一种高通量检测柚皮素的方法与流程

本发明涉及一种高通量检测柚皮素的方法，属于合成生物技术领域。

背景技术：

柚皮素是重要的黄酮类化合物合成的平台化合物，众多的黄酮类化合物都是以柚皮素为前体，经过羟基化、甲基化、异戊烯基化、糖基化等修饰后合成。而在微生物中合成柚皮素时，多使用高效液相色谱法(hplc)作为检测手段，但在处理大量样品时，使用高效液相色谱存在明显的弊端，如通量低、时间和人力成本高等。例如一种使用hplc检测柚皮素的方法中(参见wuj,dug,zhouj,etal.metabolicengineeringofescherichiacolifor(2s)-pinocembrinproductionfromglucosebyamodularmetabolicstrategy.[j].metabolicengineering,2013,16(1):48-55)，使用色谱纯级别的乙腈-水作为流动相检测柚皮素，样品需要先使用0.22μm过滤预处理，每次仅能检测一个样品，每测一个样品需要运行时间17min。

在进行产柚皮素菌株的途径改造时，尤其是随机突变时，会产生数千到数亿甚至更多的突变子，仅仅依靠液相检测等手段是难以实现的。而且，在微生物发酵生产柚皮素时，会有中间产物对香豆酸产生，因此对香豆酸的存在，也可能影响到相应产物的检测。因此，提供一种快速准确的高通量检测柚皮素的方法，对于快速检测柚皮素含量和筛选柚皮素高产菌株具有重要意义。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明使用氢氧化钾或者氢氧化钠作为显色剂，可以和水溶液、无色合成培养基或者对应的发酵液中的柚皮素发生反应，在5min内出现明显的显色反应，根据颜色变化可以快速筛选柚皮素高产菌株。

本发明的第一个目的是提供一种高通量检测柚皮素的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)向含柚皮素的待测液中添加显色剂氢氧化钾或者氢氧化钠进行显色反应，得到反应液；

(2)用酶标仪检测反应液中柚皮素的浓度；所述显色反应和酶标仪检测均是在高通量孔板上进行的。

在本发明的一种实施方式中，所述高通量孔板包含96深孔板、96浅孔板、48深孔板、24深孔板、12深孔板。

在本发明的一种实施方式中，所述含柚皮素的待测液包括的水溶液、无色的合成培养基或菌株发酵液。

在本发明的一种实施方式中，所述含柚皮素的无色的合成培养基包括但不限于sd，ynb，mops培养基。

在本发明的一种实施方式中，显色剂浓度为0.1-10m之间。

在本发明的一种实施方式中，检测体系中显色剂终浓度在0.05-9m之间。

在本发明的一种实施方式中，使用酶标仪检测反应液中柚皮素的浓度时，所用吸光值的波长范围为400-500nm之间。

在本发明的一种实施方式中，所用吸光值的波长优选410-430nm。

本发明的第二个目的是提供一种高通量筛选柚皮素高产菌株的方法，所述方法是将改造后的待筛选菌株进行发酵后，静置沉淀菌体或者离心获得发酵上清液，添加显色剂氢氧化钾或者氢氧化钠进行显色反应，得到反应液；用目视法或者酶标仪检测反应液中柚皮素的浓度。

在本发明的一种实施方式中，所述改造途径包括物理诱变、化学诱变或代谢工程改造。

本发明的第三个目的是提供应用上述的一种高通量筛选柚皮素高产菌株的方法筛选得到的柚皮素高产菌株。

本发明发现了氢氧化钾和氢氧化钠可以作为显色剂，在5min内快速检测水溶液或者发酵液中柚皮素的浓度。柚皮素浓度越高，黄色越深，显色越快。并且在常见干扰物对香豆酸存在时，依然具有较高的准确度，并可以使用酶标仪进行更为精确的检测。本发明使用的显色剂易于获得和制作，并且可以通过颜色变化的快慢和深浅来快速确定产物的浓度，也可以通过酶标仪进一步检测和确认。在微生物中进行改造或者突变时，可以批量处理发酵液，单次处理一块加入了96个菌株发酵液的高通量96孔板只需30-60s，一个小时即可以处理5000-10000个单菌落，大大提高了筛选效率。

