基于石墨烯量子点与铕离子复合体系的四环素类抗生素检测方法与流程

本发明属于化学检测领域，具体涉及一种基于石墨烯量子点与铕离子复合体系的四环素类抗生素检测方法。

背景技术：

四环素类抗生素是由放线菌产生的一类广谱抗生素，包括金霉素、土霉素、四环素及半合成衍生物甲烯土霉素、强力霉素、二甲胺基四环素等，其结构均含并四苯基本骨架。作为一种广谱抗生素，四环素类抗生素的滥用造成的污染已经引起了人们的关注。

目前常见的四环素类抗生素的分析检测方法有液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法、比色法以及荧光分析法等。然而这些方法普遍存在一些缺点，例如色谱法和电泳法操作复杂、所需分析时间较长，比色法灵敏度不够等。荧光分析法操作简单且灵敏度较高，因此开发四环素类抗生素的荧光分析方法具有重要的意义。现有的针对抗生素的荧光分析方法大概分为两类，一类是利用四环素抗生素对荧光纳米材料（例如荧光碳点）的猝灭而建立（x.yang,y.luo,s.zhu,y.feng,y.zhuo,y.dou,one-potsynthesisofhighfluorescentcarbonnanoparticlesandtheirapplicationsasprobesfordetectionoftetracyclines,biosen.bioelectron.56(2014)6–11.），另一类方法是利用铕离子与四环素可以形成发光配合物而建立（l.d.s.teixeira,a.n.grasso,a.m.monteiro,a.m.f.neto,n.d.vieirajr.,m.gidlund,l.c.courrol,enhancementontheeuropiumemissionbandofeuropiumchlortetracyclinecomplexinthepresenceofldl,anal.biochem.400(2010)19–24.）。第一类荧光分析方法信号输出方式为荧光减弱型，第二类荧光分析方法因为铕离子与四环素形成的发光配合物荧光强度较弱，需要寻找并在体系中加入能够增强铕发光配合物荧光的物质。

本发明在以上问题上进行了研究。

技术实现要素：

针对以上现有技术中的不足，本发明提供了一种基于石墨烯量子点与铕离子复合体系的四环素类抗生素检测方法，本发明通过下述技术方案得以解决。

基于石墨烯量子点与铕离子复合体系的四环素类抗生素检测方法，其特征在于，包括以下步骤：a.制备石墨烯量子点溶液；b.制备铕离子溶液；c.制备不同浓度的盐酸四环素溶液；d.将石墨烯量子点溶液和铕离子溶液混合得到复合体系溶液；e.将不同浓度的盐酸四环素溶液依次与复合体系溶液混合，通过荧光分析法绘制盐酸四环素浓度的标准曲线；f.将未知浓度的盐酸四环素溶液与复合体系溶液混合，通过荧光测试得到荧光强度值，通过与标准曲线的比对得到浓度数据。

作为优选，所述步骤a中，制备石墨烯量子点溶液包括以下步骤：a1.取固体柠檬酸放入烧杯中，将该烧杯放在加热套中200℃加热，直柠檬酸变成液态，颜色由无色变为淡黄色；a2.将熔化的柠檬酸与氢氧化钠溶液混合，得到石墨烯量子点溶液。

作为优选，所述步骤a2中，柠檬酸与氢氧化钠溶液混合操作如下：将烧杯连同熔化的柠檬酸置于盛有10mg/ml氢氧化钠溶液的容器中，并将烧杯倾斜，使容器中的氢氧化钠溶液缓慢进入到烧杯中，得到石墨烯量子点溶液。

