一种基于碳纳米管和三螺旋分子开关的试纸条生物传感器及其制备方法和应用与流程

本发明属于核酸生物传感器技术领域，尤其涉及一种基于碳纳米和三螺旋分子开关的试纸条生物传感器及其制备方法和应用。

背景技术：

核酸是重要的生物大分子，它们编码和调节所有生物中遗传信息的表达。然而，核酸序列的一些微小变化可能导致生物医学和生物学重要的变化。核酸测试对于遗传疾病的诊断和治疗，感染因子的检测，药物发现或对生物战剂的警告至关重要。常规方法如northern，southern和western印迹，琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳不能提供足够的特定信息，并且非常费力和耗时，需要长达48小时的细致实验室工作。新方法和技术包括实时聚合酶链反应(rt-pcr)，dna微阵列(基因芯片)，表面等离子共振biacore仪器和genexpert系统能快速灵敏的检测核酸序列的工具；然而，高昂的设备成本和训练有素的人员的需求阻碍了它们在许多实验室中的使用。

最近，poc核酸生物传感器的开发兴起，新兴的侧向流核酸(lfna)试纸条为实现poc核酸检测带来了希望。但是目前的侧向流核酸(lfna)试纸条靶序列的设计灵活性小，特异性差，灵敏度低。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种靶序列的设计灵活性大、特异性好，灵敏度高的试纸条生物传感器及其制备方法和应用。

基于上述发明目的，本发明提供了一种基于碳纳米和三螺旋分子开关的试纸条生物传感器，包括底板和顺次搭接在底板上的样品垫、结合垫、检测垫和吸收垫；所述结合垫上喷涂结合三螺旋dna分子结构的碳纳米管和结合第二氨基dna的碳纳米管；所述三螺旋dna分子结构包括第一氨基dna和单链dnap0，所述单链dnap0的5’端与3’端存在序列相同的碱基，所述单链dnap0中存在与第一氨基dna互补配对的碱基，能够形成发卡结构，所述第一氨基dna与单链dnap0以三螺旋的方式存在；所述检测垫上设置检测线和质控线；所述检测线上喷涂有第一dna-生物素-链酶亲和素复合物；所述第一dna-生物素-链酶亲和素复合物中的dna与三螺旋dna分子结构解螺旋后的第一氨基dna通过碱基互补配对结合；所述质控线上喷涂有第二dna-生物素-链酶亲和素复合物，所述第二dna-生物素-链酶亲和素复合物能够与第二氨基dna分子结合；所述第一氨基dna与第二氨基dna的核苷酸序列不同；所述单链dnap0的序列与待检核酸的核苷酸序列互补配对。

优选的，所述待检核酸为蛋白适配体。

优选的，所述第一氨基dna的序列为5’-nh2-c6-agagggaaa-3’。

优选的，所述第二氨基dna的序列为5’-nh2-c6-gtctgtcaa-3’。

优选的，所述碳纳米管为多壁碳纳米管，所述多壁碳纳米管的管长为8～12μm，所述多壁碳纳米管的管径为30～50nm。

本发明还提供了所述的试纸条生物传感器的制备方法，包括以下步骤：1)将碳纳米管在酸性条件下超声处理获得羧基化的碳纳米管；2)将所述羧基化的碳纳米管与第一氨基dna脱水缩合获得结合有第一氨基dna的碳纳米管，将所述羧基化的碳纳米管与第二氨基dna脱水缩合获得结合有第二氨基dna的碳纳米管；3)将所述结合有第一氨基dna的碳纳米管、单链dnap0混合，将所得混合液在孵育液中孵育获得结合三螺旋dna分子结构的碳纳米管；4)将步骤3)所述结合三螺旋dna分子结构的碳纳米管与结合第二氨基dna的碳纳米管混合喷涂于结合垫上；5)将第一dna-生物素、第二dna-生物素分别与链霉亲和素混合孵育获得第一dna-生物素-链酶亲和素复合物和第二dna-生物素-链酶亲和素复合物；6)将步骤5)中的第一dna-生物素-链酶亲和素复合物和第二dna-生物素-链酶亲和素复合物依次线状喷涂于检测垫上形成检测线和质控线；7)将样品垫、结合垫、检测垫和吸收垫顺次搭接在底板上获得试纸条生物传感器。

