本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一种腺苷酸激活蛋白激酶ampk作为肿瘤转移及预后诊断的生物标志物的用途。
背景技术：
随着癌症发病率和死亡率的增加，癌症已经成为世界人口慢性病死亡的首要原因之一。肿瘤转移是癌症致死的主要原因之一。临床大数据表明，大量肿瘤患者在其原位肿瘤尺寸较小的阶段就已经发生了转移，但由于不易检测，从而延误了有效的治疗。目前市面上缺乏用于预测肿瘤转移及有效预后评估的分子诊断产品，因此开发肿瘤转移分子检测技术和产品有重大临床意义。
腺苷酸激活蛋白激酶(ampk)被amp激活，是胞内能量感受器；其在维持细胞能量代谢稳态过程中起着关键作用。大量研究表明，能量代谢紊乱是肿瘤的重要特征之一，而ampk的激活能够抑制肿瘤细胞生长及生存。但ampk基因表达在临床肿瘤中是否有显著变化及ampk是否在肿瘤细胞的恶化转移过程中起作用，目前尚不清楚。
技术实现要素：
本发明的目的在于解决以上现有技术中存在的技术问题的至少一项，提供一种腺苷酸激活蛋白激酶ampk作为肿瘤转移及预后诊断的生物标志物的用途，经发明人的研究表明经典的癌信号包括pi3k、ras及her2都可显著抑制ampk催化亚基ampkα1的蛋白表达，进而促进细胞侵袭和肿瘤转移，激活ampk在体内体外显著抑制这些癌信号诱导的细胞侵袭和肿瘤转移。表明能量代谢感受器ampk在肿瘤迁移过程中扮演着重要角色。因此，ampkα1的表达水平可作为肿瘤转移和预后的一个重要指标。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
腺苷酸激活蛋白激酶ampk作为肿瘤转移及预后诊断的生物标志物的用途。
本发明主要从肿瘤临床数据出发，在生化、分子、细胞及动物模型等层面上探索ampk的催化亚基ampkα1的表达与肿瘤转移的关系及分子机制，从而确定本发明的腺苷酸激活蛋白激酶ampk可以作为肿瘤转移及预后诊断的生物标志物进行应用。
腺苷酸激活蛋白激酶ampk的催化亚基ampkα1作为肿瘤转移及预后诊断的生物标志物的用途。
进一步的，所述肿瘤为乳腺癌。
ampkα1的表达水平作为肿瘤转移及预后诊断的生物标志物的用途。
经发明人的研究表明，ampkα1的表达在人恶性乳腺癌中明显下调，乳腺癌恶性程度越高，ampkα1表达就越低；此外，相对患乳腺癌5年后生存下来的乳腺癌患者，5年内去世的乳腺癌患者其肿瘤组织中ampkα1也显著降低。这些数据表明ampk与肿瘤的转移相关。
沉默腺苷酸激活蛋白激酶ampk的催化亚基ampkα1增加细胞的侵袭能力的用途。
发明人通过多种方法抑制ampk的活性都发现抑制ampk可显著的在体内体外增加细胞的侵袭及肿瘤转移能力。重要的是发明人发现经典的癌信号包括pi3k、ras及her2都可显著抑制ampk催化亚基ampkα1的蛋白表达，进而促进细胞侵袭和肿瘤转移，激活ampk在体内体外显著抑制这些癌信号诱导的细胞侵袭和肿瘤转移。
本发明相对于现有技术的有益效果是：
1.首次证明ampkα1的表达下调是恶性肿瘤转移的特征。
2.在分子机理上，阐明细胞粘附因子e-cadherin是受ampk严格调控，在肿瘤转移过程中起着重要作用。
3.首次证明了癌信号(包括pi3k,ras及her2)抑制ampkα1在恶性肿瘤中的蛋白表达；与临床数据十分吻合，ampkα1在恶性肿瘤中显著低表达是恶性肿瘤转移的关键因素，ampkα1的基因表达水平可作为肿瘤转移的诊断和预后的重要指标。
附图说明
