一种菌渣中泰乐菌素残留效价的检测方法与流程

本发明涉及菌渣的检测检验技术领域，特别是涉及一种菌渣中泰乐菌素残留效价的检测方法。

背景技术：

生物发酵是抗生素类药物的主要生产方法之一，经发酵或者药物中间体再经改造侧链可以合成出抗生素类药物。发酵液中经提取、净化目标物后，产生大量菌渣，我国是抗生素生产大国，这些抗生素每年会产生大量抗生素菌渣，按照1吨抗生素产生40吨湿菌渣(含水率为70％左右)计算，2009年一年产生的湿菌渣就达600万吨左右。由于该菌渣主要是灭活菌丝体、残余培养基、微生物代谢产物、部分残留效价以及提取时加入的絮凝剂，助滤剂等，如不妥善处理，菌渣中的抗生素残留会通过引发微生物耐药而产生潜在的环境风险和人类健康风险。在我国抗生素菌渣已被定为危险废弃物，由于缺乏对菌渣的无害化处理工艺及安全性进行深入系统研究，目前抗生素菌渣不仅被禁止用做饲料或饲料添加剂，也不允许用作农肥，只能进行焚烧处理，但焚烧处理成本非常高。

泰乐菌素已经广泛的用于禽畜养殖业中，是目前国际上广泛使用的兽用抗生素之一，是使用最为广泛的猪饲料添加剂。据国家农业部统计，目前国际市场对泰乐菌素年需求量在1500吨左右，国内的年需求量为200吨。据估计美国每年有590吨的泰乐菌素用于牛和猪的饲料添加剂。日本有50％猪饲料添加了泰乐菌素。我国泰乐菌素已使用多年，而且大量出口到国外，泰乐菌素的年出口量均超千吨。在2007年出口的抗生素原料中，兽用抗生素的出口价值占了全部抗生素出口金额的28％，数量规模占了55％。大部分兽用抗生素2007年的出口量比上年同期有所增加，而硫酸黏杆菌素、泰乐菌素和吉他霉素的同比增长率较为显著。

菌渣的无害化处理问题已严重影响到当前我国抗生素制药行业的健康发展，尽快研发抗生素菌渣无害化处理与资源化生产工艺，已刻不容缓。

现有的方法标准中并没有完整的关于泰乐菌素菌渣中泰乐菌素残留量的检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的是为了提供一种菌渣中泰乐菌素残留效价的检测方法，以填补现有法标准中并没有完整的关于泰乐菌素菌渣中泰乐菌素残留量的检测方法的空白。并解决没有一种有效解决基质效应的影响，且现有技术无法快速/准确检测菌渣中泰乐菌素残留量的问题，

本发明的一种菌渣中泰乐菌素残留效价的检测方法，它是按照以下步骤进行的：

一、供试品样品制备：

1)称取含有泰乐菌素菌渣，加入提取剂，涡旋振荡1～5min后，于超声中辅助提取20～30min，以3000～4000rpm离心5～10min，取上清液，并收集沉淀备用；

2)将上步收集的沉淀，加入提取剂，涡旋振荡1min后，于超声中辅助提取30min，以3000～4000rpm离心10min，取上清液；

3)合并步骤1)和步骤2)的上清液，将上清液于40℃水浴旋转蒸发至原体积的1/4～1/5，得无机相，向无机相中加入甲醇溶液以及pH为5.5、浓度为0.15mol/L的乙酸钠缓冲溶液；充分震荡涡旋，待残渣全部溶解后，转移到离心管中，得待净化样品；

4)分别移取甲醇和超纯水对HLB固相萃取柱进行活化，加入上述处理所得待净化样品，以1mL/min速度过柱；待样液全部流出后，用水和淋洗液依次进行淋洗，抽干所有的液体，分析物用甲醇洗脱并收集，摇匀，过0.45μm滤膜后，得供试品样品，供液相色谱-质谱检测；

二、标准曲线绘制：

用甲醇将泰乐菌素标准贮备液稀释成质量浓度为1.00mg/L、5.00mg/L、10.00mg/L、20.00mg/L、50.00mg/L、100.00mg/L、200.00mg/L和500.00mg/L的标准工作溶液，采用高效液相色谱-质谱联用法对上述标准工作溶液进行检测，以测得峰面积作为纵坐标，以标准溶液浓度作为横坐标，绘制标准曲线，并求回归方程和相关系数；