作为优选，所述步骤b中，制备铕离子溶液包括以下步骤：取六水合氯化铕，加入到蒸馏水中，得到氯化铕溶液。

作为优选，所述步骤e、f中，荧光分析测试中使用的缓冲溶液为tris-hcl缓冲溶液，该tris-hcl缓冲溶液的浓度为9~11mm，ph为8~10。

作为优选，所述步骤e、f中，荧光分析测试中使用的石墨烯量子点溶液的浓度为10~11μg/ml，所述铕离子溶液的浓度为19~21μm。

与现有技术相比，本发明提供了一种利用石墨烯量子点与铕离子复合体系进行四环素类抗生素的检测方法，其中石墨烯量子点有两个作用：一方面其荧光可以被四环素类抗生素猝灭，另一方面，本发明制备的石墨烯量子点表面富含羧基，可以与铕离子发生配位，进而可以增强铕离子与四环素形成的发光配合物的强度；因此，本发明的信号输出方式为比率荧光型，并具有操作简便、耗时短、灵敏度高以及干扰小等优点。

附图说明

图1表示本发明实施例1中步骤1制备的石墨烯量子点的电镜图。

图2表示本发明实施例1中步骤4中获得的加入不同浓度盐酸四环素的条件下石墨烯量子点与铕离子复合体系的荧光光谱。

图3表示本发明实施例1中步骤4中绘制的荧光强度比值f616/f460与盐酸四环素浓度的标准曲线。

图4表示本发明实施例1中加入浓度为20μm的盐酸四环素的测试曲线。

图5表示本发明实施例2中加入浓度为1mm的盐酸四环素的测试曲线。

图6表示本发明实施例3中步骤4中绘制的荧光强度比值f616/f460与强力霉素浓度的标准曲线。

图7表示本发明实施例3中加入浓度为250μm的盐酸四环素的测试曲线。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1：配置浓度为20μm的盐酸四环素溶液作为待测液，步骤如下：

（1）将2.1g柠檬酸放到25ml的烧杯中，然后把烧杯放到数显200°c的加热套中进行加热。约5分钟后柠檬酸变成液态,其颜色由无色变为淡黄色。然后用镊子将小烧杯置于盛有100ml10mg/ml氢氧化钠的大烧杯中，并将小烧杯倾斜，使得氢氧化钠溶液慢慢进入小烧杯中，得到溶液态的石墨烯量子点水溶液，其电镜图如图1所示，石墨烯量子点分布均匀。

（2）取步骤（1）中得到的石墨烯量子点溶液5ml，加入5ml蒸馏水，得到质量浓度为10.5mg/ml的石墨烯量子点溶液。

（3）称取0.0258g六水合氯化铕，加入10ml蒸馏水，得到浓度为10mm的氯化铕溶液。

（4）向比色皿中加入浓度为10.5mg/ml的石墨烯量子点溶液2μl，浓度为10mm的氯化铕溶液4μl，浓度为100mm的ph为9.0的缓冲溶液200μl，盐酸四环素溶液以及蒸馏水，使得总测试体系为2ml（四环素在该测试体系中的浓度为0，0.1，0.2，0.5，1，2，3，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24μm），混匀后等待一分钟，使分散均匀。以360nm为激发波长，记录体系在400~650nm处的荧光光谱，如图2所示。以四环素浓度为横坐标，616nm与460nm处荧光强度比值f616/f460为纵坐标，绘制盐酸四环素检测的标准曲线，如图3所示。

（5）向比色皿中加入浓度为10.5mg/ml的石墨烯量子点溶液2μl，浓度为10mm的氯化铕溶液4μl，浓度为100mm的ph为9.0的缓冲溶液200μl，待测的盐酸四环素溶液20μl以及蒸馏水，使得总测试体系为2ml，混匀，等待一分钟。以360nm为激发波长，记录体系在400~650nm处的荧光光谱，如图4所示。读取616nm与460nm处荧光强度，计算f616/f460的比值。将比值代入标准曲线，求出测试体系中四环素的浓度为196.16nm,进而求出待测液中四环素的浓度为19.16μm，误差为4.2%.

