氨基末端脑利钠肽前体测定试剂盒、制备方法及检测方法与流程

本发明涉及体外诊断检测
技术领域：
，特别是涉及一种氨基末端脑利钠肽前体测定试剂盒、制备方法及检测方法。
背景技术：
：氨基末端脑利钠肽前体(nt-probnp)主要由心室细胞作为对心肌应力和充盈压的反应而释放，起到平衡血管内容量的作用。在心肌细胞受到刺激后，脑钠肽以激素原(probnp)的形态释放，之后在内切酶的作用下被切割为含有76个氨基酸的氨基末端脑利钠肽前体(nt-probnp)和含有32个氨基酸的c端多肽bnp。bnp因具有一个特征性的氨基酸环，具有重要的生物活性，但在体内的半衰期较短，仅有18-22分钟；而nt-probnp为直线形结构，无生物活性，在体内半衰期较长，约120分钟，且存在量不受体位及日常活动等因素的影响，含量稳定，因此nt-probnp更易于检测。因此，nt-probnp被认为是较好的能反应心脏功能的生化标志物，对心室压力增高状况，充血性心力衰竭及其引发的呼吸困难并发症，原发性高血压及其评价左心室功能障碍等心血管相关疾病的辅助诊断及治疗评估检测具有重要价值。当然，nt-probnp的检测结果仅供临床参考，不能单独作为诊断或排除病例的依据，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查，如超声心动图、左心射血分数等情况进行综合考虑。目前，氨基末端脑利钠肽前体的检测方法主要有放射免疫分析法、磁微粒化学发光免疫分析法、酶联免疫分析法、胶体金法、荧光免疫分析法等。然而目前的氨基末端脑利钠肽前体的检测方法均存在各种问题：放射免疫分析法采用同位素标记，对人体有极大危害并给实验带来不便；磁微粒化学发光免疫分析法，试剂稳定性较差，检测精密度不高，仪器故障率较高；酶联免疫分析法，由于酶本身不稳定，受其他因素影响较大，重复性较差；胶体金法，灵敏度较差，不能定量检测；荧光免疫分析法，也存在准确度低、精密度较差的问题。心肌梗死、心力衰竭是心内科常见的疾病和并发症，具有发病急、病情危重的特点，急早诊断可有效减低患者的死亡率，改善患者的预后。poct是利用便携式设备在短时间内得到检测结果的一种检测方式，具有检测快速、操作简单、可在床边操作等特点。poct平台可直接在患者身边检测全血标本中的心脏标志物，省去了样本传输和标本制备时间，同时无需排队，即采即测，大大缩短了样本检测时间，满足心内科患者心脏疾病快速鉴别诊断的需求。因此应用poct检测氨基末端脑利钠肽前体具有重要的临床价值。cn102103143公开了一种poct检测中的胶体金技术，通过试纸条上同时设置包被有n-端脑利钠肽前体多克隆抗体的检测线、包被有心肌肌钙蛋白i单克隆抗体的检测线和兔抗鼠igg抗体的控制线，能够同步检测两个指标，然而该方法只能进行定性检测，不能进行定量检测，不能为临床提供较多的检测信息。cn107389950公开了一种利用磁分离原理和吖啶酯化学发光方法制备的检测试剂盒，将磁珠-sa-生物素-nt-probnp单抗溶剂与nt-probnp结合后，再与吖啶酯-nt-probnp单抗溶剂发生结合反应，然而该方法基于化学发光平台，试剂稳定性较差，且需要使用化学发光仪进行分配、反应、清洗、激发等多个步骤，对仪器使用维护要求较高。cn104865387公开了一种快速定量检测nt-probnp的免疫荧光试纸条，该试纸条中样品垫片和检测膜之间设有偶合物垫片，偶合物垫片上涂布有荧光标记的nt-probnp抗体偶合物，检测时样本中的nt-probnp与偶合物垫片上的nt-probnp抗体偶合物发生免疫反应，形成免疫复合物，该复合物层析至检测线时，与包被其上的nt-probnp抗体反应而固定在检测线上。该方法易造成偶合物垫片单位面积上所涂布的荧光偶合物的活性不均一，而使试剂变异系数cv较高。因此，在poct检测nt-probnp领域，仍需开发一种检验准确度高、特异性强、重现性好、操作快捷的氨基末端脑利钠肽前体检测试剂盒。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种检验准确度高、特异性强、重现性好、操作快捷的氨基末端脑利钠肽前体检测试剂盒、制备方法及检测方法。为实现上述目的，本发明提供了一种氨基末端脑利钠肽前体检测试剂盒，采取以下技术方案：一种氨基末端脑利钠肽前体检测试剂盒，其特征在于，包括：试剂卡、反应物质及反应缓冲液。所述试剂卡包括壳体及试纸条，所述试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫及背衬板，所述硝酸纤维素膜贴在所述背衬板上，所述样品垫和所述吸水垫的一端分别搭接于所述硝酸纤维素膜的两端，所述硝酸纤维素膜上设有检测线与质控线，所述检测线与质控线相互平行，且质控线位于硝酸纤维素膜上靠近吸水垫的一端，所述检测线包被有氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体，所述质控线包被有羊抗鸡igy抗体、羊抗兔igg抗体或羊抗鼠igg抗体中的一种，所述壳体包括能相互扣合的上盖和下盖，所述上盖对应所述硝酸纤维素膜的位置设有显示窗，对应所述样品垫的位置设有加样孔。