一种灵敏度高、检测范围广的荧光免疫层析试纸的制作方法

本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及一种灵敏度高、检测范围广的荧光免疫层析试纸。

背景技术：

检测的灵敏度及检测范围受抗体对组合的反应性、标记物的种类等因素的影响。反应性好的抗体往往灵敏度高，但对于高浓度的样本往往由于胡克效应的存在检测性能不佳；反应性慢的抗体对于低浓度样本的检测性能不佳，但对于高浓度样本检测性能良好；对于荧光标记物的选择，标记物的荧光效率越高，检测的灵敏度越高。

针对于荧光标记物，荧光微球由于将多个荧光分子集成到一个微球中，大大提高了荧光效率，对于高灵敏度的检测具有不可比拟的优势，但是标记物体积的增大会提早胡可效应的节点，从而导致不能准确测定高浓度样本，缩短方法的检测范围。

小体积的荧光分子或微球，相对于荧光微球，荧光效率较低，对于低浓度标志物的检测不具备优势，但是能够延后免疫反应胡克效应的节点，对于测定高浓度标志物优势明显。

技术实现要素：

针对现阶段荧光免疫层析试纸存在的问题，本发明通过使用两对标志物的不同反应性的抗体对，利用铕时间分辨荧光微球、量子点微球（em：615nm）分别作为检测标记物。综合各种材料的检测性能，提供了一种灵敏度高、检测范围广的荧光免疫层析试纸。

一种灵敏度高、检测范围广的荧光免疫层析试纸，包括样品垫、结合垫1、结合垫2、检测线1、检测线2、质控线、硝酸纤维膜；

所述的结合垫1包被抗体1修饰的铕时间分辨荧光微球；所述的结合垫2包被抗体2修饰的量子点微球；所述的检测线1包被捕获抗体1，与结合垫1配合；所述的检测线2包被捕获抗体2，与结合垫2配合；所述的抗体1、抗体2组合之间无交叉反应出现。

所述的样品垫在前，后面依次为：结合垫1、结合垫2、检测线1、检测线2、质控线。

上述荧光免疫层析试纸，还包括底板及吸水纸。

上述荧光免疫层析试纸中，所述的样品垫搭接于结合垫1一端上表面，结合垫1搭接于结合垫2一端上表面，结合垫2搭接于硝酸纤维素膜的一端上表面，吸水纸搭接于硝酸纤维素膜的另一端上表面，结合垫2端部与吸水纸端部之间外露的硝酸纤维素膜上，包被有与底板端面平行的检测线1、检测线2和质控线。

所述的样品垫为玻璃纤维、聚酯纤维、滤血膜等材料；结合垫1、2为玻璃纤维、聚酯纤维等材料。

上述荧光免疫层析试纸在检测降钙素原pct上的应用。

铕时间分辨荧光微球、量子点微球（em：615nm）都具有激发光谱宽的特点，作为标记物时可以使用同样的检测条件进行荧光定量检测。利用两种标记物制作的荧光免疫层析试纸的检测线信号可以用同一荧光读数仪一次测定。

本发明利用铕时间分辨荧光微球（200nm、500nm等）、量子点微球（ex：615，10nm）分别作为检测标记物。通过设置两个检测线，同时保证检测的范围及灵敏度。提供了一种可提高灵敏度、拓宽定量检测范围的荧光免疫层析试纸条制备方法。

附图说明

图1为本发明的荧光免疫层析试纸的结构示意图；

图2为实施例1不同降钙素原pct浓度的荧光强度分析图；

图3为实施例2白介素6il-6浓度的荧光强度分析图；

图4为实施例3不同标志物进行白介素6的浓度检测的结果图。

本发明的有益效果

1、检测范围广

采用本发明的荧光免疫层析试纸检测降钙素原pct，其检测范围可以达到0.02-500ng/ml。采用本发明的荧光免疫层析试纸检测白介素6il-6，其检测范围为5-10000ng/ml。

2、检测灵敏度高

利用不同标记物特性，以及不同抗体对组合的反应性，提高了不同浓度抗原的检测能力。低浓度灵敏度极大提升，高浓度检测范围极大拓展。

3、检测速度快，适用性广

本发明的荧光免疫层析试纸可以根据样品垫成分及检测限成分的选择，达到制定不同规格的试纸用于不同的领域。

具体实施方式

实施例1降钙素原pct的检测

一种灵敏度高、检测范围广的荧光免疫层析试纸，包括样品垫、结合垫1、结合垫2、检测线1、检测线2、质控线；还包括底板及吸水纸。所述的样品垫搭接于结合垫1一端上表面，结合垫1搭接于结合垫2一端上表面，结合垫2搭接于硝酸纤维素膜的一端上表面，吸水纸搭接于硝酸纤维素膜的另一端上表面，结合垫2端部与吸水纸端部之间外露的硝酸纤维素膜上，包被有与底板端面平行的检测线1、检测线2和质控线。见图1。

