一种液质联用测定人血浆中尼美舒利浓度的方法与流程

本发明属于医药检测
技术领域：
，特别涉及一种检测人血浆中尼美舒利浓度的方法。
背景技术：
：尼美舒利(n-(4-nitro-2-phenoxyphenyl)methanesulfonamide)是一种非甾体类抗炎药，具有抗炎、解热、阵痛等药理作用。尼美舒利是选择性环氧化酶-2(cox-2)抑制剂(马锦芳，陈飞鹏，黄文杰等，盐酸头孢他美酯单药或联合头孢曲松序贯治疗下呼吸道感染的临床研究.中国实用内科杂志，2008，28(8):644.)，与其他非甾体抗炎药相比，尼美舒利作用时间较长，生物利用度高，具有良好的耐受性(c.giachetti,a.tenconi,determinationofnimesulideandhydroxynimesulideinhumanplasmabyhighperformanceliquidchromatography,biomed.chromatogr.12(1998)50–56.)。适用于类风湿性关节炎和骨关节炎、手术和畸形创伤后的疼痛和炎症、耳鼻咽部炎症引起的疼痛、痛经、上呼吸道感染引起的发热等症状的治疗。目前，人血浆中尼美舒利作为内源性物质，能否准确定量是检测的难点。本发明建立了一种科学、快速和准确的液质联用测定人血浆中尼美舒利浓度的方法，可用于尼美舒利相关制剂的生物等效性评价等相关研究。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种可以准确定量、简便和快速测定患者血浆样品中尼美舒利浓度的方法。本发明的技术方案如下：一种液质联用测定人血浆中尼美舒利浓度的方法，该方法包括：(1)工作曲线样品的制备：包括内标溶液的配制、标准系列溶液的配制、工作曲线样品的前处理，其中，内标溶液的配制为称取适量的甲苯磺丁脲标准品，经质量校正因子校正后，将其溶于dmso中，得到储备液,再用乙腈将储备液稀释成为240ng/ml的内标工作液；标准系列溶液的配制为称取适量的尼美舒利标准品，经质量校正因子校正后，将其溶于dmso中，得到储备液，再用50％乙腈水溶液稀释成为不同浓度的系列标准曲线工作液；工作曲线样品的前处理为向190μl空白血浆中分别加入10.0μl的本步骤上述系列标准曲线工作液，配制成相当于尼美舒利在血浆基质中的浓度为1.00、2.00、20.0、200、400、1000、1800和2000ng/ml的标准血浆样品，然后每个浓度以50.0μl为单位，分装出2份；每份加入350μl的内标工作液进行蛋白沉淀，离心后取60.0μl上清液，加入240μl的20％乙腈水溶液，震荡离心后，供lc-ms/ms测定。(2)质控样品的制备：包括质控系列溶液的配制、质控样品的前处理，其中，质控系列溶液的配制为称取适量的尼美舒利标准品，经质量校正因子校正后，将其溶于dmso中，得到储备液，再用50％乙腈水溶液稀释成为高浓度质控工作液、中浓度质控工作液、算数中浓度质控工作液、低浓度质控工作液和定量下限质控工作液的系列质控工作液；质控样品的前处理为向380μl空白血浆中分别加入20.0μl的上述系列用于质控样品配制的系列质控工作溶液，配制相当于尼美舒利在血浆基质中的浓度为1600ng/ml的高浓度质控、800ng/ml的中浓度质控、100ng/ml的算数中浓度质控、3.00ng/ml的低浓度质控和1.00ng/ml的定量下限质控的质控血浆样品，然后每个浓度以50.0μl为单位，分装出6份；每份加入350μl的内标工作液进行蛋白沉淀，离心后取60.0μl上清液，加入240μl的20％乙腈水溶液，震荡离心后，供lc-ms/ms测定。