所述反应物质包括检测线荧光偶合物及质控线荧光偶合物；所述检测线荧光偶合物含有荧光微球标记的氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体，所述质控线荧光偶合物含有荧光微球标记的鸡igy抗体、兔igg抗体或鼠igg抗体中的一种。所述反应缓冲液包括缓冲液、表面活性剂、糖类、防腐剂及氯化钠。本发明人通过大量研究实验考察后发现，传统的荧光免疫方法将待测样本与荧光偶合物垫片上标记的氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体发生特异性免疫结合，形成荧光复合物，该荧光复合物经过测试带，荧光复合物中的抗原与测试带中包被的氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体发生特异性免疫结合，从而固定在测试带中，进行荧光强度检测。该传统荧光免疫方法将荧光偶合物包被在结合垫片上，荧光偶合物在喷洒后至烘干的过程中，因湿料无定向扩散，不能迅速地固定保持在玻璃纤维上，可导致结合垫单位面积上所含荧光偶合物的活性不均，造成检测待测样本中的氨基末端脑利钠肽前体含量准确度不高，精密度低。在上述研究发现的基础上，本发明对传统技术进行了改进，将含有荧光微球标记的氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体和荧光微球标记的鸡igy抗体、兔igg抗体或鼠igg抗体中的一种进行冻干得到反应物质，使用前采用反应缓冲液进行复溶，再加入待测样本，使待测样本中氨基末端脑利钠肽前体与荧光微球标记的氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体充分反应，提高了抗原-抗体结合率，从而提高了检测的准确度及精密度。进一步地，所述荧光微球为时间分辨荧光微球，所述时间分辨荧光微球包埋稀土离子，同时所述时间分辨荧光微球表面修饰有氨基、羧基或羟基中至少一种功能基团；所述稀土离子选自镧系元素中sm钐、eu铕、gd钆、tb铽、dy镝中的至少一种。进一步地，所述反应物质由检测线荧光偶合物及质控线荧光偶合物在冻干保护液的保护下经过冷冻干燥制成。进一步地，所述冻干保护液含有缓冲液、保护蛋白及糖类；所述缓冲液选自磷酸盐、硼酸盐或tris缓冲液中至少一种，浓度为10mm-50mm；所述保护蛋白选自牛血清白蛋白，卵清蛋白或酪蛋白中的至少一种，浓度为0.1％-3％；所述糖类选自海藻糖、蔗糖、乳糖中的至少一种，浓度为0.1％-10％。进一步地，所述反应缓冲液中，缓冲液选自磷酸盐、硼酸盐或tris缓冲液中的至少一种，浓度为10mm-50mm；所述表面活性剂选自曲拉通x-100、吐温20、s16、s9中的至少一种，浓度为0.1％-1％；所述糖类选自海藻糖、蔗糖、乳糖中的一种或几种，浓度为0.1％-10％；所述氯化钠的浓度为0.8-2％；所述防腐剂选自山梨酸、苯甲酸或proclin300中的至少一种，浓度为0.01％-0.1％。进一步地，所述氨基末端脑利钠肽前体测定试剂盒还包括id卡，所述id卡存储有产品的项目名称、批号及标准曲线数据。本发明还提供了一种氨基末端脑利钠肽前体测定试剂盒的制备方法，采取以下技术方案：所述试剂卡的制备方法包括：1)检测线及质控线的制备：分别配制氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体浓度为0.5-3mg/ml，羊抗鸡igy抗体、羊抗兔igg抗体或羊抗鼠igg抗体浓度为0.5-2mg/ml，用喷膜机划线至硝酸纤维素膜上检测线和质控线区域，包被量0.5-1.0μl/cm，烘干；2)样品垫的制备：配制封闭溶液，将封闭溶液加入至玻璃纤维上，使玻璃纤维完全湿润，烘干；3)试剂卡的组装：将硝酸纤维素膜黏贴至背衬板上，样品垫和吸水垫的一端分别搭接于硝酸纤维素膜的两端，切成特定宽度的试纸条，将试纸条放入壳体中固定位置，盖上盖，压卡。