图1aampkα1的mrna在正常乳腺组织(breast)、三阴性乳腺癌(tnbc)及her2+/pr-/er-(her2+)乳腺癌中的表达情况图。
图1bampkα1的mrna在不同恶性程度的her2+/pr-/er-乳腺癌中的表达情况图。
图1campkα1的mrna在不同恶性程度的三阴性(tnbc)乳腺癌中的表达情况图。
其中，图1a-1c表示ampkα1的mrna在不同恶性程度的乳腺癌中的表达情况。grade1、grade2及grade3代表乳腺癌的恶性程度。三阴性乳腺癌(tnbc)的恶性程度高于her2+/pr-/er-(her2+)乳腺癌。
图2a免疫组化分析ampkα1的蛋白表达水平在乳腺癌患者的癌组织和癌旁组织中的表达情况图(乳腺癌患者数为27)。
图2b免疫组化分析不同恶性程度的乳腺癌组织中ampkα1的蛋白表达情况图。
其中，图2a-图2b表示ampkα1的蛋白表达水平在乳腺癌中的表达情况。图2b中grade(ii,ii-iii)和grade(iii)代表乳腺癌的恶性程度；其中grade(ii,ii-iii)的乳腺癌患者数为20，grade(iii)的乳腺癌患者数为5。
图3ampkα1的mrna在患乳腺癌5年后生存下来的乳腺癌患者和5年之内死亡的乳腺癌患者的肿瘤组织中的表达情况图。
图4a各蛋白表达情况的免疫印迹检测图。
图4bmatrigel-transwell分析细胞的侵袭能力对比图。
图4c各蛋白的免疫印迹检测对比图。
图4dmatrigel-transwell检测细胞的侵袭能力对比图。
其中，图4a-图4d用来说明抑制ampk促进细胞的侵袭情况。mcf10a细胞稳定表达shgfp,shampkα1-1(shaα1-1)及shampkα1-2(shaα1-2)；mcf10a细胞稳定表达ampkα1显性失活突变d139a(flag-aα1-dn)；***表示p<0.001。
图5aoncomine数据库分析ampkα1和e-cadherin的mrna表达水平在乳腺癌中的表达情况图。
图5b在稳定表达shampkα1(shaα1)的mcf10a细胞中稳定表达e-cadherin,matrigel-transwell分析细胞的侵袭能力图。
图5c裸鼠肺转移实验分析e-cadherin在ampk失活在肿瘤转移过程中的作用图。
其中，图5a中ampkα1与e-cadherin在乳腺癌中呈正相关；***表示p<0.001,**表示p<0.01。
图6a过表达p110αh1047r、h-rasg12v及her2v659e显著的抑制ampk的活性及ampkα1的蛋白表达、mcf10a细胞稳定表达p110αh1047r、h-rasg12v及her2v659e的免疫印迹检测图。
图6b癌信号pi3k、ras及her2与ampkα1的基因表达在临床肿瘤中的相关性图。其中，图6b中p110α突变和未突变(tcga数据库)，her2扩增和未扩增(oncomine数据库)的乳腺癌及ras突变和未突变(tcga数据库)的肺癌中ampkα1的mrna表达情况。stagei/ii,stageiia,stageiv代表肿瘤的不同时期。
图7a在稳定表达p110αh1047r的mcf10a细胞中过表达野生型的ampkα1(flag-aα1-wt)或持续激活突变ampkα1(t172d)(flag-aα1-ca)采用matrigel-transwell分析细胞的侵袭能力图。
图7b裸鼠肺转移实验分析ampk在p110αh1047r诱导的细胞转
移过程中的作用图。其中，图7a-图7b中***表示p<0.001,**