(3)血浆样品的前处理：取受试者的血浆加入内标工作液进行蛋白沉淀，离心后取上清液，加入20％乙腈水溶液，震荡离心后，供lc-ms/ms测定。(4)采用内标法定量，对人血浆中尼美舒利的浓度进行测定。优选的，所述步骤(1)的标准系列溶液的配制中，用50％乙腈水溶液稀释储备液得到的不同浓度的系列标准曲线工作液，其浓度分别为20.0、40.0、400、4000、8000、20000、36000和40000ng/ml。优选的，所述步骤(2)的质控系列溶液的配制中，高浓度质控工作液浓度为32000ng/ml、中浓度质控工作液浓度为16000ng/ml、算数中浓度质控工作液浓度为2000ng/ml、低浓度质控工作液浓度为60.0ng/ml和定量下限质控工作液浓度为20.0ng/ml。优选的，所述步骤(3)具体为：取受试者的血浆50.0μl，每份加入350μl内标工作液进行蛋白沉淀，离心后取60.0μl上清液，加入240μl的20％乙腈水溶液，震荡离心后，供lc-ms/ms测定。优选的，所述步骤(4)中，采用内标法，以系列尼美舒利在血浆基质中的浓度为横坐标，尼美舒利与内标甲苯磺丁脲的峰面积比为纵坐标，进行线性回归运算，权重因子为1/x2，得到线性回归方程，即为工作曲线，对人血浆中尼美舒利的浓度进行测定。优选的，所述lc-ms/ms测定的条件包括：液相色谱条件：色谱柱：acquityuplcbehc181.7μm(50x2.1mm)；流动相：a＝0.1％甲酸水溶液；b＝乙腈溶液，梯度如下：0-0.80min，流动相a为75.0％，流动相b为25.0％；0.80-0.90min，流动相a从75.0％到40％，流动相b从25.0％到60.0％；0.90-2.00min，流动相a保持为40.0％，流动相b保持为60.0％；2.00-2.10min，流动相a从40.0％到10.0％，流动相b从60.0％到90.0％；2.10-2.80min，流动相a保持为10.0％，流动相b保持为90.0％；2.80-3.00min，流动相a从10.0％到75.0％，流动相b从90.0％到25.0％；3.00-3.80min，流动相a保持为75.0％，流动相b保持为25.0％；流速：0.500ml/min；柱温：40℃；进样量：10.0μl。质谱检测器及条件：质谱检测器为absciextriplequad5500；离子源为电喷雾离子源；喷雾电压为-4500v；离子源温度：450℃；帘气(cur)：20psi，碰撞气(cad)：9psi，gs1：40psi，gs2：40psi；负离子方式检测；扫描方式：mrm；尼美舒利定量离子对为307.0→229.1，碰撞电压为-22.0ev；内标甲苯磺丁脲定量离子对为269.1→169.9，碰撞电压为-15.0ev。本发明的有益效果：本发明利用液质联用测定血浆样品中尼美舒利的浓度，该方法具有快速、专属、准确的特点。本发明的方法无需昂贵的设备和试剂，血浆用量少，成本低，适合常规治疗药物检测。附图说明图1为空白替代基质色谱图；图1a为分析物尼美舒利离子通道色谱图；图1b为内标甲苯磺丁脲离子通道色谱图；图2为标准曲线定量下限色谱图；图2a为分析物尼美舒利(1.00ng/ml)在空白血浆中色谱图；图2b为内标甲苯磺丁脲(240ng/ml)在空白血浆中色谱图；图3为标准曲线定量上限色谱图；图3a为分析物尼美舒利(2000ng/ml)在空白血浆中色谱图；图3b为内标甲苯磺丁脲(240ng/ml)在空白血浆中色谱图；图4为质控lloq浓度色谱图；图4a为分析物尼美舒利(1.00ng/ml)在空白血浆中色谱图；图4b为内标甲苯磺丁脲(240ng/ml)在空白血浆中色谱图图5为质控lqc浓度色谱图