所述反应物质的制备方法，包括如下步骤：1)制备检测线荧光偶合物：a)将荧光微球置于离心管中，加入活化液，离心，去上清，沉淀物加入活化液，超声重悬；再清洗一次；b)荧光微球加入交联剂edc和sulfo-nhs，edc终浓度0.04％-0.2％，sulfo-nhs终浓度0.12％-0.6％，反应10-30min，离心，去上清，沉淀物加入偶联缓冲液，超声重悬；c)按0.1ml荧光微球加入30-100μg的氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体，室温旋转反应，离心，去上清，沉淀物加入封闭液，超声重悬，室温旋转反应；离心，去上清，沉淀物加入washingbuffer，清洗两次，去上清，沉淀物用复溶液超声重悬，得到检测线荧光偶合物；2)制备质控线荧光偶合物：a)将荧光微球置于离心管中，加入活化液，离心，去上清，沉淀物加入活化液，超声重悬；再清洗一次；b)荧光微球加入交联剂edc和sulfo-nhs，edc终浓度0.04％-0.2％，sulfo-nhs终浓度0.12％-0.6％，反应10-30min，离心，去上清，沉淀物加入偶联缓冲液，超声重悬；c)按0.1ml荧光微球加入30-100μg的鸡igy抗体、兔igg抗体或鼠igg抗体中的一种，室温旋转反应，离心，去上清，沉淀物加入封闭液，超声重悬，室温旋转反应；离心，去上清，沉淀物加入washingbuffer，清洗两次，去上清，沉淀物用复溶液超声重悬，得到质控线荧光偶合物；3)配液：用冻干保护液将检测线荧光偶合物稀释100至1000倍，质控线荧光偶合物稀释500至2000倍配制成反应物质溶液；4)分装：将反应物质溶液分装在塑料试管中，分装完成的塑料试管放置于冻干托盘上，冷冻干燥成粉末，冻干后，将反应物质密封压盖，2℃～8℃保存。所述反应缓冲液的制备方法，包括如下步骤：1)配制反应缓冲液：向10-50mm的tris缓冲液，加入终浓度0.1％-1％吐温20，加入终浓度0.1％-10％海藻糖，加入终浓度0.8-2％nacl，加入终浓度0.01％-0.1％proclin300；2)分装：将反应缓冲液分装至的塑料试管中，加盖密封，于2℃～8℃保存。本发明还提供了一种用于检测氨基末端脑利钠肽前体的荧光免疫定量检测方法，其特征在于，采用上述的试剂盒，包括以下步骤：步骤a：将冷藏保存的反应物质和反应缓冲液在室温放置，使其充分平衡；步骤b：吸取反应缓冲液放入反应物质试管，并立即吸取全血、血清或血浆加入装有反应缓冲液的反应物质试管中，得样本混合液；步骤c：盖上反应物质试管盖子，摇晃使样本混合液充分混匀；步骤d：吸取样本混合液，加到试剂卡的加样孔中，反应；步骤e：将反应后的试剂卡插入荧光免疫分析仪中，进行结果读取。本发明与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)本发明将荧光偶合物即荧光微球标记的氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体及质控线荧光偶合物分装至独立离心管内，再经冷冻干燥的方式制成冻干粉，封装，可最大程度保存了荧光微球标记的抗体的生物活性，且均一性好，降低批间差异。(2)与常规的通过喷膜机将荧光偶合喷洒结合垫上，再烘干，在喷洒后至烘干的过程中，因湿料无定向扩散，不能迅速地固定保持在玻璃纤维上，可导致结合垫单位面积上所含荧光偶合物的活性不均一，是造成免疫层析试剂变异系数cv较高的重要来源。而采用本发明的工艺，将荧光偶合物分装至独立离心管内，再经冷冻干燥的方式制成冻干粉，封装，具有均一性好，受环境影响小，易稳定保存的优点。(3)本发明的工艺，将荧光偶合物即荧光微球标记的氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体及质控线荧光偶合物分装至独立离心管内，再经冷冻干燥的方式制备冻干粉，封装，加入反应缓冲液后，该荧光偶合物可快速溶解，并能够将荧光偶合物完全释放，极大保持了荧光微球标记的氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体的生物活性，使其能够与样本中的氨基末端脑利钠肽前体充分结合，从而提高了检测的灵敏度及准确度。(4)将待测样本加入离心管内，先与反应物质进行免疫反应，再取混合液加入至试剂卡加样孔，与检测线和质控线上的抗体进行免疫反应，形成免疫复合物。使荧光偶合物充分释放并与样本中氨基末端脑利钠肽前体发生免疫反应，免疫反应更充分完全，显著提高了检测的灵敏度及重复性。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明一实施例的氨基末端脑利钠肽前体检测试剂盒组成示意图；图2为本发明一实施例的免疫层析试剂卡的内部结构示意图；图3为本发明一实施例的氨基末端脑利钠肽前体的标准曲线图；图4为本发明一实施例的氨基末端脑利钠肽前体的线性范围图；图5为本发明一实施例的试剂盒与化学发光发试剂盒的相关性图。其中：1.试剂卡；2.反应物质；3.显示窗；4.加样孔；5.检测线；6.质控线；7.样品垫；8.吸水垫；9.硝酸纤维素膜；10.背衬板。具体实施方式为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图对本发明作进一步的详细介绍。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。