优选的，步骤2)中所述脱水缩合用的缩合剂为edc-nhs溶液。

优选的，步骤3)中所述孵育液为包括mgcl2和nacl的pbs溶液，所述孵育液中mgcl2的浓度为2.2～2.7mm；所述nacl浓度为0.08～0.12m，所述pbs的浓度为15～25mm。

优选的，步骤3)所述孵育过程伴随震荡，所述孵育的时间为80～100min。

本发明提供了所述试纸条生物传感器在检测核酸或蛋白质中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供的基于碳纳米和三螺旋分子开关的试纸条生物传感器，以结合三螺旋dna分子结构的碳纳米管和结合第二氨基dna的碳纳米管喷涂结合垫；其中所述碳纳米管，相比于纳米金，表面积更大，有利于生物分子偶合，进一步提高检测灵敏度，检测限下降10～20倍。

本发明中所述三螺旋dna分子结构的碳纳米管上的三螺旋构象的性质独立于其携带的任何特定结合序列，使得三螺旋生物传感策略普遍适用。与传统的双链dna生物传感器相比，基于三螺旋构象的生物传感器具有一些独特的优势。通过单链dnap0的两个短臂互补寡核苷酸形成的三螺旋构象具有与通过设计更长的互补寡核苷酸实现的双链dna相似的稳定性，并且靶序列的设计灵活性变大，从而增强了特异性和结合目标分析物的能力，实现更高的灵敏度。

本发明所述试纸条生物传感器的直接检测对象为核酸，与蛋白质类抗体相比，核酸适体的耐受变性更强，靶分子范围广泛，并且核酸适体与靶分子间具有更高的亲和力和特异性。

本发明所述的试纸条生物传感器应用灵活，即可以检测目的核酸，也可以通过蛋白适配体检测目的蛋白质。

本发明所述的试纸条生物传感器将碳纳米管、dna三螺旋结构、酶化学和试纸条结合，操作简便，生产成本低，检测通用性强。

附图说明

图1为本发明所述试纸条生物传感器的制备流程和检测原理图；

图2为实施例1中检测目的dna浓度的对数值与信号值的线性关系图；

图3为试纸条生物传感器的样品检测结果。

具体实施方式

本发明提供了一种基于碳纳米和三螺旋分子开关的试纸条生物传感器，包括底板和顺次搭接在底板上的样品垫、结合垫、检测垫和吸收垫；所述结合垫上喷涂结合三螺旋dna分子结构的碳纳米管和结合第二氨基dna的碳纳米管；所述三螺旋dna分子结构包括第一氨基dna和单链dnap0，所述单链dnap0的5’端与3’端存在互补配对碱基，能够形成发卡结构，所述第一氨基dna与单链dnap0以三螺旋的方式存在；所述检测垫上设置检测线和质控线；所述检测线上喷涂有第一dna-生物素-链酶亲和素复合物；所述第一dna-生物素-链酶亲和素复合物能够与三螺旋dna分子结构解螺旋后的第一氨基dna结合；所述质控线上喷涂有第二dna-生物素-链酶亲和素复合物，所述第二dna-生物素-链酶亲和素复合物能够与第二氨基dna分子结合；所述第一氨基dna与第二氨基dna的核苷酸序列不同；所述单链dnap0的序列与待检核酸的核苷酸序列互补配对。

在本发明中，所述试纸条生物传感器包括底板和顺次搭接在底板上的样品垫、结合垫、检测垫和吸收垫。本发明对所述试纸条生物传感器的外观和尺寸没有特殊要求，采用本领域常规试纸条的尺寸即可，在本发明具体实施过程中，所述试纸条的宽度优选为3～5mm。在本发明中，所述样品垫、结合垫、检测垫和吸收垫依次搭接在底板上；本发明中所述各部分搭接的长度优选为1.8～2.5mm；本发明各部分搭接设置的目的为在待测液从一个材料过渡到另一个材料时能够保证流动的一致性。

本发明所述试纸条生物传感器包括样品垫，本发明对所述样品垫的材料没有特殊要求采用本领域常规的样品垫材料即可。在本发明具体实施过程中，所述样品垫的材料为纤维素；本发明所述试纸条生物传感器在使用的过程中将所述样品垫没入待检dna溶液中或者将所述待检dna溶液滴加到所述样品垫上。

