本发明涉及用于生物检测分析领领域，特别涉及一种蛋白微阵列检测用固相基质的制备方法。
背景技术：
蛋白微阵列检测芯片为一种特殊的带有光学组件的生物芯片类产品，在使用时，待检测的检材和基底基质通过特殊工艺结合，可以有效避免液相对于检测的影响。通过运用平行光导技术对结合在基底介质表面的待检测物质进行检测，能够达到较为理想的灵敏度和特异性。可应用的主要方向为生物体内微量物质的检测及新型生物标志物探索，如丰度很低的蛋白质及蛋白质修饰。还可以实现体内常规生物标志物的无创检测，以及基于重组抗原及抗原混合物(如包被细菌及病毒等物质)的检测(自抗体检测应用领域)。亦可实现基于双抗夹心法的芯片类检测分析。其应用领域主要在生命科学研究，各类临床体外诊断，个体化诊断，复杂疾病分型等领域。
此蛋白微阵列检测芯片主要基于平面波导技术，其技术原理包括当光从光密介质进入光疏介质表面时，按照折射定律，当入射角满足一定条件时，光全部反射回原介质，而没有投射分量进入光疏介质，这种现象被称为光的全反射现象。当全反射发生时，虽然透射光的强度为零，但在光疏介质中还存在一个光场，它是由光波场透入到光疏介质内形成的，其振幅随着透射深度的增加呈指数衰减，因此只有沿着光密和光疏介质表面的很薄的一层，这个波被定义为渐逝波。渐逝波的厚度约为100nm的数量级别，由于生物芯片上的样品厚度约为几十纳米，因此只有在介质表面的荧光染料才能被激发，而大于此厚度的液相中的杂质则对检测信号没有影响，因此可以大幅度提高检测系统的灵敏度，而不需要复杂的共聚焦光学设备，使用CCD即可实现在picoM-zeptoM(10-1210-21)量级进行检测。平面光导技术(Planar Wave Guide，PWG)，通过在固相基质(如芯片)中加入光栅结构，利用光学折射与反射原理在固相载体表面形成光导层，激发仅靠近固相表层的荧光物质，不受液相中的杂质干扰，因此可大大降低本底噪音，区分真实信号与背景噪音，提高灵敏度。
平面光导技术的实现需通过在固相基质内刻入特定光栅结构来实现。该过程需通过激光蚀刻工艺介入，其制造成本及高，不易进行大范围普及。目前在国内还没有相关机构可以进行生产和应用。
技术实现要素：
本发明针对现有技术中蚀刻特定光栅结构的固相基质的制作工艺复杂，制作成本高，不易进行大范围普及的缺点，提供了一种蛋白微阵列检测用固相基质的制备方法。
生物芯片应用最早起源于核酸物质检测，其中应用最为广泛的例如基因表达谱芯片与SNP芯片，这些基因芯片已经成为成熟化商业产品，并以最为著名的Affymetrix和Agilent公司产品为代表，广泛被运用到科研及转化研究中。与此同时蛋白检测领域的生物芯片开发相对迟缓，而主要的蛋白芯片应用是通过免疫反应原理将抗体固定在平面介质上，然后加入待测样本物质(主要为体液样本)进行检测，这类蛋白芯片称之为抗体芯片(正相芯片)，其原理类似于微缩化的酶联免疫反应中的双抗夹心法(ELISA)，而主要检测靶点为体液中存在的蛋白类物质或细胞表面抗原。另一种蛋白类芯片与之相反，它通过裂解细胞的方法将胞内抗原混合物包被在固相载体表面，然后通过抗原抗体免疫反应进行胞内靶点的检测。这类方法可产生高密度样本阵列，并对细胞内低丰度蛋白进行高通量并行检测，这类芯片称之为裂解液芯片，也叫反相蛋白芯片。除此之外，还存在一种与之相类似的芯片，即重组抗原芯片，其技术原理是通过将高密度纯化重组抗原制备在平面芯片表面，再加入待测抗原(如血液，体液或细胞裂解物)进行检测。