一实施方式的氨基末端脑利钠肽前体测定试剂盒，包括：试剂卡、反应物质及反应缓冲液，其中，试剂卡包括壳体及试纸条，试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫及背衬板，硝酸纤维素膜贴在背衬板上，样品垫和吸水垫的一端分别搭接于硝酸纤维素膜的两端，硝酸纤维素膜上设有检测线与质控线，检测线与质控线相互平行，且质控线位于硝酸纤维素膜上靠近吸水垫的一端，检测线包被有氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体，质控线包被有羊抗鸡igy抗体、羊抗兔igg抗体或羊抗鼠igg抗体中的一种，壳体包括能相互扣合的上盖和下盖，上盖对应硝酸纤维素膜的位置设有显示窗，对应样品垫的位置设有加样孔。其中，反应物质包括检测线荧光偶合物及质控线荧光偶合物；检测线荧光偶合物含有荧光微球标记的氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体，质控线荧光偶合物含有荧光微球标记的鸡igy抗体、兔igg抗体或鼠igg抗体中的一种。其中，反应缓冲液为含有表面活性剂、糖类、防腐剂、氯化钠的缓冲液。该氨基末端脑利钠肽前体检测试剂盒基于氨基末端脑利钠肽前体作为检测标志物，能够对急性心衰、心肌梗死、心源性呼吸困难进行快速检测。检测时，将反应缓冲液加入至反应物质，并立即吸取50μl全血、血清或血浆加入装有反应缓冲液的反应物质试管中，使充分混匀，待测样本中的氨基末端脑利钠肽前体能够与反应物质中的荧光微球标记的氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体充分结合形成复合物，再将其加到试剂卡的加样孔上，该复合物通过层析作用与检测线上包被的氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体结合形成抗体-抗原-抗体夹心复合物，将试剂卡插入荧光免疫分析仪中即可测定待测样本中的氨基末端脑利钠肽前体的含量。该检测方法方便快捷、反应充分、操作简单。具体地，所述所述荧光微球为时间分辨荧光微球，所述时间分辨荧光微球包埋稀土离子，同时所述时间分辨荧光微球表面修饰有氨基、羧基或羟基中的一种功能基团；所述稀土离子为镧系元素中sm钐、eu铕、gd钆、tb铽、dy镝中的一种或几种。抗体,也叫免疫球蛋白(ig),是一种能特异性结合抗原的糖蛋白。抗体以一个或者多个y字形单体存在,每个y字形单体由4条多肽链组成,包含两条相同的重链和两条相同的轻链。一般的，抗体蛋白分子中可以用于偶联的活性基团有游离氨基(如赖氨酸或末端氨基)、游离羧基(如天冬氨酸残基，谷氨酸残基及末端羧基)、巯基(如半胱氨酸)、羟基(如丝氨酸或苏氨酸)等。在其中一个实施例中，所述的时间分辨荧光微球，与通常的荧光分免疫析不同，示踪物为稀土元素，而不是荧光素；优选的，稀土元素为三价镧系元素eu铕；每个微球中可包裹成千上万个荧光分子，大大提高了荧光的标记效率，有效提高了分析灵敏度；同时荧光微球表面修饰有合适密度的氨基、羧基或羟基等其它功能基团，用于与氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体的共价偶联，提高了标记物的稳定性。常用的抗体偶联方式有戊二醛法、碳二亚胺法(edc)等。edc〔1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺〕其机制一般认为是蛋白残基的羧基先同edc反应，生成活泼的中间产物o-酰基异脲(o-acylisourea)而edc与带有羧基的物质反应形成一个活性中间体，它极不稳定，其活性酯容易水解，并且中间体与氨基反应速度慢。通常加入nhs一起使用，提高活性中间体的溶解性和稳定性。本发明采用sulfo-nhs的连接反应效率比nhs要高，且sulfo-nhs具有负电荷，不易造成连接底物(例如荧光微球)聚合。在其中一实施例中，所述反应物质由检测线荧光偶合物及质控线荧光偶合物在冻干保护液的保护下经过冷冻干燥制成，即将荧光微球标记的氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体与荧光微球标记的鸡igy抗体、兔igg抗体或鼠igg抗体用冻干保护液进行稀释配制成反应物质溶液，再将反应物质溶液分装在塑料试管中，进行冷冻干燥。该冷冻干燥工艺可极大保持了荧光微球标记的抗体的生物活性。在其中一实施例中，所述冻干保护液含有保护蛋白、糖类的缓冲液；所述缓冲液为磷酸盐、硼酸盐或tris缓冲液中的一种或几种，浓度为10mm-50mm，所述缓冲液在冷冻干燥中提供稳定溶液的ph，防止ph变化大导致蛋白质发生物理聚集或化学变性；所述的保护蛋白为牛血清白蛋白，卵清蛋白或酪蛋白中的一种或几种，浓度为0.1％-3％，所述保护蛋白为大分子物质，在冷冻干燥中为活性组分提供稳定支撑骨架，起着低温保护和脱水保护；所述糖类为海藻糖、蔗糖、乳糖中的一种或几种，浓度为0.1％-10％，所述糖类起着防止活性组分发生变性，同时具有低温保护和脱水保护作用。