一种基于SPR技术的甲基苯丙胺（冰毒）检测方法与流程

本发明属于毒品检测领域，涉及一种基于spr技术的甲基苯丙胺(冰毒)检测方法。

背景技术：

冰毒即“甲基苯丙胺”,它是将苯丙胺经过甲基化处理得到的。冰毒是一种无味、透明的结晶体,它的外观性状与冰板极为相似,故被称为“冰”(ice)。对人体中枢神经系统具有极强的刺激作用,且毒性强烈。冰毒的精神依赖性很强,吸食后会产生强烈的生理兴奋,大量消耗人的体力和降低免疫功能,严重损害心脏和大脑组织。其表现为精神抑郁、心慌失眠、焦虑不安、严重时引起营养不良、体重减轻、人体免疫力降低、内脏器官得病率提高。用量稍大即会引起精神失常,使人因强烈的痉挛而死亡。

尽管已有化学法、色谱法、光谱法、免疫法、毛细管电泳法和离子迁移谱法等方法应用到毒品检测中，但化学法灵敏度低，色谱法、毛细管电泳法和离子迁移谱法前处理过程时间较长，需要专门技术人员和大规模昂贵仪器，光谱法灵敏度低以及对待测样品纯度要求较高，免疫法操作时间过长。目前应用于吸毒检测中最广泛的为胶体金试纸，但其以吸毒人员尿液为检测对象，且其灵敏度只有300-1000ng/ml。而本技术以其高灵敏度，可实现对吸毒人员的唾液中毒品进行检测，从而避免了对客体隐私的侵犯，并大大提高了工作效率。

表面等离子体共振(surfaceplasmonresonance,spr)技术是基于物理光学现象的一种分析技术。当偏振光以共振角入射照在金属和电介质的界面上时，发生全反射，入射光的一部分能量与表面等离子体波发生耦合，引起表面等离子体共振，产生光强急剧减少的反射光。利用光学spr技术测定时，一般是将一种功能反应物(如配体)固定在传感芯片表面金属膜上，当加入待测样品(受体)并使其与传感芯片上的功能反应物相互作用时，引起体系的折射率变化，从而引起spr光学信号的改变。由于spr技术的高识别性、高灵敏性、快速、原位(无需标记)、便捷、实时等优点，spr传感技术现已被广泛应用于生命科学研究、药物筛选、食品分析、环境监测、农业生产等领域。

目前，国内外未见将冰毒检测与spr技术结合在一起的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对目前胶体金试纸较低的检测灵敏度，提供一种基于spr的实时、快速、高灵敏度的冰毒检测技术，所述方法检测灵敏度高，大大降低吸毒人员检测的漏检率，具有重要的应用价值。

本发明基于spr技术的冰毒检测的方法，是将spr芯片经edc/nhs活化后的羧基基团偶联bsa上的氨基后作为传感芯片，当待测样品通过传感芯片表面时，利用表面等离子体共振检测仪检测待检测唾液与分子识别敏感芯片界面处全反射光的光强变化来直接测定唾液中的冰毒含量，具体包括如下步骤：

步骤(1)：将spr芯片放置到spr仪器中作为传感芯片，仪器温度设定为20～30℃；其中，spr为表面等离子共振的简称。

所述的spr芯片是先在玻璃基底上表面镀一层2～3nm厚的铬层，再在铬层上表面镀一层40～50nm厚的金膜；金膜表面生成巯基烷醇后用环氧氯丙烷处理生成环氧基，环氧基共价结合葡聚糖后用溴乙酸处理使葡聚糖羧基化，从而得到羧基化的葡聚糖表面；该spr芯片经edc/nhs活化后的羧基基团可以偶联bsa上的氨基；

步骤(2)：以10～30μl/min的流速往spr芯片表面通入200～300μledc/nhs混合液，活化该芯片表面的羧基基团；

所述的edc/nhs混合液为edc与nhs的等体积混合溶液；其中edc为n-(3-二甲基氨丙基)-n’-乙基碳二亚胺，浓度为0.2～0.4m；nhs为n-羟基琥珀酰亚胺，浓度为0.1～0.2m；

步骤(3)：在步骤(2)活化表面羧基后的spr芯片上以10～30μl/min的流速通入0.5～2mg/mlbsa-methamphetamine溶液，使其偶联到活化过的羧基上，要求目标响应值(ru)达到2000～3000；

所述的bsa-methamphetamine为人工合成的冰毒完全抗原，即在bsa(牛血清白蛋白)表面偶联了methamphetamine(冰毒)分子，可购买获得；ph值为4.5～5.5；