无论哪种形式的芯片检测其先决条件是必须达到一定的检测灵敏度，基于正相芯片的检测目前产业化应用主要集中在体外诊断领域，其检测物质的检测范围大多介于纳克/毫升。因此采用ELISA法，化学发光法及常规芯片法基本满足能够检测需求。血清学指标检测，尤其是在癌症初筛阶段，有着重要的意义，然而在蛋白芯片领域，基于目前的指标下，特异性及准确性并不理想，其很大的制约因素是被现有的蛋白检测手段所限制的。近几年来，随着对外泌体及循环肿瘤细胞(CTC)研究的日益深入，人们越来越关注那些在亚化学计量水平下表达的蛋白，而更多的此类蛋白与癌症的关系还未被更好地挖掘，尤其是在新型标志物的验证及临床技术应用上，传统手段显得余力不足。在另一方面，检测细胞内微量蛋白表达水平的变化，如细胞信号蛋白，转录因子，以及那些可逆反应的变化，如磷酸化，乙酰基化，甲基化对人们认识疾病的生物学本质，并找寻其分子水平上的关系有着极其深远的意义。而这类研究以及临床技术的开发应用都需要建立在足够的检测下限，即检测灵敏度上。蛋白检测本身不同于核酸检测，无法通过体外扩增实现，因此只能通过两种手段增加其信号可读出性。1.增加通过化学反应增强检测信号，此类方法最为常见的有通过生物素-亲和素体系进行信号放大，或者通过偶联HRP/AP等化学基团通过底物反应化学发技术进行信号放大，来达到检测目的，此类方式为传统的信号扩增方式，其技术路线已经成熟，应用广泛。2.另一种方法则通过降低本底噪音，尤其是在平面芯片类检测的应用中，即降低待检物周围的信号强度来实现待测物信号的读取，此类检测无需通过信号级联放大，通过荧光直接标记进行信号读取。该方法无需繁琐的化学扩增反应，通过直接在一抗或二抗上标记荧光基团，对信号进行捕获，不会产生由化学信号扩增所带来的结果偏倚或失真，同时减少操作步骤，加快实验进程。然而，此类以荧光或者免疫荧光检测为基础的技术存在的一个最大障碍便是本底信号。因此通过一种新型的降低本底信号的方法来实现微量表达蛋白的信号读取，并达到适于真实世界广泛应用的信噪比及灵敏度的要求来辅助诊断与各类检测将是十分有商业潜力的。
本申请所使用的技术方案并非传统的光刻技术，也非化学蚀刻等方法，而是直接采用机械印制的工艺，通过在一个具有相当的弹性的介质上压制出所需要的图形得到可以重复使用的压印模板，因此可以较大幅度降低固相基质的制作成本。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
一种蛋白微阵列检测用固相基质的制备方法，包括以下具体步骤：
选取硬质可透光的基底介质；将波导层材料沉降于所述基底介质表面形成波导模具层，所述波导材料具有和所述基底介质大致相同的反射系数；单独准备由柔性材料制备得到的可透光柔性印章，所述柔性印章的一侧表面制备有和所述基底介质上的光栅层相匹配的凹凸光栅结构；将柔性印章的带有凹凸观赏结构的一侧侧面朝向所述波导模具层按压于所述基底介质的表面并停留，在停留的同时对所述波导模具层进行固化；移除所述柔性印章并在所述基底介质的波导模具层一侧制备光疏介质层得到最终固相基质。
上述工艺的特点在于使用柔性的可透光印章，将该柔性印章压入涂覆在基底介质上的可光学交联材料中，在紫外光照射下固化后只需要将印章移开就可以得到成品。此方法精度高，工艺简单，操作简单，可以满足高效大批量加工需求，利于产业化。
进一步地，作为一种可选的方案，在本申请的实施例中，还包括以下具体步骤：将固相基质浸泡于浓度为50-150mg/500ml的镀膜液中，干燥后形成表面蛋白吸附层。
进一步地，作为一种可选的方案，在本申请的实施例中，所述镀膜液至少包括多聚烷基磷酸酯，多聚赖氨酸和氨基硅烷中的一种。
进一步地，作为一种可选的方案，在本申请的实施例中，所述浸泡的时间为2-4小时。
进一步地，作为一种可选的方案，在本申请的实施例中，所述光疏介质层为折射率大于基底介质的透明金属氧化物层。
进一步地，作为一种可选的方案，在本申请的实施例中，所述光疏介质层的折射率为2.1。
进一步地，作为一种可选的方案，在本申请的实施例中，所述光疏介质层的厚度为150-300纳米。
进一步地，作为一种可选的方案，在本申请的实施例中，所述柔性印章的制备步骤包括：在包含光栅结构的硬质母板上覆盖液态的柔性材料，固化后取出柔性材料形成柔性印章。