实施例2：配置浓度为1mm的盐酸四环素溶液作为待测液，步骤如下：

（1）盐酸四环素检测的标准曲线同实施例1。

（2）向比色皿中加入浓度为10.5mg/ml的石墨烯量子点溶液2μl，浓度为10mm的氯化铕溶液4μl，浓度为100mm的ph为9.0的缓冲溶液200μl，待测的盐酸四环素溶液20μl以及蒸馏水，使得总测试体系为2ml，混匀，等待一分钟。以360nm为激发波长，记录体系在400~650nm处的荧光光谱，如图5所示。读取616nm与460nm处荧光强度，计算f616/f460的比值。将比值代入标准曲线，求出测试体系中四环素的浓度为9.794μm,进而求出待测液中四环素的浓度为979.4μm，误差为2.06%.

实施例3：配置浓度为250μm的强力霉素溶液作为待测液，步骤如下：

（1）将2.1g柠檬酸放到25ml的烧杯中，然后把烧杯放到数显200°c的加热套中进行加热。约5分钟后柠檬酸变成液态,其颜色由无色变为淡黄色。然后用镊子将小烧杯置于盛有100ml10mg/ml氢氧化钠的大烧杯中，并将小烧杯倾斜，使得氢氧化钠溶液慢慢进入小烧杯中，得到溶液态的石墨烯量子点水溶液。

（2）取步骤（1）中得到的量子点溶液5ml，加入5ml蒸馏水，得到质量浓度为10.5mg/ml的石墨烯量子点溶液。

（3）称取0.0258g六水合氯化铕，加入10ml蒸馏水，得到浓度为10mm的氯化铕溶液。

（4）向比色皿中加入浓度为10.5mg/ml的石墨烯量子点溶液2μl，浓度为10mm的氯化铕溶液4μl，浓度为100mm的ph为9.0的缓冲溶液200μl，强力霉素溶液以及蒸馏水，使得总测试体系为2ml（四环素在该测试体系中的浓度为0，0.1，0.2，0.5，1，2，3，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24μm），以360nm为激发波长，记录体系在400~650nm处的荧光光谱。以强力霉素浓度为横坐标，616nm与460nm处荧光强度比值f616/f460为纵坐标，绘制强力霉素检测的标准曲线，如图6所示。

（5）向比色皿中加入浓度为10.5mg/ml的石墨烯量子点溶液2μl，浓度为10mm的氯化铕溶液4μl，浓度为100mm的ph为9.0的缓冲溶液200μl，待测的强力霉素溶液20μl以及蒸馏水，使得总测试体系为2ml，混匀，等待一分钟。以360nm为激发波长，记录体系在400~650nm处的荧光光谱，如图7所示。读取616nm与460nm处荧光强度，计算f616/f460的比值。将比值代入标准曲线，求出测试体系中强力霉素的浓度为2.435μm,进而求出待测液中强力霉素的浓度为243.5μm，误差为2.6%。

以上所述为本发明中的四环素类抗生素的检测方法，该方法对盐酸四环素的检测只需通过简单混合即可实现，操作简单且速度快，同时该方法灵敏度高，线性检测范围为0～20μm，灵敏度为8.2nm。

本发明的检测方法中，荧光强度随盐酸四环素浓度的不同变化明显，616nm处荧光强度随盐酸四环素浓度升高而有明显升高，460nm处荧光强度随盐酸四环素浓度升高而降低，这与石墨烯量子点溶液的添加所起到的两个作用相符合。

此外，本发明中，所述荧光信号的方式为比率型，受光源及测试条件的影响较小，能有效减少测试误差；所使用的石墨烯量子点材料制备简单、用量少且易长时间保存，因此本方法成本低廉。本发明所述方法选择性好，加入四环素类抗生素到石墨烯量子点与铕离子的体系中均可产生明显的荧光信号变化，而加入几种其他类的常见的抗生素（例如链霉素、青霉素、阿奇霉素、阿莫西林、头孢）均无荧光信号变化。

本发明的保护范围包括但不限于以上实施方式，本发明的保护范围以权利要求书为准，任何对本技术做出的本领域的技术人员容易想到的替换、变形、改进均落入本发明的保护范围。