在其中一实施例中，所述反应缓冲液中缓冲液为磷酸盐、硼酸盐或tris缓冲液中的一种或几种，浓度为10mm-50mm，所述缓冲液在复溶后提供稳定溶液的ph，防止荧光微球聚合；所述表面活性剂为曲拉通x-100、吐温20、s16、s9中的一种或几种，浓度为0.1％-1％，所述表面活性剂起到迅速溶解，有利于活性组分快速分散；所述糖类为海藻糖、蔗糖、乳糖中的一种或几种，浓度为0.1％-10％，所述糖类物质起到保护作用，提高溶液黏度；所述nacl的浓度为0.8-2％，所述nacl提高了溶液中的离子强度，有利于抗原抗体免疫反应；所述防腐剂为山梨酸、苯甲酸或proclin300中的一种或几种，浓度为0.01％-0.1％，所述防腐剂可抑制溶液长菌。在其中一实施例中，所述氨基末端脑利钠肽前体测定试剂盒还包括id卡，所述id卡存储有产品的项目名称、批号及标准曲线数据。与配套的干式荧光免疫分析仪使用，将id卡插入后，读取相关信息。实施例1试剂卡的制备(1)检测线及质控线的制备：分别配制氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体浓度为2.0mg/ml，羊抗鸡igy抗体浓度为1mg/ml，用喷膜机划线至硝酸纤维素膜上检测线和质控线区域，包被量1.0μl/cm，将划好的硝酸纤维素膜放置鼓风干燥箱，在50℃烘干18小时；(2)样品垫的制备：配制封闭溶液，将封闭溶液加入至玻璃纤维上，使玻璃纤维完全湿润，放置鼓风干燥箱，在50℃烘干18小时；(3)试剂卡的组装：将硝酸纤维素膜黏贴至背衬板上，样品垫和吸水垫的一端分别搭接于硝酸纤维素膜的两端，切成特定宽度的试纸条，将试纸条放入壳体中固定位置，盖上盖，压卡，封入铝箔袋中，加入硅胶干燥剂，密封。检测线(氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体)荧光偶合物的制备a)取0.1mleu铕时间分辨荧光微球-羧基基团置于离心管中，加入活化液，在转数13000rpm离心20min，去上清，沉淀物加入活化液，超声重悬；再清洗一次；b)按0.1mleu铕时间分辨荧光微球-羧基基团加入交联剂edc和sulfo-nhs，edc终浓度0.12％，sulfo-nhs终浓度0.36％，反应30min，在转数13000rpm离心20min，去上清，沉淀物加入偶联缓冲液，超声重悬；c)按0.1mleu铕时间分辨荧光微球-羧基基团加入80μg的氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体，室温旋转反应120min，然后在转数13000rpm离心20min，去上清，沉淀物加入封闭液，封闭液浓度为0.5％，超声重悬，室温旋转反应100min；在13000rpm离心20min，去上清，沉淀物加入washingbuffer，清洗两次，去上清，沉淀物用复溶液超声重悬；得到检测线荧光偶合物；质控线(鸡igy抗体)荧光偶合物的制备a)取0.1mleu铕时间分辨荧光微球-羧基基团置于离心管中，加入活化液，在转数13000rpm离心20min，去上清，沉淀物加入活化液，超声重悬；再清洗一次；b)按0.1mleu铕时间分辨荧光微球-羧基基团加入交联剂edc和sulfo-nhs，edc终浓度0.12％，sulfo-nhs终浓度0.36％，反应30min，在转数13000rpm离心20min，去上清，沉淀物加入偶联缓冲液，超声重悬；c)按0.1mleu铕时间分辨荧光微球-羧基基团加入100ug的鸡igy抗体，室温旋转反应120min，然后在转数13000rpm离心20min，去上清，沉淀物加入封闭液，封闭液浓度为0.5％，超声重悬，室温旋转反应100min；在13000rpm离心20min，去上清，沉淀物加入washingbuffer，清洗两次，去上清，沉淀物用复溶液超声重悬；得到质控线荧光偶合物；反应物质的制备(1)冻干保护液的制备：50mmtris缓冲液加入1％酪蛋白，加入3％海藻糖，加入3％蔗糖，充分溶解混匀。(2)配液：用冻干保护液将检测线荧光偶合物稀释300倍，质控线荧光偶合物稀释1000倍配制成反应物质溶液；(3)分装：将反应物质溶液0.1ml分装至塑料试管中，放置于冻干托盘上，冷冻干燥成粉末，冻干后，立即将反应物质密封压盖，2℃～8℃避光保存。反应缓冲液的制备(1)反应缓冲液的制备：50mmtris缓冲液加入0.5％吐温20，加入2％海藻糖，加入0.9％nacl，加入0.05％proclin300充分溶解混匀；(2)分装：将反应缓冲液分装至的试管中，加盖密封，于2℃～8℃保存。试剂盒的总装及反应物质和反应缓冲液的装配反应物质和反应缓冲液的的装配：将30支反应物质和一包干燥剂装于一铝箔袋中，将铝箔袋与一支反应缓冲液进行包装，置于2℃-8℃保存。试剂盒的总装：将多个试剂卡、一份id卡进行包装。