进一步地，作为一种可选的方案，在本申请的实施例中，所述柔性材料为聚二甲基硅氧烷。
进一步地，作为一种可选的方案，在本申请的实施例中，所述将柔性印章按压于所述基底介质的压力为1-100牛顿。
进一步地，作为一种可选的方案，在本申请的实施例中，柔性印章的停留时间为10-20秒。
一种蛋白微阵列检测用固相基质，使用上述的制备方法制备得到。
本发明具有以下的显著技术效果：
相比现有的蚀刻技术，制作成本低廉，无论是固相基质还是柔性印章均可以大量复制，且可以重复使用，大幅降低了其制作成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例1
一种蛋白微阵列检测用固相基质的制备方法，包括以下具体步骤：
选取硬质可透光的基底介质；将波导层材料沉降于所述基底介质表面形成波导模具层，所述波导材料具有和所述基底介质大致相同的反射系数；将另行单独准备完毕的由柔性材料制备得到的可透光柔性印章，所述柔性印章的一侧表面制备有和所述基底介质上的光栅层相匹配的凹凸光栅结构；将柔性印章的带有凹凸观赏结构的一侧侧面朝向所述波导模具层按压于所述基底介质的表面并停留，在停留的同时对所述波导模具层进行固化；移除所述柔性印章并在所述基底介质的波导模具层一侧制备光疏介质层得到最终固相基质。本申请记载的基底介质通常使用玻璃，要求具有均一的结构，其折射系数应当1.52，即633nm左右，采用Schott Desag D263或类似的基底玻璃。
进一步地，还包括以下具体步骤：将固相基质浸泡于镀膜液中，干燥后形成表面蛋白吸附层。
进一步地，所述镀膜液至少包括多聚烷基磷酸酯，多聚赖氨酸和氨基硅烷中的一种。通常使用单独的一种成分的镀膜液，或者根据需要选择两种或者两种以上的混合溶液。镀膜液的浓度在50-150mg/500ml之间，经过浸泡和干燥后，可以在固相基质的表面形成足够厚度的吸附层，同时又不会干扰影响激光折射后在蛋白和镀膜液上的照射。
进一步地，所述浸泡的时间为2-4小时。浸泡时间的多少决定了吸附在固相基质表面的镀膜层的致密性。但不应当过多的进行浸泡，防止过多的镀膜材料吸附在表面影响激光的照射。
光疏介质层是指在成形后的波导模具层的表面制备的透明金属氧化层。通常而言，所述光疏介质层为折射率大于基底介质的透明金属氧化物层。作为一种可选的方案，使用Ti2O5，其折射系数为2.1，约为633nm左右，通常选用EB蒸发化学沉析的方法进行制备。
进一步地，所述光疏介质层的厚度为150-300纳米，可以通过控制沉析的相应参数来实现。
柔性印章是指通过柔性材料制得的一薄层，具有较好的弹性，足够的韧性，良好的透光性，良好的介电性，且应当具有相当的化学惰性，由于其由柔性材料值得，可以轻易地加工成形，且可以在固化后较为容易地从硬质母板上取出，且不会影响其表面的凹凸光栅结构的完整性。所述柔性印章的制备步骤包括：在包含光栅结构的硬质母板上覆盖液态的柔性材料，固化后取出柔性材料形成柔性印章。进一步地，所述柔性材料为聚二甲基硅氧烷，可以通过涂覆等简单手段在硬质母板上形成薄层，固化后取出即可。固化可以使用现有的通用固化剂，或者其它固化手段。
在使用时，将柔性印章按压于覆盖有波导模具层上，所述将柔性印章按压于所述基底介质的压力为1-100牛顿。进一步地，柔性印章的停留时间为10-20秒。
所述波导模具层使用紫外固化材料，本申请中使用的是外购的ORMOCER材料，属于光固化树脂的一种，通过紫外光进行固化。其中，波导层材料应当尽可能选取和基底介质相同或者较为接近的折射率，在制备过程中，采用普通的化学沉降法将波导层材料均匀地制备到基底介质的表面。
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。