步骤(4)：在步骤(3)bsa-methamphetamine偶联后的spr芯片上以10～30μl/min的流速通入75～100μl乙醇胺盐酸盐溶液，用以封闭未反应的活化过的羧基位点；

所述的乙醇胺盐酸盐溶液的浓度为1～2m；

步骤(5)：在步骤(4)处理后spr芯片上以10～30μl/min的流速通入30～50μl梯度浓度的冰毒抗体，确定合适的抗体浓度；

所述的冰毒抗体为对bsa-methamphetamine具有特异性识别的鼠源单克隆抗体。

步骤(6)：将一系列不同浓度的30～50μl的冰毒标准品分别与步骤(5)确定的浓度抗体混合后，以10～30μl/min的流速依次通入spr芯片，建立标准曲线；其中冰毒抗原与步骤(5)确定的浓度抗体等体积；

步骤(7)：将30～50μl的待检测样品与步骤(5)确定的浓度抗体等体积混合后，以10～30μl/min的流速通入spr芯片，记录响应信号，代入标准曲线，求得唾液中冰毒含量。

进一步地，步骤(5)中每个冰毒抗体反应完成后以10～30μl/min的流速通入naoh溶液，使抗原抗体解离，完成芯片再生后再加入下一个浓度的抗体；所述的氢氧化钠溶液为50～100mm。

进一步地，在进入步骤(6)前，可进行多次注射步骤(5)确定的最合适浓度抗体,验证实验的重复性。

进一步地，步骤(7)中的待测样品可以是唾液，血液，尿液。

本发明的有益效果：

(1)本发明所述方法操作简便，实时、快速，只需将抗原抗体混合通入芯片，便可实时观测结果。

(2)本发明所述的芯片制备方案成熟，已经商业化，购买方便，并可重复使用上百次，是一种非常经济的检测方法。

(3)本发明方法所达到的灵敏度较高，时间较短，是其他任何技术都没法比拟的。

(4)由于胶体金试纸的灵敏度只有300-1000ng/ml,当待检样品含量低于其灵敏度时，胶体金试纸将无法检测，而本发明正好解决了这问题。

附图说明

图1为不同浓度抗体与spr响应信号间的关系：抗体浓度依次为6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml。

图2为spr芯片的再生示意图，注射氢氧化钠后spr信号骤降，并逐渐恢复至初始基线状态。

图3为分别注射5次恒定浓度抗体的spr响应图。

图4中a为冰毒检测的标准曲线，b为标准曲线的线性区域。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来详述本发明，但不限于此。

以下实施例中提到的主要试剂信息见表1；主要仪器与设备信息见表2。

表1

表2

以下实施例所采用的spr芯片为ge公司生产的cm5芯片，该芯片的表面为羧甲基化葡聚糖，易偶联bsa上的氨基；所使用的spr仪器为ge公司生产的biacore3000；胶体金试纸购自艾博生物医药(杭州)有限公司。实施例1：

(1)打开spr仪器，解锁spr芯片插槽，将spr芯片放置到插槽中，锁上芯片插槽；spr仪器温度设定为25℃；

(2)以20μl/min的流速往在spr芯片表面通入注射250μl的edc和nhs等体积比混合液，活化该芯片表面的羧基基团；其中edc浓度为0.4m,nhs浓度为0.1m；

(3)在活化表面羧基后的spr芯片上以20μl/min的流速通入1mg/ml的ph5.0的bsa-methamphetamine溶液，使其偶联到活化过的羧基上，要求目标响应值(ru)达到3000；

(4)在偶联bsa-methamphetamine的spr芯片上以20μl/min的流速通入100μl的1m的乙醇胺盐酸盐溶液，用以封闭未反应的活化过的羧基位点；

(5)以20μl/min的流速通入40μl的6.25μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml梯度浓度的冰毒抗体，结果如图1所示，结果表明6.25μg/ml和12.5μg/ml的抗体浓度下的ru值过小，标曲梯度较窄，降低灵敏度；50μg/ml和100μg/ml的抗体浓度下的ru值较高，但是会耗费掉过多的抗体，不利于成本控制，综合比较下，25μg/ml的抗体浓度最为合适，确定后续测试中的抗体浓度为25μg/ml，；

(6)每个样品反应完成后以20μl/min的流速通入10μl50mm的naoh溶液，使抗原抗体解离，完成芯片再生后再加入下一个浓度的抗体，如图2所示，起始基线为1980ru，再生后基线回到1978ru，cv(变异系数)仅为0.07％，表明芯片再生效果较好；

(7)以20μl/min的流速通入25μg/ml的抗体40μl共5次，验证实验的重复性，结果如图3所示；5次重复的ru分别为1039.5ru，1065.0ru，1062.3ru，1047.1ru，1006.2ru，cv仅为2.26％，表明实验的重复性较好；