附图说明

图1：在不同浓度对香豆酸存在的情况下，不同浓度的柚皮素在不同介质中，使用4m的氢氧化钾或者氢氧化钠处理后的反应液的颜色变化；第一列仅存在对香豆酸，第一行仅存在柚皮素；图中，nar：柚皮素，cou：对香豆酸；a：在ynb中用4m的naoh溶液处理后的情况；b：在水溶液中用4m的naoh溶液处理后的情况；c：在ynb中用4m的koh溶液处理后的情况；d:在水溶液中用4m的koh溶液处理后的情况。

图2：在不同反应体系中，全波长扫描吸光值变化，a：在ynb中，使用4m的koh溶液处理；b：在水溶液中，使用4m的koh溶液处理；c：在ynb中，使用4m的naoh溶液处理；d：在水溶液中，使用4m的naoh溶液处理。

图3：在ynb培养基中，使用氢氧化钠处理后的反应液，在不同浓度对香豆酸存在下，柚皮素在不同波长下的吸光值，a：410nm；b：420nm；c：430nm；d:440nm；e:450nm。

图4：在水溶液中，使用氢氧化钠处理后的反应液，在不同浓度对香豆酸存在下，柚皮素在不同波长下的吸光值，a：410nm；b：420nm；c：430nm；d:440nm；e:450nm。

图5：在ynb培养基中，使用氢氧化钾处理后的反应液，在不同浓度对香豆酸存在下，柚皮素在不同波长下的吸光值，a：410nm；b：420nm；c：430nm；d:440nm；e:450nm；f：460nm。

图6：在水溶液中，使用氢氧化钾处理后的反应液，在不同浓度对香豆酸存在下，柚皮素在410nm波长下的吸光值。

图7：在水溶液中，使用氢氧化钾处理后的反应液，在不同浓度对香豆酸存在下，柚皮素在420nm波长下的吸光值。

图8：在水溶液中，使用氢氧化钾处理后的反应液，在不同浓度对香豆酸存在下，柚皮素在430nm波长下的吸光值。

具体实施方式

(一)培养基

ynb培养基：1.72g/l的ynb培养基(yeastnitrogenbase，酵母氮源培养基，无氨基酸和硫酸铵)，5g/l的硫酸铵，根据需要添加50mg/l的氨基酸。

(二)高效液相色谱检测柚皮素含量

安捷伦1100，流动相：45％甲醇水溶液，添加0.3％的磷酸，混匀后有机膜过滤。

方法：流动相1ml/min，柱温30℃，检测波长290nm，体积10μl。样品运行时间30min。

实施例1

1高通量显色反应

配置对香豆酸、柚皮素母液，溶解在100％乙醇溶液中，配置成4g/l的标准液，然后配置不同浓度对香豆酸和柚皮素混合液，分别使用水或者ynb培养基稀释和溶解，并定容到100μl，然后分别添加100μl的4m的氢氧化钠溶液和4m的氢氧化钾溶液。常温反应5min后观察颜色反应并拍照。反应后的颜色变化如图1所示，柚皮素浓度越高，黄色越深，显色越快，即便在对香豆酸干扰的情况下，柚皮素的浓度依然颜色呈正相关。

2反应液全波长扫描

选取被4m氢氧化钾溶液和4m氢氧化钠溶液处理过的反应液。选取对香豆酸终浓度为50mg/l，柚皮素终浓度为50mg/l，对香豆酸-柚皮素终浓度各50mg/l的96孔板位置，放在酶标仪中做全波长扫描，扫描范围为230-998nm，步长为2nm。全波长扫描后，绘制扫描结果，超出吸光值检测上限值4的，一律标记为4。根据全波长扫描结果寻找干扰物对检测物质干扰最小的波长范围。可以发现，柚皮素经过氢氧化钠或者氢氧化钾处理后，检测波长为400-500nm之间，效果较好。在同等浓度下，经koh溶液处理后对香豆酸的干扰更小，吸光值更高。全波长扫面结果见图2。

