积对被分析物浓度的函数作图，用最小二乘法进行线性回归，要求该线性回归系数r的数值应不小于0.990，结果见表6～12。相当于样品浓度的百分比为有关物质的各线性比例溶液的浓度比上供试品溶液的浓度。表6：杂质A线性测定结果表7：杂质B线性测定结果表8：杂质C线性测定结果表9：杂质D线性测定结果表10：杂质E线性测定结果表11：杂质F线性测定结果表12：甲苯磺酸索拉非尼线性测定结果由上述各表的结果可知，发明所述检测方法针对各杂质的线性范围均符合至少在LOQ值～指标150％的范围内的标准，且回归系数均在0.9995以上，证明呈良好的线性关系。实施例6：本发明所述检测方法的各杂质相对校正因子的检测(标准曲线法)取“实施例5：本发明所述检测方法的线性及范围检测”项下6种线性试验溶液，分别在岛津及安捷伦高效液相色谱仪上进行试验，各取线性试验溶液20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以溶液中甲苯磺酸索拉非尼或各杂质浓度为横坐标、索拉非尼或各杂质峰面积为纵坐标作回归方程，计算校正因子。计算公式：校正因子F＝K索拉非尼÷K杂质式中：K索拉非尼：甲苯磺酸索拉回归方程中的斜率；K杂质：甲苯磺酸索拉非尼各杂质回归方程中的斜率。岛津高效液相色谱仪中记录的结果见表11，安捷伦高效液相色谱仪中记录的结果见表13～19表13：杂质A线性测定结果表14：杂质B线性测定结果表15：杂质C线性测定结果表16：杂质D线性测定结果表17：杂质E线性测定结果表18：杂质F线性测定结果表19：甲苯磺酸索拉非尼线性测定结果按照所述检测方法的线性及范围检测方法，采用不同时间不同仪器不同分析人员两次测得的试验结果，计算出各杂质的相对校正因子，结果见表20。表20各杂质相对校正因子测定表仪器岛津高效液相色谱仪安捷伦高效液相色谱仪平均杂质A校正因子1.061.031.04杂质B校正因子0.890.880.88杂质C校正因子0.810.800.80杂质D校正因子0.670.670.67杂质E校正因子0.690.690.69杂质F校正因子0.720.700.71实施例7：本发明所述检测方法的重复性的检测取甲苯磺酸索拉非尼样品，按照本发明实施例1检测方法重复6次检测，来验证方法具有良好的精密度，结果见表21。表21：重复性测试结果由表21可知，6次检测，均只检测出杂质A和杂质B，并且杂质之和的相对标准偏差为1.26％，证实该方法具有良好的精密度。实施例8：本发明所述检测方法的中间精密度试验的检测取同一批号甲苯磺酸索拉非尼样品，分别由不同的人，不同仪器，按照本发明实施例1检测方法测定杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F的含量，试验结果表22。表22中间精密度测试结果由表22可知，由不同分析人员、不同仪器在不同时间的6次测定结果，均只检测出杂质A和杂质B，并且杂质之和的相对标准偏差为1.29％，证实该方法具有良好的中间精密度。实施例9：本发明所述检测方法的回收率试验的检测采用加样回收法测定，测定加样样品中杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F的实际测得量和理论量之间的比值(回收率)，以百分率％表达，要求回收率在90.0％～108.0之间，以证实方法具有良好的准确度。结果见表23～28。表23杂质A回收率试验结果表24杂质B回收率试验结果表25杂质C回收率试验结果表26杂质D回收率试验结果表27杂质E回收率试验结果表28杂质F准确度试验结果由表23-28可知，杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E和杂质F的回收率均在93.9％～107.2％之间，平均回收率分别为102.7％、101.0％、103.7％、104.4％、103.4％、98.8％，符合验证方案要求(90％～108％)。证实了该方法具有良好的准确度。实施例9：本发明所述检测方法的溶液稳定性试验的检测取一甲苯磺酸索拉非尼样品，按照本发明实施例1检测方法分别测定放置0h、2h、4h、6h、8h、10h的供试品溶液，考察各杂质及总杂质峰面积的变化情况并计算相对标准偏差。结果见表29。表29供试品溶液稳定性试验结果放置时间(h)杂质A峰面积杂质B峰面积主峰峰面积0387812261239845223830122112457119440511313124105536421512031242247484233116312445159104180116712454636平均4064.5121612431399RSD4.32％4.49％0.20％由表29可知，单杂的个数及含量均未增加，杂质总量也未增加，甲苯磺酸索拉非尼供试品溶液在10小时内稳定。实施例10：本发明所述检测方法的耐用性试验的检测通过改变流动相A的pH值、流动相B比例、柱温来评估当测定条件有微小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。耐用性测试结果见表30～31。表30色谱条件变动的参数色谱参数规定值变动范围流动相pH值2.52.3和2.7流动相B比例乙腈:乙醇(60:40)58:42和62:38柱温35℃30℃表31不同pH值的流动相对有关物质测定的影响表32不同柱温对有关物质测定的影响表33不同流动相比例对有关物质测定的影响由表30-33可知，在本方法中色谱条件发生较小变化时，单杂的个数及含量均未有明显变化，杂质总量也未有明显变化，各杂质与相邻杂质峰之间的分离度仍符合规定，表明本方法耐用性良好。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3