；图5a为分析物尼美舒利(3.00ng/ml)在空白血浆中色谱图；图5b为内标甲苯磺丁脲(240ng/ml)在空白血浆中色谱图；图6为质控gmqc浓度色谱图；图6a为分析物尼美舒利(100ng/ml)在空白血浆中色谱图；图6b为内标甲苯磺丁脲(240ng/ml)在空白血浆中色谱图；图7为质控mqc浓度色谱图；图7a为分析物尼美舒利(800ng/ml)在空白血浆中色谱图；图7b为内标甲苯磺丁脲(240ng/ml)在空白血浆中色谱图；图8为质控hqc浓度色谱图；图8a为分析物尼美舒利(1600ng/ml)在空白血浆中色谱图；图8b为内标甲苯磺丁脲(240ng/ml)在空白血浆中色谱图；图9为未知样品分析色谱图；图9a为分析物尼美舒利未知样品血浆浓度色谱图；图9b为内标甲苯磺丁脲(240ng/ml)在未知样品血浆中色谱图。具体实施方式下面结合具体实施例并结合附图对本发明进一步阐述，但不限制本发明。1：检测方法的确定1.1实验仪器和试剂仪器：主要仪器设备及系统，见下表1：表1.主要仪器设备及系统试剂：原始试剂：超纯水(milli-q纯化系统自制)；甲酸，lc/ms，fisherscientific，批号：190284；甲醇，色谱纯，fisherchemical，批号：190894；乙腈，色谱纯，fisherchemical，批号：186341；dmso，cellculturegrade，solarbio，批号：1129e035。标准品：尼美舒利，批号：100555-201803，纯度：hplc纯度：100％；厂家：中国食品药品检定研究院；过期日期：至下批次发布；校正因子：1.00，游离态分子量：308.31，避光，密闭，10-30℃条件下保存。甲苯磺丁脲(tolbutamide)，批号：bcbv8457；纯度：hplc纯度：99.85％；厂家：sigma-aldrich；过期日期：2022年8月；校正因子：0.9985，游离态分子量：270.35，密闭，避光，10～30℃条件下保存。试剂配制：内标储备液配制：精密称取适量的甲苯磺丁脲标准品，经质量校正因子校正后，将其溶于dmso中，得到最终浓度为0.500mg/ml的储备液；标准品储备液：精密称取适量的尼美舒利标准品，经质量校正因子校正后，将其溶于dmso中，得到最终浓度为2.00mg/ml的储备液；内标工作液的配制：取适量内标储备液母液，用乙腈稀释成为240ng/ml的内标工作液；标准曲线工作液的配制：取适量标准品储备液母液，用50％乙腈水溶液稀释成为20.0、40.0、400、4000、8000、20000、36000和40000ng/ml的系列标准曲线工作液；质控工作液的配制：取适量标准品储备液母液，再用50％乙腈水溶液稀释成为32000ng/ml(高浓度质控工作液)、16000ng/ml(中浓度质控工作液)、2000ng/ml(算数中浓度质控工作液)、60.0ng/ml(低浓度质控工作液)和20.0ng/ml(定量下限质控工作液)的系列质控工作液。基质：空白血浆基质：来源合法的用肝素钠作抗凝剂的人(健康志愿者)空白血浆装于聚丙烯离心管中并冷冻在-75±15℃条件下冰箱内，自采集之日起2年内使用；实际血浆样品：用edta-k2作抗凝剂的5名患者的血浆由北京医院临床试验研究中心生物分析实验室提供，装于聚丙烯离心管中并冷冻在-75±15℃冰箱内。1.2血浆样品分析方法血浆样品前处理：取受试者的血浆50.0μl，每份加入350μl内标工作液进行蛋白沉淀，离心后取60.0μl上清液，加入240μl的20％乙腈水溶液，震荡离心后，供lc-ms/ms测定。