三、测定：吸取上述标准工作溶液和供试品样品注入液相色谱-质谱联用仪中，采用在线固相萃取-超高压液相色谱-三重四极杆液相质谱仪对土壤中残留泰乐菌素进行检测，并根据外标法计算泰乐菌素残留量；即完成所述的菌渣中泰乐菌素残留效价的检测；

色谱条件：色谱柱：Agilent TC-C18柱，色谱柱内径为4.6mm，柱长250mm，填料颗粒直径为5μm，流动相：甲醇-0.1％甲酸溶液体系梯度洗脱，检测波长：290nm，进样量：20μL，流速：1mL/min，柱温：30℃；

质谱条件：

ESI电喷雾离子源；

正离子扫描模式；

采集方式：MRM；

子离子质荷比：173.84

离子源内毛细管电压：3.5kV；

锥孔电压：50V；

去溶剂气温度：350℃；

离子源温度：150℃；

脱溶剂气流量：900L/Hr；

锥孔气流量：60L/hr。

本发明包含以下有益效果：

本发明经实验研究，整理完善出关于泰乐菌素菌渣残留量的固相萃取-高效液相色谱检测方法，该方法经过验证具有较好的重复性和实用性，为我国微生物制药菌渣的科学有效管理、安全与最大程度资源化、实现低碳经济与循化经济发展提供依据。由于菌渣中含有大量菌丝体残留、蛋白质、氨基酸以及重金属等干扰物质，使其检测过程中基质效应严重，因此本发明通过对泰乐菌素菌渣进行提取、浓缩、净化等过程的探索和优化，使得菌渣中杂质物质含量被大大减少，基质干扰减弱，本研究通过提取、净化等方式能够高效提取泰乐菌素并去除杂质，减少基质干扰，增加检测准确度，不仅可以保护检测仪器同时可以准确对菌渣中泰乐菌素的含量进行检测。

本发明对菌渣泰乐菌素的残留量为500～900μg/g进行，平均回收率为：80.2％～95.3％。精密度试验的RSD为4.1％～6.0％。

通过本发明的方法可以有效地从菌渣中提取泰乐菌素，尽最大可能降低菌渣中其他杂质对后续检测的影响，从而提高检测的准确度。

附图说明

图1为实施例1～500mg/L范围内的标准曲线图，标准曲线的回归方程为y＝14115.03x-25366.01；R²＝0.998；

图2为实施例100mg/L的标准品测定图；

图3为实施例100mg/L的标准品图谱；

图4为实施例1g样品检测的样品图谱；

图5为实施例不进样品的基线图谱。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一种菌渣中泰乐菌素残留效价的检测方法，它是按照以下步骤进行的：

一、供试品样品制备：

1)称取含有泰乐菌素菌渣，加入提取剂，涡旋振荡1～5min后，于超声中辅助提取20～30min，以3000～4000rpm离心5～10min，取上清液，并收集沉淀备用；

2)将上步收集的沉淀，加入提取剂，涡旋振荡1min后，于超声中辅助提取30min，以3000～4000rpm离心10min，取上清液；

3)合并步骤1)和步骤2)的上清液，将上清液于40℃水浴旋转蒸发至原体积的1/4～1/5，得无机相，向无机相中加入甲醇溶液以及pH为5.5、浓度为0.15mol/L的乙酸钠缓冲溶液；充分震荡涡旋，待残渣全部溶解后，转移到离心管中，得待净化样品；

4)分别移取甲醇和超纯水对HLB固相萃取柱进行活化，加入上述处理所得待净化样品，以1mL/min速度过柱；待样液全部流出后，用水和淋洗液依次进行淋洗，抽干所有的液体，分析物用甲醇洗脱并收集，摇匀，过0.45μm滤膜后，得供试品样品，供液相色谱-质谱检测；

二、标准曲线绘制：

用甲醇将泰乐菌素标准贮备液稀释成质量浓度为1.00mg/L、5.00mg/L、10.00mg/L、20.00mg/L、50.00mg/L、100.00mg/L、200.00mg/L和500.00mg/L的标准工作溶液，采用高效液相色谱-质谱联用法对上述标准工作溶液进行检测，以测得峰面积作为纵坐标，以标准溶液浓度作为横坐标，绘制标准曲线，并求回归方程和相关系数；

三、测定：吸取上述标准工作溶液和供试品样品注入液相色谱-质谱联用仪中，采用在线固相萃取-超高压液相色谱-三重四极杆液相质谱仪对土壤中残留泰乐菌素进行检测，并根据外标法计算泰乐菌素残留量；即完成所述的菌渣中泰乐菌素残留效价的检测；