检测氨基末端脑利钠肽前体的荧光免疫定量检测方法，包括以下步骤：步骤a：将冷藏保存的反应物质和反应缓冲液在室温放置30分钟，使其在室温充分平衡；步骤b：吸取反应缓冲液100μl放入反应物质试管，并立即吸取50μl全血或血清或血浆加入装有反应缓冲液的反应物质试管中，得样本混合液；步骤c：盖上反应物质试管盖子，摇晃使样本混合液充分混匀；步骤d：吸取80μl的样本混合液，加到试剂卡的加样孔中，反应20分钟；步骤e：将反应后的试剂卡插入荧光免疫分析仪中，进行结果读取。实施例2试剂卡的制备(1)检测线及质控线的制备：分别配制氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体浓度为3.0mg/ml，羊抗兔igg抗体浓度为2mg/ml，用喷膜机划线至硝酸纤维素膜上检测线和质控线区域，包被量0.8μl/cm，将划好的硝酸纤维素膜放置鼓风干燥箱，在45℃烘干20小时；(2)样品垫的制备：配制封闭溶液，将封闭溶液加入至玻璃纤维上，使玻璃纤维完全湿润，放置鼓风干燥箱，在45℃烘干20小时；(3)试剂卡的组装：将硝酸纤维素膜黏贴至背衬板上，样品垫和吸水垫的一端分别搭接于硝酸纤维素膜的两端，切成特定宽度的试纸条，将试纸条放入壳体中固定位置，盖上盖，压卡，封入铝箔袋中，加入硅胶干燥剂，密封。检测线(氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体)荧光偶合物的制备a)取0.1mldy镝时间分辨荧光微球置于离心管中，加入活化液，在转数10000rpm离心15min，去上清，沉淀物加入活化液，超声重悬；再清洗一次；b)按0.1mldy镝时间分辨荧光微球加入交联剂edc和sulfo-nhs，edc终浓度0.2％，sulfo-nhs终浓度0.6％，反应30min，在转数10000rpm离心15min，去上清，沉淀物加入偶联缓冲液，超声重悬；c)按0.1mldy镝时间分辨荧光微球加入100μg的氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体，室温旋转反应120min，然后在转数10000rpm离心15min，去上清，沉淀物加入封闭液，封闭液浓度为0.1％，超声重悬，室温旋转反应100min；在10000rpm离心15min，去上清，沉淀物加入washingbuffer，清洗两次，去上清，沉淀物用复溶液超声重悬；得到检测线荧光偶合物；质控线(兔igg抗体)荧光偶合物的制备a)取0.1mldy镝时间分辨荧光微球置于离心管中，加入活化液，在转数10000rpm离心15min，去上清，沉淀物加入活化液，超声重悬；再清洗一次；b)按0.1mldy镝时间分辨荧光微球加入交联剂edc和sulfo-nhs，edc终浓度0.2％，sulfo-nhs终浓度0.6％，反应30min，在转数10000rpm离心15min，去上清，沉淀物加入偶联缓冲液，超声重悬；c)按0.1mldy镝时间分辨荧光微球加入100μg的兔igg抗体，室温旋转反应120min，然后在转数10000rpm离心15min，去上清，沉淀物加入封闭液，封闭液浓度为0.5％，超声重悬，室温旋转反应100min；在10000rpm离心15min，去上清，沉淀物加入washingbuffer，清洗两次，去上清，沉淀物用复溶液超声重悬；得到质控线荧光偶合物；反应物质的制备(1)冻干保护液的制备：30mm磷酸盐缓冲液加入3％牛血清白蛋白，加入10％蔗糖，充分溶解混匀。(2)配液：用冻干保护液将检测线荧光偶合物稀释1000倍，质控线荧光偶合物稀释2000倍配制成反应物质溶液；(3)分装：将反应物质溶液0.1ml分装至塑料试管中，分装完成的塑料试管放置于冻干托盘上，冷冻干燥成粉末，冻干后，立即将反应物质密封压盖，2℃～8℃避光保存。反应缓冲液的制备(1)反应缓冲液的制备：30mm磷酸盐缓冲液加入1％曲拉通x-100，加入0.5％乳糖，加入2％海藻糖，加入2％nacl，加入0.1％proclin300充分溶解混匀；(2)分装：将反应缓冲液分装至的塑料试管中，加盖密封，于2℃～8℃保存。检测氨基末端脑利钠肽前体的荧光免疫定量检测方法，包括以下步骤：步骤a：将冷藏保存的反应物质和反应缓冲液在室温放置30分钟，使其在室温充分平衡；步骤b：吸取反应缓冲液100μl放入反应物质试管，并立即吸取50μl全血或血清或血浆加入装有反应缓冲液的反应物质试管中，得样本混合液；步骤c：盖上反应物质试管盖子，摇晃使样本混合液充分混匀；步骤d：吸取80μl的样本混合液，加到试剂卡的加样孔中，反应15分钟；步骤e：将反应后的试剂卡插入荧光免疫分析仪中，进行结果读取。