一种藠头中游离氨基酸的测定方法与流程

本发明涉及藠头有机物测定的
技术领域：
，尤其涉及一种藠头中游离氨基酸的测定方法。
背景技术：
：藠头为百合科葱属植物，又名薤白，主要分布于我国南方各省。传统医学认为藠头中有温中通阳，理气宽胸，还阳散结之功效,藠头的鳞茎既可入药又可食用。藠头中含有大量的氨基酸和人体所必需的多种元素，而且藠头具有多种药理作用，可以抑制血栓形成和动脉粥样硬化，并且具有抗氧化作用、平喘作用、镇痛作用、和耐缺氧作用，特别是对于糖尿病、肿瘤细胞转移等疾病都有很好的效果。大多数人只知道藠头做成食品食用有益于身体健康，却不知道藠头中是什么成分在起营养作用，鉴于氨基酸的营养价值性以及提升藠头的附加价值，藠头的研究势在必行。对于藠头中营养物质的检测及分析曾有一些文献报道，中国专利CN103320449A公开了一种具有抗肿瘤活性藠头凝集素基因及其编码蛋白的应用，根据其核苷酸序列对应的氨基酸序列，其编码的藠头凝集素蛋白具有抗肿瘤活性，但其对氨基酸测定方法等方面未做研究，目前也没有公开关于藠头中游离氨基酸含量的测定分析方法，因此如今对氨基酸组成的进一步研究以及资源的开发与利用还缺乏理论依据。技术实现要素：鉴于上述现有技术的不足，本发明旨在提供一种准确、灵敏、快速、重复性和稳定性好的一种藠头中游离氨基酸的测定方法，从而为氨基酸组成的进一步研究以及资源的开发与利用提供理论依据。本发明的技术方案如下：一种藠头中游离氨基酸的测定方法，包括以下步骤：1）、溶液的配制配制茚三酮溶液、谷氨酸标准溶液和醋酸-醋酸钠缓冲液，备用，2）、样品处理称取1g藠头粉，放入50mL的烧杯内，同时加入蒸馏水溶解，待溶解完全后将其全部移入50mL的容量瓶内，加入蒸馏水定容并摇匀，备用，3）、测量波长取标准溶液、蒸馏水于25mL的具塞试管中，加入1mL~3mL的茚三酮溶液和PH为5~8的醋酸钠-醋酸缓冲溶液，水浴加热15~25分钟，取出放入冷水浴中立即冷却至室温，用蒸馏水定容至25mL，进行波长扫描。所述的藠头中游离氨基酸的测定方法，其中，所述茚三酮溶液浓度为0.02~0.05mg/mL、谷氨酸标准溶液浓度为0.1~0.3mg/mL、醋酸-醋酸钠缓冲液的PH为4~9。所述的藠头中游离氨基酸的测定方法，其中，所述加入1mL~3mL的茚三酮溶液浓度为1%~3%。所述的藠头中游离氨基酸的测定方法，其中，所述水浴加热的温度设定为100~120℃。所述的藠头中游离氨基酸的测定方法，其中，所述冷却时间为8~15分钟。所述的藠头中游离氨基酸的测定方法，其中，所述波长扫描的范围为380-780nm。发明人发现，一般采用茚三酮比色法测定藠头中总氨基酸的含量，由于溶液的PH值、显色剂的用量、加热时间和冷却时间的不一样，最终得到的结果存在较大差异，导致测定不准确、不灵敏且重复性和稳定性都不好，继而发明人针对如何使此显色方法准确、灵敏、快速、重复性和稳定性好这一问题进行了研究，经过大量实验研究，发明进一步确定了茚三酮的最适显色条件、溶液的最适PH值、显色剂的最适用量、溶液的最适加热时间、溶液的最适冷却时间并且绘制谷氨酸溶液的标准曲线，最终得到了最合适测定条件为：溶液的PH值pH=5.0，取2%茚三酮显色剂2.0mL，沸水浴准确加热20min，冷水冷却12min后于570nm处测定其吸光度。实验证明此显色方法准确、灵敏、快速、重复性和稳定性好。有益效果：本发明所提供的一种藠头中游离氨基酸的测定方法，通过简单高效的分析方法以及确定最佳的反应条件，使实验分析准确、灵敏、快速、重复性和稳定性好，从而为氨基酸组成的进一步研究以及资源的开发与利用提供理论依据。附图说明图1是溶液的PH值与吸光度的关系图。图2是茚三酮用量与吸光度的关系图。图3是溶液加热时间与吸光度的关系图。图4是溶液冷却时间与吸光度的关系图。图5是谷氨酸溶液与吸光度的标准曲线图。具体实施方式本发明提供了一种藠头中游离氨基酸的测定方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。