色谱条件：色谱柱：Agilent TC-C18柱，色谱柱内径为4.6mm，柱长250mm，填料颗粒直径为5μm，流动相：甲醇-0.1％甲酸溶液体系梯度洗脱，检测波长：290nm，进样量：20μL，流速：1mL/min，柱温：30℃；

质谱条件：

ESI电喷雾离子源；

正离子扫描模式；

采集方式：MRM；

子离子质荷比：173.84

离子源内毛细管电压：3.5kV；

锥孔电压：50V；

去溶剂气温度：350℃；

离子源温度：150℃；

脱溶剂气流量：900L/Hr；

锥孔气流量：60L/hr。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：淋洗液为含体积百分含量为2％氨水以及体积百分含量为5％甲醇的水溶液。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：在线固相萃取-超高压液相色谱-三重四极杆液相质谱仪的质谱条件是采用多级反应监测模式，采用正离子模式对泰乐菌素的母离子以及碎片进行检测。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤1)和2)提取剂均为质量百分含量为90％乙腈水溶液，pH＝4。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：泰乐菌素菌渣与提取剂的质量体积比为1g：10mL。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：沉淀与提取剂的质量体积比为1g：10mL。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同的是：甲醇溶液与乙酸钠缓冲溶液的体积比为1:9。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤4)中甲醇与超纯水的体积比1:1。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤4)中水与淋洗液的体积比1:1。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一不同的是：菌渣中泰乐菌素的残留量为500～900μg/g。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一不同的是：菌渣中泰乐菌素的残留量为500～900μg/g。其它与具体实施方式一相同。

本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。

通过以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例1

本实施例的一种菌渣中泰乐菌素残留效价的检测方法，包括如下步骤：

仪器：在线固相萃取-超高压液相色谱-三重四极杆液相质谱仪(美国Waters,Open Architecture UPLC,Xevo TQ MS)。

色谱条件：色谱柱为Agilent TC-C18柱(4.6mm×250mm,5μm)、流动相：甲醇-0.1％甲酸溶液体系梯度洗脱，梯度洗脱程序(A)甲醇；(B)0.1％甲酸：时间0min，45％A，55％B；3min，45％A，55％B；6min，90％A，10％B；8min，45％A，55％B。检测波长：290nm，进样量：20μL，流速：1mL/min，柱温：30℃。

质谱条件：

ESI电喷雾离子源；

正离子扫描模式；

采集方式：MRM；

子离子质荷比：173.84

离子源内毛细管电压：3.5kV；

锥孔电压：50V；

去溶剂气温度：350℃；

离子源温度：150℃；

脱溶剂气流量：900L/Hr；

锥孔气流量：60L/hr。

质谱条件采用多级反应监测模式(MRM)，采用正离子模式对泰乐菌素的母离子以及碎片进行检测。

1)供试品样品制备：称取样品1g(精确至0.0001g)，于50mL聚丙烯离心管中，加入10mL提取剂(pH＝4，90％乙腈水溶液)，涡旋振荡1min，于超声中辅助提取30min，以3000～4000rpm离心10min，取上清液。重复操作一次(即加入提取剂得上清液的操作)，合并上清液。将提取液于40℃水浴旋转蒸发至剩2mL无机相，转移到50mL聚丙烯离心管，再加入0.5mL甲醇溶液以及pH为5.5的0.15mol/L的乙酸钠缓冲溶液于10mL离心管中，充分震荡涡旋1min，待残渣全部溶解后，转移到10mL聚丙烯离心管。分别移取5mL甲醇、5mL超纯水对HLB固相萃取柱进行活化，加入上述处理所得样品，以1mL/min速度过柱，待样液全部流出后，用5mL水、5mL的淋洗液(含2％氨水5％甲醇的水溶液)进行淋洗，抽干所有的液体，分析物用5mL甲醇洗脱并收集。摇匀，过0.45μm滤膜后，得供试品，供液相色谱检测。

2)标准品曲线绘制：用甲醇将标准贮备液稀释成质量浓度为1.00mg/L、5.00mg/L、10.00mg/L、20.00mg/L、50.00mg/L、100.00mg/L、200.00mg/L和500.00mg/L标准溶液，采用高效液相色谱-质谱联用法对上述标准工作溶液进行检测，以测得峰面积作为纵坐标，以对应的标准溶液浓度作为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数；