实施例3试剂卡的制备(1)检测线及质控线的制备：分别配制氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体浓度为0.5mg/ml，羊抗鼠igg抗体浓度为0.5mg/ml，用喷膜机划线至硝酸纤维素膜上检测线和质控线区域，包被量0.5μl/cm，将划好的硝酸纤维素膜放置鼓风干燥箱，在37℃烘干24小时；(2)样品垫的制备：配制封闭溶液，将封闭溶液加入至玻璃纤维上，使玻璃纤维完全湿润，放置鼓风干燥箱，在37℃烘干24小时；(3)试剂卡的组装：将硝酸纤维素膜黏贴至背衬板上，样品垫和吸水垫的一端分别搭接于硝酸纤维素膜的两端，切成特定宽度的试纸条，将试纸条放入壳体中固定位置，盖上盖，压卡，封入铝箔袋中，加入硅胶干燥剂，密封。检测线(氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体)荧光偶合物的制备a)取0.1mlsm钐时间分辨荧光微球置于离心管中，加入活化液，在转数13000rpm离心10min，去上清，沉淀物加入活化液，超声重悬；再清洗一次；b)按0.1mlsm钐时间分辨荧光微球加入交联剂edc和sulfo-nhs，edc终浓度0.04％，sulfo-nhs终浓度0.12％，反应10min，在转数13000rpm离心10min，去上清，沉淀物加入偶联缓冲液，超声重悬；c)按0.1mlsm钐时间分辨荧光微球加入30μg的氨基末端脑利钠肽前体单克隆抗体，室温旋转反应120min，然后在转数13000rpm离心10min，去上清，沉淀物加入封闭液，封闭液浓度为0.3％，超声重悬，室温旋转反应100min；在13000rpm离心10min，去上清，沉淀物加入washingbuffer，清洗两次，去上清，沉淀物用复溶液超声重悬；得到检测线荧光偶合物；质控线(鼠igg抗体)荧光偶合物的制备a)取0.1mlsm钐时间分辨荧光微球置于离心管中，加入活化液，在转数13000rpm离心20min，去上清，沉淀物加入活化液，超声重悬；再清洗一次；b)按0.1mlsm钐时间分辨荧光微球加入交联剂edc和sulfo-nhs，edc终浓度0.04％，sulfo-nhs终浓度0.12％，反应10min，在转数13000rpm离心10min，去上清，沉淀物加入偶联缓冲液，超声重悬；c)按0.1mlsm钐时间分辨荧光微球加入30μg的鼠igg抗体，室温旋转反应120min，然后在转数13000rpm离心10min，去上清，沉淀物加入封闭液，封闭液浓度为0.5％，超声重悬，室温旋转反应100min；在13000rpm离心10min，去上清，沉淀物加入washingbuffer，清洗两次，去上清，沉淀物用复溶液超声重悬；得到质控线荧光偶合物；反应物质的制备(1)冻干保护液的制备：10mm硼酸盐缓冲液加入0.1％卵清蛋白，加入0.1％蔗糖，充分溶解混匀。(2)配液：用冻干保护液将检测线荧光偶合物稀释100倍，质控线荧光偶合物稀释500倍配制成反应物质溶液；(3)分装：将反应物质溶液0.1ml分装至塑料试管中，放置于冻干托盘上，冷冻干燥成粉末，冻干后，立即将反应物质密封压盖，2℃～8℃避光保存。反应缓冲液的制备(1)反应缓冲液的制备：10mm硼酸盐缓冲液加入0.1％吐温s9，加入0.1％蔗糖，加入0.8％nacl，加入0.01％proclin300充分溶解混匀；(2)分装：将反应缓冲液分装至的塑料试管中，加盖密封，2℃～8℃保存。检测氨基末端脑利钠肽前体的荧光免疫定量检测方法，包括以下步骤：步骤a：将冷藏保存的反应物质和反应缓冲液在室温放置30分钟，使其在室温充分平衡；步骤b：吸取反应缓冲液100μl放入反应物质试管，并立即吸取50μl全血或血清或血浆加入装有反应缓冲液的反应物质试管中，得样本混合液；步骤c：盖上反应物质试管盖子，摇晃使样本混合液充分混匀；步骤d：吸取80μl的样本混合液，加到反应板的样本孔中，反应8分钟；步骤e：将反应后的试剂卡插入荧光免疫分析仪中，进行结果读取。测试例1标准曲线制作配制浓度为0、30、125、1250、5000、15000、30000(单位：pg/ml)的样本,采用实施例1的试剂盒及检测方法进行检测，每个浓度的样本重复3次，计算平均值，在荧光免疫分析仪中读取荧光信号，以浓度为纵坐标，荧光信号均值为横坐标绘制拟合曲线，得到标准曲线，该标准曲线线性良好，r＝0.9998，见图3。测试例2重复性测试配制浓度125、5000、15000(单位：pg/ml)的样本,采用实施例2的试剂盒及检测方法进行检测，每个浓度的样本重复10次，在荧光免疫分析仪中读取浓度，计算10次测定结果的平均值(m)和标准差(sd)，根据公式得出变异系数cv(cv＝sd/m×100％)。结果见表1。表1由表1所示，不同浓度的样本得到的cv值均在10％以下，该氨基末端脑利钠肽前体检测试剂盒重复性良好。测试例3准确度测试配制浓度300、5000(单位：pg/ml)的样本,采用实施例3的试剂盒及检测方法进行检测,进行检测，每个重复10次，每份样本重复检测3次，按公式计算相对偏差(b)。结果见表2。