表示p<0.01,*p表示<0.05。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明的技术方案进行详细的说明，应当说明的是，以下仅是本发明的优选实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些应当都属于本发明的保护范围。
1、腺苷酸激活蛋白激酶ampk作为肿瘤转移及预后诊断的生物标志物的用途。
本发明主要从肿瘤临床数据出发，在生化、分子、细胞及动物模型等层面上探索ampk的催化亚基ampkα1的表达与肿瘤转移的关系及分子机制，从而确定本发明的腺苷酸激活蛋白激酶ampk可以作为肿瘤转移及预后诊断的生物标志物进行应用。
经发明人的研究表明，ampkα1的表达在人恶性乳腺癌中明显下调，乳腺癌恶性程度越高，ampkα1表达就越低；此外，相对患乳腺癌5年后生存下来的乳腺癌患者，5年内去世的乳腺癌患者其肿瘤组织中ampkα1也显著降低。这些数据表明ampk可能与肿瘤的转移相关。
为了探索ampk在肿瘤转移中的作用，发明人通过多种方法抑制ampk的活性都发现抑制ampk可显著的在体内体外增加细胞的侵袭及肿瘤转移能力。重要的是发明人发现经典的癌信号包括pi3k、ras及her2都可显著抑制ampk催化亚基ampkα1的蛋白表达，进而促进细胞侵袭和肿瘤转移，激活ampk在体内体外显著抑制这些癌信号诱导的细胞侵袭和肿瘤转移。
综上所述，发明人的研究明确阐明了能量代谢感受器ampk在肿瘤迁移过程中扮演着重要角色。因此，ampkα1的表达水平可作为肿瘤转移和预后的一个重要指标。以下通过实施例详细进行阐明。
2、腺苷酸激活蛋白激酶ampk的催化亚基ampkα1作为肿瘤转移及预后诊断的生物标志物的用途和ampkα1的表达水平作为肿瘤转移及预后诊断的生物标志物的用途。
实施例的肿瘤以乳腺癌为例，进行说明上述用途。
实施例
(1)ampkα1的mrna表达水平随着乳腺癌的恶性程度增加而显著降低
ampk由三个亚基组成：包括催化亚基α,连接亚基β及结合亚基γ。为研究ampk在肿瘤细胞中变化情况，发明人通过临床样本分析了ampk催化亚基α1的mrna在不同类型的乳腺癌中的表达情况。如图1a-图1c所示，在不同类型的乳腺癌中：包括三阴性乳腺癌(tnbc)、her2+/pr-/er-乳腺癌，ampkα1的mrna水平都随着肿瘤恶性程度的增加而显著降低。提示ampk在乳腺癌肿瘤发生发展过程中起着重要作用。
(2)ampkα1的蛋白表达水平随着乳腺癌的恶性程度增加而显著降低
在(1)的基础上，进一步的通过免疫组化分析了27个乳腺癌组织中ampkα1的表达情况，如图2a和图2b所示，相对于癌旁组织，93％(25/27)的乳腺癌组织中ampkα1表达都显著降低。进一步，免疫组化分析发现，相对于低恶性度的乳腺癌，在恶性程度高的乳腺癌组织中ampkα1表达也呈现出降低的趋势。再次表明，ampkα1的低表达与乳腺癌转移相关。
(3)ampkα1的mrna表达与乳腺癌患者的生存相关
在(2)的基础上，通过临床样本分析发现，相对患乳腺癌5年后生存下来的乳腺癌患者，5年之内去世的乳腺癌患者，其肿瘤组织中ampkα1也显著降低如图3所示。结果进一步提示ampkα1表达降低在乳腺癌的恶化过程中起着重要作用。
3、沉默腺苷酸激活蛋白激酶ampk的催化亚基ampkα1增加细胞的侵袭能力的用途。
(1)抑制ampk显著增加细胞的侵袭