样品垫为玻璃纤维；结合垫1、2为玻璃纤维。

结合垫1储存pct小鼠单克隆抗体p1修饰的200nm铕时间分辨荧光微球；

结合垫2储存pct小鼠单克隆抗体p2修饰的量子点；

检测线t1划pct小鼠单克隆抗体p3；

检测线t2划pct小鼠单克隆抗体p4；

p1，p2，p3，p4为4种不同的pct小鼠单克隆抗体；

p1-p3为检测pct抗体对组合，检测灵敏度高，反应快；p2-p4为检测pct抗体对组合，反应较慢；

质控线c划羊抗鼠多抗。

取全血50μl或者血清/血浆30μl，滴加到样品垫上，

利用不同标记物特性，以及不同抗体对组合的反应性，提高了不同浓度pct的检测能力。低浓度灵敏度极大提升，高浓度检测范围极大拓展。

t1检测线检测范围0.02-50ng/ml，线性相关系数r1²=0.9988；t2检测线检测范围10-500ng/ml，线性相关系数r2²=0.9991。该试纸条将pct检测范围拓展为0.02-500ng/ml。保证了试纸条的灵敏度、极大的拓宽了检测范围。

对比例1降钙素原pct的检测

以两株高特异性、高敏感性pct单克隆抗体和一株pct多克隆抗体，其中pct单克隆抗体i为荧光标记抗体，包被在荧光垫上，pct多克隆抗体和pct单克隆抗体ii为捕获抗体，包被在层析膜上检测区；层析膜上质控区包被有兔抗鼠igg，可以直接和荧光标记的单克隆抗体i结合。应用抗原抗体反应和荧光免疫层析技术，检测pct的含量。

将反应后的检测卡插入到getein1100荧光免疫定量分析仪中，仪器的测量系统自动对标记物和待测物结合区进行扫描，获得光学信号。然后对光学信号进行测量和分析处理，定量得出被测物质的浓度。

上述方法的检测范围为0.05-100ng/ml。

实施例2白介素6il-6的检测

一种灵敏度高、检测范围广的荧光免疫层析试纸，包括样品垫、结合垫1、结合垫2、检测线1、检测线2、质控线；还包括底板及吸水纸。所述的样品垫搭接于结合垫1一端上表面，结合垫1搭接于结合垫2一端上表面，结合垫2搭接于硝酸纤维素膜的一端上表面，吸水纸搭接于硝酸纤维素膜的另一端上表面，结合垫2端部与吸水纸端部之间外露的硝酸纤维素膜上，包被有与底板端面平行的检测线1、检测线2和质控线。见图1。

样品垫为聚酯纤维；结合垫1、2位聚酯纤维。

结合垫1储存il-6小鼠单克隆抗体p1修饰的500nm铕时间分辨荧光微球；

结合垫2储存il-6小鼠单克隆抗体p2修饰的量子点（em：615nm）；

检测线t1划il-6小鼠单克隆抗体p3；

检测线t2划il-6小鼠单克隆抗体p4；

p1，p2，p3，p4为4种不同的il-6小鼠单克隆抗体；

p1-p3为检测il-6抗体对组合，检测灵敏度高，反应快；p2-p4为检测il-6抗体对组合，反应相对较慢；

质控线c划羊抗鼠多抗。

利用不同标记物特性，以及不同抗体对组合的反应性，提高了不同浓度il-6的检测能力。

保证了低浓度检测灵敏度，高浓度检测范围极大拓展。

检测线t1检测范围5-200pg/ml，线性相关系数r1²=0.9981；检测线t2检测范围100-10000ng/ml，线性相关系数r2²=0.9993。该试纸条极大的拓宽了试纸条的灵敏度、检测范围。检测范围远优于市场同类产品5-4000ng/ml。

灵敏度实验

实施例3分别以不同标志物进行白介素6的检测

第一种方案：

样品垫1储存il-6小鼠单克隆抗体p1修饰的500nm铕时间分辨荧光微球；

样品垫2不作处理；

检测线t1划il-6小鼠单克隆抗体p3；

检测线t2不作处理；

p1，p3为2种不同的il-6小鼠单克隆抗体；

质控线c划羊抗鼠多抗。

第二种方案：

样品垫1储存il-6小鼠单克隆抗体p2修饰的量子点；

样品垫2不作处理；

检测线t1划il-6小鼠单克隆抗体p3；

检测线t2不作处理；

p1，p3为2种不同的il-6小鼠单克隆抗体；

质控线c划羊抗鼠多抗。

分别以两种方案进行il-6的测定。

方案1检测范围5-200pg/ml，线性相关系数r1²=0.9966；检测线t2检测范围12-200ng/ml，线性相关系数r2²=0.9987。说明使用荧光微球作为标志物时，方法的灵敏度会相应提高。