本发明所述试纸条生物传感器包括结合垫。本发明对所述结合垫的材料没有特殊要求采用本领域常规的结合垫材料即可。在本发明中所述结合垫上喷涂结合三螺旋dna分子结构的碳纳米管和结合第二氨基dna的碳纳米管，所述结合三螺旋dna分子结构的碳纳米管和结合第二氨基dna的碳纳米管的浓度优选独立为0.8～1.2mg·ml^-1，更优选为1mg·ml^-1，所述结合三螺旋dna分子结构的碳纳米管和结合第二氨基dna的碳纳米管的数量比为3:1。在本发明中，所述碳纳米管为多壁碳纳米管(mwcnts，简写cnts)，所述多壁碳纳米管的管长为8～12μm，所述多壁碳纳米管的管径为30～50nm本发明中，所述多壁碳纳米管购自南京先丰纳米材料科技有限的公司。在本发明中，所述三螺旋dna分子结构包括第一氨基dna和单链dnap0，所述单链dnap0的5’端与3’端存在互补配对碱基，能够形成发卡结构，所述第一氨基dna与单链dnap0以三螺旋的方式存在。在本发明中，所述第一氨基dna的序列优选为5’-nh2-c6-agagggaaa-3’(seqidno.1)；所述第二氨基dna的序列为5’-nh2-c6-gtctgtcaa-3’(seqidno.2)。在本发明中，所述单链dnap0的核苷酸序列根据待检dna的核苷酸序列设计，与所述待检dna的核苷酸序列互补配对。本发明中所述第二氨基dna的核苷酸序列与质控线上喷涂的第二dna-生物素-链酶亲和素复合物中的第二dna互补配对。本发明中，所述结合垫上喷涂的结合三螺旋dna分子结构的碳纳米管和结合第二氨基dna的碳纳米管的浓度优选的独立为0.08～0.12odml^-1，更优选的为0.1odml^-1。

本发明中，所述试纸条生物传感器包括检测垫。本发明中所述检测垫的材料优选为硝酸纤维素膜，在本发明中所述监测点上依次设置检测限和质控线。本发明中，所述检测线上喷涂有第一dna-生物素-链酶亲和素复合物；所述第一dna-生物素-链酶亲和素复合物能够与三螺旋dna分子结构解螺旋后的第一氨基dna结合；所述质控线上喷涂有第二dna-生物素-链酶亲和素复合物，所述第二dna-生物素-链酶亲和素复合物能够与第二氨基dna分子结合。

本发明中，所述试纸条生物传感器包括吸收垫，本发明对所述吸收垫的材料没有特殊要求，采用本领域常规的吸收垫材料即可。

本发明中所述试纸条生物传感器的检测原理具体如下：以结合三螺旋dna分子结构的碳纳米管作探针，当无目标物存在时，碳纳米管上的氨基dna被单链dnap0屏蔽，无法被检测线上与第一氨基dna互补的第一dna-生物素-链酶亲和素复合物捕获，测试线上无黑线产生，喷涂在结合垫上的结合第二氨基dna的碳纳米管与质控线上的第二dna-生物素-链酶亲和素复合物结合，质控线上显示黑线；当有目标物存在时，目标物与单链dnap0结合，碳纳米管上的三螺旋dna分子结构打开，从而暴露出碳碳纳米管上的第一氨基dna，被检测线上的dna捕获，形成黑线，同时，喷涂在结合垫上的结合第二氨基dna的碳纳米管与质控线上的第二dna-生物素-链酶亲和素复合物结合，质控线上显示黑线。本发明所述试纸条生物床干起通过改变单链dnap0的碱基序列，可以检测与单链dnap0互补的dna链，又可以将适配体作为单链dnap0的部分结构用以检测各种蛋白质。