(8)将一系列不同浓度的40μl的冰毒标准品(125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.63ng/ml、7.81ng/ml、3.91ng/ml、1.95ng/ml、0.98ng/ml、0.49ng/ml、0.24ng/ml、0.12ng/ml、0.06ng/ml、0ng/ml)与25μg/ml抗体等体积依混合后以20μl/min的流速依次通入40μl到spr芯片获取spr响应信号，建立标准曲线，结果如图4(a)和图4(b)所示，在0.06～7.81ng/ml范围内，冰毒的浓度与spr响应信号成线性关系，最低检测浓度在0.06-0.12ng/ml范围，当冰毒浓度超过7.81ng/ml或低于0.06ng/ml时，冰毒的浓度与spr信号不再成线性关系。

(9)待检测人(甲)的基本情况：性别男，年龄31，其尿液经胶体金试纸检测结果为冰毒阳性。

将甲的唾液12000pm离心10min后，取40μl的样品与等体积的抗体混合后，以20μl/min的流速依次通入30μl到spr芯片，记录响应信号，代入标准曲线，求得唾液中冰毒含量为超出标曲，大于7.18ng/ml。

验证下本实施例检测结果的真实性：以气相色谱-质谱联用技术(gc/ms)和固相萃取技术(spe)相结合测得甲唾液中冰毒含量为1042.12ng/ml，与本发明测得的结果一致。

实施例2

(1)打开spr仪器，解锁spr芯片插槽，将spr芯片放置到插槽中，锁上芯片插槽；spr仪器温度设定为25℃；

(2)以约10μl/min的流速往spr芯片表面通入100μl0.2medc和100μl0.1mnhs的混合液，活化该芯片表面的羧基基团；

(3)在步骤(2)活化表面羧基后的spr芯片上以10μl/min的流速通入0.5mg/mlbsa-methamphetamine溶液(ph值为4.5)，使其偶联到活化过的羧基上，要求目标响应值(ru)达到约2000；

(4)在步骤(3)bsa-methamphetamine偶联后的spr芯片上以10μl/min的流速通入75μl2m乙醇胺盐酸盐溶液，用以封闭未反应的活化过的羧基位点；

(5)以10μl/min的流速通入30μl的6.25μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml梯度浓度的冰毒抗体，结果如图1所示，结果表明6.25μg/ml和12.5μg/ml的抗体浓度下的ru值过小，标曲梯度较窄，降低灵敏度；50μg/ml和100μg/ml的抗体浓度下的ru值较高，但是会耗费掉过多的抗体，不利于成本控制，综合比较下，25μg/ml的抗体浓度最为合适，确定后续测试中的抗体浓度为25μg/ml，；

(6)每个样品反应完成后以10μl/min的流速通入10μl50mm的naoh溶液，使抗原抗体解离，完成芯片再生后再加入下一个浓度的抗体，如图2所示，起始基线为1980ru，再生后基线回到1978ru，cv(变异系数)仅为0.07％，表明芯片再生效果较好；

(7)以10μl/min的流速通入25μg/ml的抗体30μl共5次，验证实验的重复性，结果如图3所示；5次重复的ru分别为1039.5ru，1065.0ru，1062.3ru，1047.1ru，1006.2ru，cv仅为2.26％，表明实验的重复性较好；

(8)将一系列不同浓度的30μl的冰毒标准品(125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.63ng/ml、7.81ng/ml、3.91ng/ml、1.95ng/ml、0.98ng/ml、0.49ng/ml、0.24ng/ml、0.12ng/ml、0.06ng/ml、0ng/ml)与25μg/ml抗体等体积依混合后以20μl/min的流速依次通入30μl到spr芯片获取spr响应信号，建立标准曲线，结果如图4(a)和图4(b)所示，在0.06～7.81ng/ml范围内，冰毒的浓度与spr响应信号成线性关系，最低检测浓度在0.06-0.12ng/ml范围，当冰毒浓度超过7.81ng/ml或低于0.06ng/ml时，冰毒的浓度与spr信号不再成线性关系。

(9)待检测人(乙)的基本情况：性别男，年龄43，其尿液经胶体金试纸检测结果为冰毒阴性。

将乙的唾液12000pm离心10min后，取30μl的样品与步骤(5)确定的浓度抗体等体积混合后，以10μl/min的流速通入30μl到spr芯片，记录响应信号，代入标准曲线，求得唾液中冰毒含量超出标曲，大于7.81ng/ml。