确定茚三酮的最合适显色条件茚三酮是一个有机化合物，氨基酸与茚三酮水合物在弱酸的条件下共同加热时，氨基酸被氧化而脱氨、脱羧，且茚三酮水合物被还原，其还原物与氨基酸加热分解产生的氨结合，再与另一分子茚三酮缩合成为蓝紫色化合物，称为罗曼紫（Ruhemann'spurple）。反应式如下：确定溶液的最合适PH值：参加图1，每次精确移取5.0mL0.1mg/mL谷氨酸的标准溶液于6支相同的具塞试管中，再依次分别加入2.OmLpH为4，5,6,7,8，9的醋酸-醋酸钠缓冲溶液和2.0mL的茚三酮试剂，沸水浴加热20min后，用冷却蒸馏水定容至50mL，在570nm处测定不同PH值条件下的吸光度。分析图1可得，在缓冲溶液的PH值不断增加的情况下，谷氨酸溶液的吸光度出现先上升后下降最终趋于平稳的趋势。在pH为5处谷氨酸溶液达到最大吸光度，此时谷氨酸溶液呈蓝色。由此可得谷氨酸与茚三酮的显色反应适合在弱酸的条件下进行，这也与文献报道相吻合。此时的产品才呈现出鲜味。低于这个pH值，产品偏重于酸味;高于这个pH值，产品会呈现一定的咸味和甜味。确定显色剂的最合适用量：参见图2，每次精确移取5.0mL0.1mg/mL的谷氨酸标准溶液于5支相同的具塞试管中，后加入2.0mLPH为5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液，再依次分别加1.6,1.8,2.0,2.2,2.4mL茚三酮试剂，沸水浴加热20min后，用冷却蒸馏水定容至50mL，在570nm处测定不同显色剂用量的吸光度。分析图2可得，在茚三酮显色试剂的用量不断增加的情况下，谷氨酸溶液的吸光度出现先上升后逐渐趋于平稳的趋势。当显色剂用量为2.0mL时，谷氨酸溶液的吸光度达到最大值，此后再继续增加茚三酮试剂的用量，谷氨酸溶液的吸光度的变化不明显，由此可确定2.0mL为显色剂最合适的用量。确定溶液的最合适加热时间：参加图3，每次精确移取5.0mL0.1mg/mL的谷氨酸标准溶液于5支相同的具塞试管中，再加人2.OmLpH为5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液和2.0mL茚三酮试剂，放置于沸水浴中分别加热16,18,20,22,24min后，用冷却蒸馏水定容至50mL，在570nm处测定不同加热时间显色体系的吸光度。分析图3可得，在水浴时间不断增加的条件下，谷氨酸溶液的吸光度出现先上升后下降的趋势。当水浴时间为20min时，谷氨酸溶液的吸光度达到最大值。在水浴20min之前，谷氨酸溶液的颜色显紫色，且色泽比较暗淡；22min以后，谷氨酸溶液颜色渐渐加深，出现略透明紫色;水浴20min时，溶液显亮紫色。当水浴时间超过20min后溶液的透明度出现下降的趋势;在水浴时间超过22min后肉眼可见具塞试管内有微小的絮状物沉淀，其产生的原因可能是由于水浴时间的增加使谷氨酸溶液的颜色渐渐加深，后用冷却蒸馏水后具塞事管中的溶液因为温度的降低而产生细微的沉淀颗粒。因此此次试验选用20min为最合适的水浴时间。确定最合适的冷却时间：参见图4，每次精确移取5.0mL0.1mg/mL的谷氨酸标准溶液于5支相同的具塞试管中，再加入2.OmLpH为5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液和2.0mL茚三酮试剂，放置于冷水中分别冷却6,8,10,12,14min后在570nm处测定不同冷却时间显色体系的吸光度。分析图4可得，在冷却时间不断增加的情况下，谷氨酸溶液的吸光度出现上升的趋势，当冷却时间为12min时溶液的吸光度值达到最大值。因此此次实验选用12min为最合适的冷却时间。绘制谷氨酸溶液的标准曲线如图5所示，分别精密吸取0.1mL/mg谷氨酸标准溶液0.00、0.10、0.30、0.50、0.70、0.90、1.10mL于7支具塞试管中，分别加入2.0mLPH为5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液和2.0mL茚三酮试剂，沸水浴准确加热20min后，冷却12min，用冷却蒸馏水定容至25mL后在570nm处测其吸光度，然后以谷氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制其标准曲线，得到回归方程，回归线方程为：Y=8.385x-0.01,相关系数为R2=0.99989（R2为吸光度）。