本发明还提供了所述试纸条生物传感器的制备方法，包括以下步骤：1)将碳纳米管在酸性条件下超声处理获得羧基化的碳纳米管；2)将所述羧基化的碳纳米管与第一氨基dna脱水缩合获得结合有第一氨基dna的碳纳米管；3)将所述结合有第一氨基dna的碳纳米管、单链dnap0混合在孵育液中孵育获得结合三螺旋dna分子结构的碳纳米管；4)将步骤3)所述结合三螺旋dna分子结构的碳纳米管与结合第二氨基dna的碳纳米管混合喷涂于结合垫上；5)将第一dna-生物素、第二dna-生物素分别与链霉亲和素混合孵育获得第一dna-生物素-链酶亲和素复合物和第二dna-生物素-链酶亲和素复合物；6)将步骤5)中的第一dna-生物素-链酶亲和素复合物和第二dna-生物素-链酶亲和素复合物依次线状喷涂于检测垫上形成检测线和质控线；7)将样品垫、结合垫、检测垫和吸收垫顺次搭接在底板上获得试纸条生物传感器。

本发明将碳纳米管在酸性条件下超声处理获得羧基化的碳纳米管。在本发明中所述超声处理的时间优选为10～14h，更优选为12h；所述超声处理的功率优选为400～500w，更优选为450w。在本发明中所述酸性条件由混合浓酸提供，本发明中所述混合浓酸包括浓硫酸和浓硝酸；所述浓硫酸和浓硝酸的体积比优选为(2～4)：1，更优选为3:1；所述浓硫酸的浓度优选为98％；所述浓硝酸的浓度优选为69％。本发明在所述超声处理后，优选的对处理后的料液进行离心，收集羧基化的碳纳米管。在本发明中，所述离心的转速优选为13000～16000rpm，更优选为13500～15000rpm，最优选为14500rpm，所述离心的时间优选为15～25min，更优选为18～22min，最优选为20min。本发明在所述离心后，优选的使用pbs溶液反复洗涤收集到的羧基化碳纳米管至中性，将所述羧基化碳纳米管与pbs溶液混合形成羧基化碳纳米管溶液，所述羧基化碳纳米管溶液的浓度优选为0.5～1.5mg/ml，更优选为1.0mg/ml。

本发明在获得所述羧基化碳纳米管后，将所述羧基化的碳纳米管与第一氨基dna脱水缩合获得结合有第一氨基dna的碳纳米管。本发明优选的将所述羧基化碳纳米管溶液与等体积的二次水混合均匀后离心，收集固相组分；在本发明中，所述离心的转速优选为13000～15000rpm，更优选为13500～14500rpm，最优选为14000rpm，所述离心的时间优选为20～30min，更优选为22～28min，最优选为25min。本发明中，所述脱水缩合的缩合剂为edc-nhs溶液。在本发明中，所述edc-nhs溶液优选为包括edc和nhs的mes溶液；所述edc-nhs溶液中edc的浓度优选为9～10mg/ml，所述edc-nhs溶液中nhs的浓度优选为5～6mg/ml。本发明优选的将所述固相组分溶解于上述edc-nhs溶液中摇床震荡50～70min；所述摇床震荡的温度优选为20～30℃，本发明所述摇床震荡的转速没有特殊限定。本发明在所述摇床震荡后，优选的使用pbs溶液清洗多余的edc-nhs，然后与所述第一氨基dna混合，震荡孵育获得结合有第一氨基dna的碳纳米管。在本发明中所述震荡孵育的时间优选为10～14h，更优选为12h，本发明对所述震荡孵育的转速没有特殊限定。本发明在所述震荡孵育后，优选的进行离心，收集固相组分为结合有第一氨基dna的碳纳米管。本发明中所述转速优选为13000～16000rpm，更优选为13500～15000rpm，最优选为14500rpm，所述离心的时间优选为15～25min，更优选为18～22min，最优选为20min。本发明在所述离心后优选的使用pbst溶液清洗固相组分2～4次后，将所述固相组分保存于纳米粒子存储液(20mmoll^-1na3po4·12h2o，质量浓度5％bsa，体积浓度0.25％tween20，质量浓度10％sucrose的水溶液)中，备用。