在实施例3的基础上，为了验证ampk是否在乳腺癌瘤转移过程中起着重要作用，发明人选择人永生化的乳腺表皮细胞株mcf10a作为研究系统。发明人设计了两条不同的shrnas用于沉默ampkα1。如图4a所示，shrnas都能有效的沉默细胞中ampkα1的表达及显著降低pampk的水平，进一步通过matrigel-transwell分析发现，沉默ampkα1可显著增强细胞的侵袭能力(图4b)。此外，过表达ampkα1显性失活致死突变(ampkα1d139a)显著抑制ampk的活性，同时也明显的增强了细胞的侵袭能力(图4c和d)。综上所述表明，抑制ampk可显著增强细胞的侵袭能力。
(2)过表达e-cadherin显著恢复沉默ampkα1诱导的细胞侵袭和肿瘤转移
如图5a所示对临床数据进行分析，表明ampkα1和e-cadherin的mrna表达在乳腺癌中有显著的相关性，都呈现出低表达。为了探索e-cadherin是否在ampk失活调控侵袭和肿瘤转移中起着重要作用。发明人做了matrigel-transwell分析如图5b所示。如图5b所示，过表达e-cadherin可显著的抑制由ampk失活诱导的细胞侵袭。进一步，发明人做了裸鼠肺转移实验。如图5c所示，相对于对照组，沉默ampkα1可显著增强细胞在裸鼠肺部形成肿瘤的能力，表明沉默ampkα1在体内也可增强细胞的转移能力。重要的是，沉默ampkα1+过表达e-cadherin组裸鼠肺部成瘤的数量相对于沉默ampkα1组明显降低，表明e-cadherin在体内也可抑制由ampk失活诱导的细胞转移。综上所述表明，e-cadherin在ampk失活诱导的细胞侵袭和肿瘤转移过程中起着重要作用。
(3)经典癌信号pi3k、ras及her2显著抑制ampk的活性及基因的表达
大量研究表明，癌信号pi3k/ras/her2在肿瘤的发生发展及恶化过程中起着重要作用。临床数据表明，pi3kca,ras及her2在肿瘤发生过程中具有较高频率的突变。同时研究表明，pi3k/ras/her2对于改变肿瘤能量代谢也起着重要作用。ampk是细胞内关键的能量代谢感受器，因此发明人推测pi3k/ras/her2可能对ampk也有重要的影响。
为了探索pi3k/ras/her2对ampk的影响，发明人将pi3kca、h-ras及her2的热点突变p110αh1047r、h-rasg12v及her2v659e在mcf10a细胞中过表达。如图6a通过免疫印迹分析，发明人发现过表达p110αh1047r、h-rasg12v及her2v659e可显著的抑制ampk的活性及ampkα1的蛋白表达。此外发明人发现，如图6b所示在临床肿瘤样本中p110α发生突变、her扩增及ras发生突变都能显著抑制ampkα1的mrna表达。结果表明，癌信号pi3k/ras/her2对能量代谢感受器ampk有显著的抑制作用。
(4)激活ampk显著抑制pi3k诱导的细胞侵袭和肿瘤转移
上述研究表明，癌信号pi3k/ras/her2可显著增强细胞的侵袭能力，同时对ampk的活性具有显著的抑制作用。之前的研究表明，ampk失活在体内体外显著的增强了细胞的迁移能力。因此，ampk是否在癌信号诱导的细胞迁移过程中起着重要作用呢？
如图7a所示，发明人在稳定表达p110αh1047r的mcf10a细胞中过表达野生型的ampkα1或持续激活突变ampkα1-ca(t172d)。通过matrigel-transwell分析发现激活ampk也可显著抑制由p110αh1047r诱导的细胞侵袭。此外，如图7b所示通过裸鼠肺转移实验分析发现，激活ampk可显著的减少由p110αh1047r诱导的裸鼠肺部肿瘤的形成。表明ampk在癌信号诱导的细胞侵袭和肿瘤转移过程中起着重要作用。
根据本说明书的记载即可较好的实现本发明的技术方案。