测定MPO卤化酶活性的方法与流程

文档序号:12357771阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种测定MPO卤化酶活性的方法,其特征在于:测定的MPO卤化酶从HL-60细胞中分离的步骤是:

a、从HL-60细胞中分离出MPO:培养HL-60细胞, 离心收集细胞,用磷酸盐缓冲液溶解细胞,再进一步用Dounce homogenization 破裂细胞,离心,收集细胞沉积物,细胞沉积物中含MPO;

b、1% CTAB-磷酸盐缓冲液溶解上述细胞沉积物中MPO;

c、制备Q-Sepharose 层析柱: 用0.5% CTAB-磷酸盐缓冲液平衡Q-Sepharose 层析柱,上述MPO溶解液通过Q-Sepharose 层析柱,结合蛋白到Q-Sepharose 层析柱上,收集滤过液,滤过液含有pI=9.2的MPO;

d、制备SP-Sepharose 层析柱:用0.2% CTAB-磷酸盐溶液平衡SP-Sepharose 层析柱,上述含有MPO滤过液通过SP-Sepharose 层析柱,pI≥8.0蛋白结合到SP-Sepharose 层析柱上,用600mM K2PO4-磷酸盐缓冲液洗脱SP-Sepharose 层析柱结合蛋白,收集含有MPO的洗脱液;

e、放上述洗脱液至蛋白透析袋中,用150mM NaCl-磷酸盐缓冲液透析;

f、制备ConA-Sepharose4B 层析柱:用100mM NaCl-磷酸盐溶液洗涤ConA-Sepharose4B,再与透析后蛋白液混合,ConA-Sepharose4B结合糖化MPO,用500mM NaCl-磷酸盐缓冲液洗涤ConA-Sepharose4B 层析柱,用600mM a-D-methylmannoside -磷酸盐缓冲液洗脱ConA-Sepharose4B 层析柱结合糖化蛋白,收集含有MPO的洗脱液;

g、放上述洗脱液至蛋白透析袋中,用150mM NaCl-磷酸盐缓冲液透析, 收集蛋白液,分装,放-80°C 冻存。

2.根据权利要求1所述测定MPO卤化酶活性的方法,其特征在于:冻存的蛋白液采用银染法测定MPO纯度,

a、冻存蛋白液离心管放到37° 水浴中,快速溶化,放到冰块中;

b、10ul蛋白液,加4ul 4X蛋白加样液,100° ,3分钟,其中样液是50 mM Tris,pH 6.8,2% SDS,10% Glycerol,1% β-mercaptoethanol, 12.5mM EDTA,0.02% Bromophenol blue;

c、加10ul蛋白液样本液10% SDS-PAGE 凝胶孔中,进行电泳;

d、完成电泳后,获取SDS-PAGE 凝胶,进行银染色,步骤如下:

①加100ml 50% Methanol 到SDS-PAGE凝胶的容器中,室温下,缓慢摇动,15分钟,去除Methanol液体;

②加100ml 5% Methanol 到SDS-PAGE凝胶容器中,室温下,缓慢摇动,10分钟,去除Methanol液体,用水洗涤SDS-PAGE凝胶1次;

③加10ul DTT 到SDS-PAGE胶容器中,有200ml水,室温下,缓慢摇动,10分钟,去除DTT液体,用水洗涤SDS-PAGE凝胶1次;

④加100ml 0.1% AgNO3 到SDS-PAGE凝胶容器中,室温下,缓慢摇动,15分钟,去除AgNO3液体,用水洗涤SDS-PAGE凝胶2次;

⑤加100ml 3% Na2CO3 & 0.05% Formaldehyde 到SDS-PAGE凝胶容器中,室温下反应,看到清晰蛋白条带为止;

⑥加Critic Acid到SDS-PAGE凝胶容器中;终止反应;

⑦用水清洗SDS-PAGE胶后,干躁SDS-PAGE凝胶,判断MPO纯度。

3.根据权利要求1所述测定MPO卤化酶活性的方法,其特征在于:Bradford法测定纯化MPO浓度;

①取1ml浓缩染料试剂与4ml H2O 混合均匀,获得稀释染料试剂;

②制备BSA标准液, 浓度分别为 0, 0.25,0.5,1.0,1.5,2.0mg/ml;

③加78ul PBS 到微量滴定板孔中,加2ul不同浓度BSA标准液,2ul纯化MPO液,每个样本加3个孔;

④加80ul稀释染料试剂到微量滴定板孔中,室温,放置5分钟;

⑤放微量滴定板到生化分析仪中,选用波长495nm, 测定OD值;

⑥制备BSA浓度标准曲线,计算出纯化MPO浓度。

4.根据权利要求1所述测定MPO卤化酶活性的方法,其特征在于:测定纯化MPO卤化酶活性单位:

①加50ul工作液入微孔滴定板孔中;

②加50ul纯化MPO至相应微孔滴定板孔中;

③再加20ul H2O2溶液至每孔中,混均,反应5min;

④加入 20ul过氧化氢酶至每孔中,混均,反应5min;

⑤加入30ul底物液至每孔中, 混均;

⑥放微孔滴定板到生化分析仪中,选用650nm 波长, 测定0min OD值;

⑦持续反应5min后,用650nm 波长, 测定5min OD值;

⑧计算∆OD值=OD5min–OD0min

5.根据权利要求1所述测定MPO卤化酶活性的方法,其特征在于:测定血清/浆标本中MPO卤化酶活性单位:

①加50ul工作液入微孔滴定板孔中;

②加50ul血清及MPO校准品至相应微孔滴定板孔中;

③再加20ul H2O2溶液至每孔中,混均,反应5min;

④加入 20ul Catalase至每孔中,混均,反应5min;

⑤加入30ul底物液至每孔中, 混均;

⑥放微孔滴定板到生化分析仪中,选用650nm 波长, 测定0min OD值;

⑦持续反应5min后,用650nm 波长, 测定5min OD值;

⑧计算∆OD值=OD5min–OD0min

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