1.2.1液相条件色谱柱：acquityuplcbehc181.7μm(50x2.1mm)；流动相：a＝0.1％甲酸水溶液；b＝乙腈溶液，梯度洗脱见表2；柱温：40℃；自动进样器温度：15℃；进样量：10.0μl。表2.液相梯度洗脱程序1.2.2质谱条件质谱检测器为absciextriplequad5500；离子源为电喷雾离子源；喷雾电压为-4500v；离子源温度：450℃；帘气(cur)：20psi，碰撞气(cad)：9psi，gs1：40psi，gs2：40psi；负离子方式检测；扫描方式：mrm。具体参数见表3：表3.采用mrm的模式采集，主要质谱参数2：方法学验证实验方法的线性：取适量标准品储备液母液，用50％乙腈水溶液稀释成为20.0、40.0、400、4000、8000、20000、36000和40000ng/ml的系列标准曲线工作液；向190μl空白血浆中分别加入10.0μl的上述系列用于标准曲线配制的工作溶液，配制成相当于尼美舒利在血浆基质中的浓度为1.00、2.00、20.0、200、400、1000、1800和2000ng/ml的标准血浆样品，然后每个浓度以50.0μl为单位，分装出2份；每份加入350μl的内标工作液进行蛋白沉淀，离心后取60.0μl上清液，加入240μl的20％乙腈水溶液，震荡离心后，供lc-ms/ms测定。取10.0μl进行lc-ms/ms分析，记录色谱图；以系列尼美舒利在血浆基质中的浓度为横坐标，尼美舒利与内标的峰面积比为纵坐标，进行线性回归运算，权重因子为1/x2，得到线性回归方程，即为工作曲线。血浆基质中尼美舒利的工作曲线，线性范围为1.00–2000ng/ml，典型的工作曲线为y＝0.001562x-0.000059，相关系数均大于0.9970，满足定量检测要求。方法的准确度和精密度：取适量标准品储备液母液，用50％乙腈水溶液稀释成为32000ng/ml(高浓度质控工作液)、16000ng/ml(中浓度质控工作液)、2000ng/ml(算数中浓度质控工作液)、60.0ng/ml(低浓度质控工作液)和20.0ng/ml(定量下限质控工作液)的系列质控工作液；向380μl空白血浆中分别加入20.0μl的上述系列用于质控样品配制的系列质控工作溶液，配制相当于尼美舒利在血浆基质中的浓度为1600ng/ml(高浓度质控)、800ng/ml(中浓度质控)、100ng/ml(算数中浓度质控)、3.00ng/ml(低浓度质控)和1.00ng/ml(定量下限质控)的质控血浆样品，然后每个浓度以50.0μl为单位，分装出6份；每份加入350μl的内标工作液进行蛋白沉淀，离心后取60.0μl上清液，加入240μl的20％乙腈水溶液，震荡离心后，供lc-ms/ms测定。批内精密度与准确度考察通过分析一个批次内5个浓度水平的质控样品(lloq、lqc、gmqc、mqc和hqc，n＝6)来测定。批间精密度与准确度考察通过至少两天内至少3个批次的5个浓度水平(lloq、lqc、gmqc、mqc和hqc，n＝6)来测定。测定结果见表4，从表4中结果可以看出lc-ms/ms测定血浆中尼美舒利浓度的方法批内相对标准偏差为-8.30％～-0.38％之间，批间相对标准偏差为-7.80％～-3.63％之间，满足人血浆中尼美舒利分析测定的要求。说明该方法的准确度和精密度较好，充分验证所建立方法的可操作性。表4.批内、批间精密度与准确度结果方法的基质效应：使用6个不同个体的空白基质来评价基质效应，每个个体低(尼美舒利：3.00ng/ml)、高(尼美舒利：1600ng/ml)质控浓度水平各一份分别进行考察。对于待测物和内标，每批基质的基质因子(mf)，应通过有基质存在(空白基质经提取后加入待测物)与无基质存在(待测物的纯溶液)时峰面积的比例来进行计算。