本发明将所述结合有第一氨基dna的碳纳米管、单链dnap0混合在孵育液中孵育获得结合三螺旋dna分子结构的碳纳米管。在本发明中，所述结合有第一氨基dna的碳纳米管与单链dnap0的体积比优选为1:1；所述单链dnap0的浓度优选为0.8～1.2μm，更优选为1.0μm。在本发明中，所述所述孵育液为包括mgcl2和nacl的pbs溶液，所述孵育液中mgcl2的浓度优选为2.2～2.7mm，更优选为2.5mm；所述nacl浓度优选为0.08～0.12m，更优选为1.0m，所述pbs的浓度优选为15～25mm，更优选为20mm。本发明中所述孵育液的ph值优选为5.8～6.2，更优选为6.0；所述孵育过程伴随震荡，所述孵育的时间优选为80～100min，更优选为90min。

在本发明中，所述结合有第二氨基dna的碳纳米管的制备方法与结合有第一氨基dna碳纳米管的制备方法一致，区别仅在于第二氨基dna的核苷酸序列与第一氨基dna不同，在此不再赘述。

本发明在获得所述结合三螺旋dna分子结构的碳纳米管与结合第二氨基dna的碳纳米管后，本发明将所述结合三螺旋dna分子结构的碳纳米管与结合第二氨基dna的碳纳米管混合喷涂于结合垫上；本发明中所述喷涂用的喷头优选为biojetbjq3000喷头。

本发明将第一dna-生物素与链霉亲和素混合孵育获得第一dna-生物素-链酶亲和素复合物。在本发明中，所述第一dna-生物素、第二dna-生物素的量独立的优选为80～120nm，更优选为100nm；所述链霉亲和素的浓度优选为2～3mg/ml，更优选为2.5mg/ml；所述链霉亲和素的体积优选为180～220ml，更优选为200ml。本发明中，所述孵育的时间优选为55～65min，更优选为60min。本发明在所述孵育结束后，优选的将孵育混合物中加入pbs缓冲液后使用超滤管离心过滤除去未结合的第一dna-生物素。本发明中所述第二dna-生物素-链霉亲和素复合物的制备方法与第一dna-生物素-链酶亲和素复合物一致，在此不再赘述。

本发明将所述第一dna-生物素-链酶亲和素复合物和第二dna-生物素-链酶亲和素复合物依次线状喷涂于检测垫上形成检测线和质控线；本发明中所述喷涂用的喷头优选为biojetbjq3000喷头。本发明优选的将所述喷涂检测线和质控线的检测垫干燥后于4℃保存。

本发明将样品垫、结合垫、检测垫和吸收垫顺次搭接在底板上获得试纸条生物传感器。在本发明中所述样品垫的纤维素材料优选的在使用前需浸泡在含有0.25％tritonx-100，0.05moll-1tris-hcl，和0.15mmoll-1nacl的缓冲溶液(ph8.0)中一个小时，干燥后于干燥器中保存待用。本发明优选的将所述样品垫、结合垫、检测垫和吸收垫顺次搭接在底板上后，用切片机切成3mm宽的试纸条。

本发明还提供了所述试纸条生物传感器在检测核酸或蛋白质中的应用。本发明对所述待检核酸的种类没有特殊限定，当检测蛋白质时，所述单链dnap0为蛋白质的适配体。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

使用混合浓酸(浓硫酸：浓硝酸＝3:1)超声处理管长10μm，管径30-50nm的多壁碳纳米管(mwcnts，后面简写为cnts)12h，离心(14500rpm,20min)后使用pbs溶液清洗至cnts溶液为中性，溶液浓度为1mg/ml。

取500μl上述cnts溶液，加500μl二次水成1ml体系，混匀，14000rpm离心25min去上清，溶于含有9.6mgedc、5.4mgnhs的1ml的mes缓冲溶液(ph＝4.7)中，室温摇床1h，用pbs缓冲溶液清洗3次后溶于1mlpbs(ph＝7.4)中，加入0.1od的第一氨基dna(5’-nh2-c6-agagggaaa-3’，上海生工)，摇床过夜反应，离心(14500rpm,20min)用pbst清洗3次后，将沉淀溶于1ml纳米粒子存储液(20mmoll-1na3po4·12h2o，5％bsa，0.25％tween20，10％sucrose)中。

结合有第二氨基dna的碳纳米管的制备方法与上述制备结合第一氨基dna的碳纳米管的方法一致，不同之处是使用的第二氨基dna的序列为5’-nh2-c6-gtctgtcaa-3’不同。