3)测定：吸取上述标准品溶液和供试品溶液各10μL注入液相色谱-质谱联用仪中，根据外标法计算泰乐菌素残留效价。

本实施例的菌渣中泰乐菌素残留效价的检测方法，试验过程发现：菌渣中杂质较多，现有的方法不能将泰乐菌素有效检出，检出量小，灵敏度低。要定量控制，难度很大；同时样品处理过程复杂、繁琐，使得部分泰乐菌素损失。通过大量实验，根据各杂质的性质，提取、纯化样品，同时采用梯度洗脱方式，将微量泰乐菌素有效检出，并取得高效分离，有效检测菌渣中的泰乐菌素效价。

验证结果表明：准确度试验的平均回收率为：80.2％～95.3％。精密度试验的RSD分别为4.1％～6.0％；线性关系良好，相关系数r²＝0.998；专属性试验考察无阴性干扰。试验证明所建立的方法准确度高、专属性强、重现性良好，能有效检测菌渣中泰乐菌素残留效价。

实施例2

菌渣中泰乐菌素残留物检测，它是按照以下步骤进行的：

仪器：在线固相萃取-超高压液相色谱-三重四极杆液相质谱仪(美国Waters,Open Architecture UPLC,Xevo TQ MS)。

色谱条件：色谱柱：Agilent TC-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相采取甲醇-0.1％甲酸溶液体系梯度洗脱，梯度洗脱程序(A)甲醇；(B)0.1％甲酸：时间0min，45％A，55％B；3min，45％A，55％B；6min，90％A，10％B；8min，45％A，55％B。检测波长：290nm，进样量：20μL，流速：1mL/min，柱温：30℃。

质谱条件：

ESI电喷雾离子源；

正离子扫描模式；

采集方式：MRM；

子离子质荷比：173.84

离子源内毛细管电压：3.5kV；

锥孔电压：50V；

去溶剂气温度：350℃；

离子源温度：150℃；

脱溶剂气流量：900L/Hr；

锥孔气流量：60L/hr。

1)供试品样品制备：称取样品1g(精确至0.0001g)，于50mL聚丙烯离心管中，加入10mL提取剂(pH＝4，90％乙腈水溶液)，涡旋振荡1min，于超声中辅助提取30min，以3000～4000rpm离心10min，取上清液。重复操作一次(即加入提取剂得上清液的操作)，合并上清液。将提取液于40℃水浴旋转蒸发至剩2mL无机相，转移到50mL聚丙烯离心管，再加入0.5mL甲醇溶液以及pH为5.5的0.15mol/L的乙酸钠缓冲溶液于10mL离心管中，充分震荡涡旋1min，待残渣全部溶解后，转移到10mL聚丙烯离心管。分别移取5mL甲醇、5mL超纯水对HLB固相萃取柱进行活化，加入上述处理所得样品，以1mL/min速度过柱，待样液全部流出后，用5mL水、5mL的淋洗液(含2％氨水5％甲醇的水溶液)进行淋洗，抽干所有的液体，分析物用5mL甲醇洗脱并收集。摇匀，过0.45μm滤膜后供液相色谱检测。

2)标准品曲线绘制：用甲醇将标准贮备液稀释成质量浓度为1.00mg/L、5.00mg/L、10.00mg/L、20.00mg/L、50.00mg/L、100.00mg/L、200.00mg/L和500.00mg/L标准溶液，采用高效液相色谱-质谱联用法对上述标准工作溶液进行检测，以测得峰面积作为纵坐标，以对应的标准溶液浓度作为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数；

3)测定：吸取上述标准品溶液和供试品溶液各10μL注入液相色谱-质谱联用仪中，根据外标法计算泰乐菌素残留效价。

方法验证：

通过一定的处理，菌渣中的泰乐菌素残留量于较低水平，在空白样品中的加标浓度分别为10、50、200mg/kg。采用本实验方法进行分析检测，实验室重复进行3次，求得的回收率及其标准偏差，样品中泰乐菌素的含量按公式(1)计算。

式中：X—样品中泰乐菌素的含量，单位为微克每克(μg/g)；

C—样品溶液中泰乐菌素的浓度，单位为毫克每升(μg/mL)；

m—样品质量，单位为克(g)；

V—样品溶液体积，单位为毫升(mL)

当加标水平在10-200mg Kg^-1时，菌渣的泰乐菌素平均回收率范围为79.9％-93.2％，标准偏差范围为4.1％～6.0％(n＝3)，计算得到LOD为0.048μg/mg，LOQ为0.061μg/mg。且在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。