内标的归一化mf应通过待测物的mf除以内标的mf来计算。基质因子(mf)＝有生物基质的单独个体峰面积/无生物基质的峰面积的平均值。内标归一化基质因子(is-mf)＝待测物mf/内标mf正常基质的基质效应的接受标准：低、高两个质控浓度，6个不同个体的内标归一化mf变异系数皆不大于15％；6个不同个体的低、高两个浓度水平内标归一化mf总变异系数不大于15％。结果见表5：表5.基质效应结果方法的回收率：考察三个浓度水平的回收率，低浓度质控(3.00ng/ml)、几何中浓度质控(100ng/ml)和高浓度质控(1600ng/ml)。每个浓度平行6个重复，用提取的样品与未提取的样品(代表回收率100％)的分析结果进行比较。需计算每个浓度水平的提取回收率和总的回收率，同时计算同一个浓度水平内标的提取回收率。待测物回收率(％)：经提取样品峰面积均值/未经提取样品峰面积均值*100内标回收率(％)：经提取样品峰面积均值/未经提取样品峰面积均值*100提取回收率的接受标准：低、几何中、高三个浓度水平的回收率的变异系数应≤15％，且总的回收率的变异系数应≤15％；内标的回收率的变异系数≤15％。结果见表6和表7：表6.尼美舒利回收率结果表7.内标甲苯磺丁脲回收率结果从表5-表7可以看出，回收率和基质效应的考察均符合接受标准，表明质谱和色谱条件有效的避免了基质效应，满足人血浆中尼美舒利分析测定的要求，充分验证所建立方法的可操作性。方法学验证中线性、准确度和精密度、选择性、残留、回收率和基质效应、稳定性的考察均符合要求。3：实际样品的测定选取5名受试者的血浆，进行血浆中尼美舒利浓度的测定。按照“1.2项下血浆样品前处理”方式处理血浆样品，按照实施例1这中的液相条件和质谱条件进行液质分析，分析批包含两条标准曲线，至少需3个浓度水平质控样品(hqc，gmqc和lqc)，每个浓度至少2个重复，且数量不少于每个分析批中样品总量的5％。根据标准曲线计算质控样品和未知样品的浓度。上述标准曲线样品标准样品准确度偏差不超过±15％，标准样品定量下限准确度偏差不超过±20％，不符合接受标准的标准曲线样品不参与标准曲线回归，标准曲线样品的剔除应从偏差最大的开始，然后再次进行回归，再剔除不符合接受标准的偏差最大的标准曲线样品，如此依次剔除不符合接受标准的标准样品，直至所有参与标曲回归的样品皆满足准确度偏差的接受标准，参与标曲回归的样品不低于75％的非零标准样品且每个浓度至少50％的标准样品满足接受标准或者标准曲线失败(多于25％的非零点被去除)；线性回归的决定系数(r2)应不低于0.9801。上述质控样品至少67％的质控样品且每个浓度水平至少50％的质控样品的准确度偏差不超过±15％；所有接受的分析批每个浓度质控样品的平均准确度偏差不超过±15％，精密度应在15％以内。测定结果见表8。表8.5名受试者血浆中尼美舒利的测定结果受试者编号测定浓度(ng/ml)13.35233.3370.642715808上述液质联用定量人血浆中尼美舒利的线性范围为1.00-2000ng/ml，定量下限为1.00ng/ml，在1.00-2000ng/ml范围内线性关系良好。准确度和精密度、回收率和基质效应等方法学验证考察均符合要求，满足人血浆中尼美舒利浓度检测的要求。综上所述，本发明的液质联用定量检测人血浆中尼美舒利浓度的方法能准确、快速、可靠的检测血样中尼美舒利的浓度。以上所述仅是本发明的实施方式举例，应当指出，对于本
技术领域：
，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型应视为本发明的保护范围。当前第1页12