精密度检测精确移取0.1mg/mL谷氨酸标准溶液稀释成低、中、高浓度的溶液(分别为0.01,0.05,0.1mg/mL），重复测定其吸光度5次，结果如下表：谷氨酸浓度(mg/ml)吸光度值(平均)RSD%0.010.0660.450.050.400.400.10.820.49稳定性检测把上述反应完全的3种浓度的样品溶液在570nm处分别测其吸光度，每隔3min测一次，且连续测定4次到12min。吸光度结果如下表：Glu浓度（mg/mL)0min3min6min9min12min均值RSD%0.010.0660.0660.0650.0640.0630.0641.50.050.400.400.400.390.380.391.80.10.820.820.810.800.780.801.6从上表可以看出，三种浓度的样品溶液的吸光度在6min内平均下降0.2%，非常稳定，但在12min内溶液的吸光度平均下降了3%，因此测定时应在6min内完成。样品测定平行准确称取藠头粉1.001g四份，按照2.3.2对样品进行处理制备待测溶液，上述溶液按照绘制标准曲线的操作进行显色反应，且在570nm处测定显色待测溶液的吸光度，吸光度结果见下表：编号1234均值RSD%总氨基酸mg/mL2.52.52.62.52.51.5从上表可以看出，藠头粉中总氨基酸含量的平均值为2.5mg，RSD=1.5%，表明此方法的重现性优良。以下通过具体的实施例对本发明做进一步说明。实施例1本实施例提供一种藠头中游离氨基酸的测定方法，包括以下步骤：1）、溶液的配制准确称取茚三酮1.0g放入25mL的烧杯内，加入适量的蒸馏水直至完全溶解，然后转移到50mL容量瓶中，加入蒸馏水，待液面离刻度线1-2cm时改用胶头滴管滴加，定容，摇匀，低温保存备用（注意：由于茚三酮溶液性质不稳定，遇光容易分解，故需要现配现用）；精确称取谷氨酸标准品0.02g置于50mL烧杯内，加入蒸馏水溶解，然后将其全部转移到200mL的容量瓶中，加入蒸馏水至刻度并且摇匀，备用；取41mL醋酸和59mL醋酸钠混合制得PH为5的醋酸-醋酸钠缓冲液，备用。2）、样品处理称取1g藠头粉，放入50mL的烧杯内，同时加入蒸馏水溶解，待溶解完全后将其全部移入50mL的容量瓶内，加入蒸馏水定容并摇匀，备用。3）、测量波长的确定分别各取标准溶液、蒸馏水2mL于三个25mL的具塞试管中，分别各加入2mL的1%的茚三酮溶液和PH为5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液，水浴加热的温度设定为100℃，加热20分钟后，取出放入冷水浴中立即冷却12分钟，用蒸馏水定容至25mL，在570nm范围内进行波长扫描。本实施例为最优方案，通过简单高效的分析方法从而确定最佳的反应条件，使实验分析准确、灵敏、快速、重复性和稳定性好。实施例2本实施例的实验方法与实施例1相同，达到的效果也基本相同，不同的是，在测量波长中，包括以下步骤：分别各取标准溶液、蒸馏水2mL于三个25mL的具塞试管中，分别各加入1mL的2%的茚三酮溶液和PH为7的醋酸钠-醋酸缓冲溶液，水浴加热的温度设定为110℃，加热15分钟后，取出放入冷水浴中立即冷却10分钟，用蒸馏水定容至25mL，在570nm范围内进行波长扫描。实施例3本实施例的实验方法与实施例1相同，达到的效果也基本相同，不同的是，在测量波长中，包括以下步骤：分别各取标准溶液、蒸馏水2mL于三个25mL的具塞试管中，分别各加入2mL的3%的茚三酮溶液和PH为6的醋酸钠-醋酸缓冲溶液，水浴加热的温度设定为105℃，加热18分钟后，取出放入冷水浴中立即冷却15分钟，用蒸馏水定容至25mL，在570nm范围内进行波长扫描。应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。当前第1页1 2 3