3检测波长区间的选择

上述反应液的检测区间确定后，为了更方便使用酶标仪对反应液中浓度进行定性检测，对已经确定的检测波长进一步检测，以确定干扰物存在时，与待检测物质实际浓度更符合的检测波长。在不同介质中，使用氢氧化钾或氢氧化钠处理后的反应液，在不同对香豆酸存在下，柚皮素在不同波长下的吸光值结果如图3-8所示。结果表明，用氢氧化钾处理后，对香豆酸的存在对吸光值的影响更小，结果更准确。我们选择使用4m氢氧化钾溶液等体积处理待测物质，使用410-430nm检测吸光值，柚皮素检测浓度为0-50mg/l。

实施例2

酿酒酵母c800(cenpk2-1d，δgal80::g418)用于发酵和构建质粒。大肠杆菌jm109用于质粒保存和扩增。py26-pgal7-4cl-pgal1，10-chi-chs为穿梭质粒，作为对照质粒和出发质粒，在酵母中筛选标记为尿嘧啶，可以同时在酿酒酵母和大肠杆菌中扩增复制，其中4cl(4-香豆酰辅酶a连接酶，4-coumarate:coaligase)基因由启动子gal7起始转录，chs(查尔酮合酶，chalconesynthase)基因由启动子gal10起始转录。chi(查尔酮异构酶，chalconeisomerase)基因由启动子gal1起始转录。三个基因可以催化对香豆酸合成柚皮素。

1质粒构建及高通量检测流程

选取酿酒酵母不同强度的启动子30个，平均分成abc三组，每组中有高中低三挡启动子各10个。a组启动子用于启动4cl基因，b组启动子用于启动chs基因，c组启动子用于启动chi基因，可以实现对应基因(4cl基因、chs基因和chi基因)的不同强度表达，产生1000种组合(10×10×10)。

将启动子、基因、质粒用引物扩增，启动子、基因和质粒两两之间存在约35bp的同源区，然后同时转化进酿酒酵母c800中，在酿酒酵母中，这些片段将会自行发生同源重组，可以形成1000种组合。然后将转化的酵母涂布在选择性平板ynb中，在培养基中不添加尿嘧啶，可以使得重组成功的菌体生长成单菌落，即为重组单菌落，而未能发生同源重组的质粒无法生长。

初筛时，将未添加尿嘧啶的ynb培养基按每孔1.5ml分装在48深孔板中，培养基中含有500mg/l的对香豆酸。挑取上述转化成功的3000-4000个单菌落接种在深孔板中并在ynb平板上点板留种，30℃，220rpm培养48h，静置2h，使菌体完全沉淀，使用排枪吸取上清液100μl于98浅孔板中，然后使用排枪添加100μl的4mkoh溶液，静置约5min后，根据颜色深浅，标记产量相对较高的前10株菌编号，在保留的平板上选取对应的菌株，进行下一轮复筛。也可以将反应后的96浅孔板置于430nm处检测吸光值，标记吸光值相对较高的前10个孔，相应平板上的单菌落进入下一轮复筛。

使用此方法一次从3000-4000个重组单菌落中选取约10个高产单菌落进入复筛。将上述筛选过程重复两次，从约10000个单菌落(10×组合库)中复筛获得的约30个重组单菌落进入复筛。

复筛时，接种初筛获得的30个重组单菌落于加有10mlynb的250ml的摇瓶，30℃，220rpm，培养14-16h至对数中后期，此时菌落od600在6-8之间。以2％(v/v)转接到20ml的ypd中于250ml的摇瓶中，同时添加终浓度500mg/的对香豆酸，30℃，220rpm培养至12h后再添加终浓度500mg/l的对香豆酸。培养72h后取样，使用高效液相色谱法检测柚皮素产量。最终复筛获得10株产量最高的菌株。

2高通量检测结果

经过初筛和复筛最终从10000个单菌落(10×组合库)中获得1株产量最高的菌落，提取质粒，测序，获得最佳启动子组合。

最佳的生产柚皮素的启动子组合为py26-paro7-4cl-pgal10-chs-pald5-chi。其中4cl基因由启动子aro7起始转录，chs基因由启动子gal10起始转录，chi基因由启动子ald5起始转录。出发质粒在摇瓶中柚皮素产量为90mg/l，而通过高通量获得的最佳质粒在相同条件下柚皮素产量为337mg/l，产量提高了2.74倍。

以上结果表明此方法检测发酵液中柚皮素的浓度，具有通量高，速度快，准确性高，操作简单便捷的特点。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。