上述cnt-dna1与等体积1μm单链dnap0(5’-tccctttggttggtgtggttggtttccct-3’，seqidno.5，上海生工)在2.5mmmgcl2、0.1mnacl的20mm的pbs溶液中混合，摇床反应90min。形成的三螺旋dna-cnt探针，使用1％pbsb清洗两次后重悬于纳米粒子存储液中。

将100nm(物质的量)的生物素化(5’-biotin-tttccctct-3’，seqidno.3)探针(第一dna-生物素)与200ml2.5mg/ml链霉抗生物素蛋白混合，并在室温下温育1小时。向混合物中加入500μlpbs后，使用超滤管(分子截留量30000)离心过滤器在4℃以6000rpm离心20min以除去未结合的dna。将上述步骤重复3次。获得第一dna-生物素-链霉亲和素复合物，将剩余的溶液用pbs稀释并用于划线。

质控线上喷涂的第二dna-生物素-链霉亲和素复合物的制备方法与第一dna-生物素-链霉亲和素复合物的制备方法一致，不同之处是第二dna-生物素中dna的序列为5’-biotin-ttgacagac-3’(seqidno.4)。

使用biojetbjq3000喷头，分别将第一dna-生物素-链霉亲和素复合物和第二dna-生物素-链霉亲和素复合物喷在硝酸纤维素膜上，以形成检测线和质控线，室温下干燥，并于4℃下保存。

制备样品垫(17mm×30cm)的纤维素纤维在使用前需浸泡在含有0.25％tritonx-100，0.05moll-1tris-hcl，和0.15mmoll-1nacl的缓冲溶液(ph8.0)中1h，然后在室温下干燥，于干燥器中保存待用。

将各部分按顺序依次组装在底板上，并保证各部分相互重叠约2mm，这是为了使待测液从一个材料过渡到另一个材料时能够保证流动的一致性。然后将粘贴好的部分用切片机切成3mm宽的试纸条待用。

将试纸条至于含有不同浓度的待检dna：5’-agggaaaccaaccacaccaaccaaagggattttt-3’，seqidno.5的缓冲溶液(5×ssc+4％bsa)中检测，10min中后加入另70μl的缓冲溶液中。结果可裸眼目测，也可以置于读条机中读数实现定量检测。

结果如图2和图3所示，定量检测限为0.098nm，可视检测限为0.1nm，在0.1～10nm的浓度范围内，信号值与浓度的对数值有线性关系。

实施例2

使用基于碳纳米管和三螺旋分子开关的试纸条生物传感器检测癌胚蛋白cea。

设计的单链dnap0部分序列为cea的适配体。除了以下部分，试纸条其他部分与实施例1中一样：单链dnap0的核苷酸序列为5’-tccctttcccatagggaagtgggggatttccct-3’(seqidno.6)。

实施例3

使用基于碳纳米管和三螺旋分子开关的试纸条生物传感器检测肝癌标记物afp。设计的单链danp0部分序列为afp的适配体。

除了以下部分，试纸条其他部分与实施例1中一样，单链dnap0的核苷酸序列为5’-tcccttttcaggtgcagttctcgactcggtcttgatgtgggttttccct-3’(seqidno.7)。

实施例4

使用基于碳纳米管和三螺旋分子开关的试纸条生物传感器检测卵巢癌标记物ca125。

设计的单链danp0部分序列为ca125的适配体。除了以下部分，试纸条其他部分与实施例1中一样：单链dnap0的核苷酸序列为5’-tccctttactagctccgatctttcttatctactttccct-3’(seqidno.8)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>安徽科技学院

<120>一种基于碳纳米管和三螺旋分子开关的试纸条生物传感器及其制备方法和应用

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

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<211>9

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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agagggaaa9

<210>2

<211>9

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gtctgtcaa9

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<211>9

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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tttccctct9

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<211>9

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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ttgacagac9

<210>5

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

tccctttggttggtgtggttggtttccct29

<210>6

<211>33

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

tccctttcccatagggaagtgggggatttccct33

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<212>dna

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tcccttttcaggtgcagttctcgactcggtcttgatgtgggttttccct49

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

tccctttactagctccgatctttcttatctactttccct39