验证下本实施例检测结果的真实性：以气相色谱-质谱联用技术(gc/ms)和固相萃取技术(spe)相结合测得乙唾液中冰毒含量为142.47ng/ml，与本发明测得的结果一致。

实施例3

(1)打开spr仪器，解锁spr芯片插槽，将spr芯片放置到插槽中，锁上芯片插槽；spr仪器温度设定为30℃；

(2)以约30μl/min的流速往spr芯片表面通入150μl0.2medc和150μl0.2mnhs的混合液，活化该芯片表面的羧基基团；

(3)在步骤(2)活化表面羧基后的spr芯片上以30μl/min的流速通入2mg/mlbsa-methamphetamine溶液(ph值为5.5)，使其偶联到活化过的羧基上，要求目标响应值(ru)达到约3000；

(4)在步骤(3)bsa-methamphetamine偶联后的spr芯片上以30μl/min的流速通入100μl2m乙醇胺盐酸盐溶液，用以封闭未反应的活化过的羧基位点；

(5)以30μl/min的流速通入50μl的6.25μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml梯度浓度的冰毒抗体，结果如图1所示，结果表明6.25μg/ml和12.5μg/ml的抗体浓度下的ru值过小，标曲梯度较窄，降低灵敏度；50μg/ml和100μg/ml的抗体浓度下的ru值较高，但是会耗费掉过多的抗体，不利于成本控制，综合比较下，25μg/ml的抗体浓度最为合适，确定后续测试中的抗体浓度为25μg/ml，；

(6)每个样品反应完成后以30μl/min的流速通入10μl50mm的naoh溶液，使抗原抗体解离，完成芯片再生后再加入下一个浓度的抗体，如图2所示，起始基线为1980ru，再生后基线回到1978ru，cv(变异系数)仅为0.07％，表明芯片再生效果较好；

(7)以30μl/min的流速通入25μg/ml的抗体50μl共5次，验证实验的重复性，结果如图3所示；5次重复的ru分别为1039.5ru，1065.0ru，1062.3ru，1047.1ru，1006.2ru，cv仅为2.26％，表明实验的重复性较好；

(8)将一系列不同浓度的50μl的冰毒标准品(125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.63ng/ml、7.81ng/ml、3.91ng/ml、1.95ng/ml、0.98ng/ml、0.49ng/ml、0.24ng/ml、0.12ng/ml、0.06ng/ml、0ng/ml)与25μg/ml抗体等体积依混合后以20μl/min的流速依次通入40μl到spr芯片获取spr响应信号，建立标准曲线，结果如图4(a)和图4(b)所示，在0.06～7.81ng/ml范围内，冰毒的浓度与spr响应信号成线性关系，最低检测浓度在0.06-0.12ng/ml范围，当冰毒浓度超过7.81ng/ml或低于0.06ng/ml时，冰毒的浓度与spr信号不再成线性关系。

(9)待检测人(丙)的基本情况：性别男，年龄22，其尿液经胶体金试纸检测结果为冰毒阴性。

将乙的唾液12000pm离心10min后，取50μl的样品与步骤(5)确定的浓度抗体等体积混合后，以30μl/min的流速通入50μl到spr芯片，记录响应信号，代入标准曲线，求得唾液中冰毒含量为6.11ng/ml。

验证下本实施例检测结果的真实性：以气相色谱-质谱联用技术(gc/ms)和固相萃取技术(spe)相结合测得丙唾液中冰毒含量为6.02ng/ml，与本发明测得的结果一致。

实施例4：

待检测人(丁)的基本情况：性别男，年龄21，其尿液经胶体金试纸检测结果为冰毒阳性。

取40μl丁的尿液样品与等体积的抗体混合后，以20μl/min的流速依次通入30μl到spr芯片，记录响应信号，代入标准曲线，求得尿液中冰毒含量为超出标曲，大于7.18ng/ml。

验证下本实施例检测结果的真实性：以气相色谱-质谱联用技术(gc/ms)和固相萃取技术(spe)相结合测得丁尿液中冰毒含量为3219.65ng/ml，与本发明测得的结果一致。

实施例5

待检测人(戊)的基本情况：性别男，年龄37，其尿液经胶体金试纸检测结果为冰毒阳性。

取30μl戊的血液样品与等体积的抗体混合后，以10μl/min的流速通入30μl到spr芯片，记录响应信号，代入标准曲线，求得血液中冰毒含量超出标曲，大于7.81ng/ml。

验证下本实施例检测结果的真实性：以气相色谱-质谱联用技术(gc/ms)和固相萃取技术(spe)相结合测得戊血液中冰毒含量为2613.72ng/ml，与本发明测得的结果一致。

上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。