bi＝(xi-t)/t×100％式中：bi—相对偏差；xi—测量浓度；t—标定浓度表2由表2所示，相对偏差均在±10％以内，因此该氨基末端脑利钠肽前体检测试剂盒准确度良好。测试例4干扰试验测试配置血红蛋白母液(120g/l)、甘油三酯母液(240g/l)、胆红素母液(5mg/ml)。选择健康个体的新鲜混合临床血清样本，添加适量的氨基末端脑利钠肽前体校准品，使样本中氨基末端脑利钠肽前体的浓度分别达到约125pg/ml和1250pg/ml。分成2份，一份作为对照样品，另一份作为实验样品。对照样品：不添加干扰物质。实验样品：在对照样品添加纯品的干扰物质：血红蛋白母液(120g/l)、甘油三酯母液(240g/l)、胆红素母液(5mg/ml)。采用实施例1的试剂盒及检测方法进行检测,每份样品各重复检测3次，取平均值作为最终检测结果。计算实验样品与对照样品的相对偏差。相对偏差在±10％以内，则认为所添加的干扰物质对试剂的检测结果不存在干扰。结果见表3。以实验样品的测试均值结果记为m，以对照样品的测试均值结果记为t，根据以下公式计算相对偏差b。式中：b——相对偏差；m——实验样品浓度均值；t——对照样本浓度均值。表3结果显示，血红蛋白小于5mg/ml，甘油三脂小于10mg/ml，胆红素小于0.2mg/ml，相对偏差在±10％以内，本发明的试剂盒抗干扰效果良好。测试例5特异性测试配置用生理盐水(浓度为0.9％的nacl溶液)制备anp母液(20ng/ml)、cnp母液(20ng/ml)、血管紧张素ⅱ母液(12ng/ml)、l-去甲肾上腺素母液(14ng/ml)。选择健康个体的新鲜混合临床血清样本，添加适量的高浓度nt-probnp校准品，使样本中nt-probnp的浓度分别达到约125pg/ml和1250pg/ml。分成2份，一份作为对照样品，另一份作为实验样品。对照样品：不添加交叉反应物质。实验样品：在对照样本添加anp、cnp、血管紧张素ⅱ、l-去甲肾上腺素纯品的交叉反应物质。采用实施例1的试剂盒及检测方法进行检测,每份样品各重复检测3次，取平均值作为最终检测结果。计算实验样品与对照样品的相对偏差。以实验样品的测试均值结果记为m，以对照样品的测试均值结果记为t，根据以下公式计算相对偏差b。结果见表4。式中：b——相对偏差；m——实验样品浓度均值；t——对照样本浓度均值。表4结果显示，anp(1000pg/ml)、cnp(1000pg/ml)、血管紧张素ⅱ(600pg/ml)、l-去甲肾上腺素(700pg/ml)的实验样品，相对偏差均在±10％以内。本发明的试剂盒抗干扰效果良好。测试例6稳定性试验配制浓度0、30、125、1250、5000、15000、30000(单位：pg/ml)的样本,采用实施例1的试剂盒及检测方法进行检测，每个样本重复3次，将测定浓度的平均值与理论浓度或稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，按照公式计算出线性回归的相关系数r。测试结果见表5，相关线性图见图4。xi——理论浓度或稀释比例；yi——实际测定平均值。理论浓度测试1测试2测试3平均值3000030173.730925.428151.429750.21500014828.314575.414974.414792.750004998.35415.55277.95230.612501291.611511204.81215.8125126.1112.2129122.43032.530.52830.3表5如表5及图4所示，相关系数r＝0.999，本发明的试剂盒的稳定性良好。测试例7临床样本相关性测试采用实施例1的试剂盒和进口试剂盒(orthoclinicaldiagnostics，n端脑利钠肽测定试剂包(化学发光法)国械注进20162404805)分别对40份人血清样本同时进行检测对比。对数据进行相关性分析，其结果如表7所示：表7以进口试剂盒的测定结果(xi)为自变量，以本发明试剂盒的测定结果(yi)为因变量，求出线性回归方程，相关线性图见图5。相关方程为：y＝0.9973x+69.086,相关系数r＝0.9831。经统计学处理结果表明，本发明试剂盒同进口试剂盒临床样本测定值相关性良好，符合临床试验要求。对比例对比例的制备：将荧光偶合物用冻干保护液稀释15倍和50倍，用喷膜机喷洒至结合垫上，放置鼓风干燥箱37℃烘干18-24小时。以常规方法制备免疫层析试剂卡，将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘土至pvc底板上，裁切试纸条，装卡。对比例将荧光偶合物包被在结合垫上，其余结构及步骤与实施例1相同，样本加样量及判读时间与本实施例1相同。分别采用对比例试剂盒与实施例1试剂盒进行重复性测试：配制浓度125、5000、15000(单位：pg/ml)的样本,进行检测，每个重复10次，在荧光免疫分析仪中读取浓度，计算10次测定结果的平均值(m)和标准差(sd)，根据公式得出变异系数cv(cv＝sd/m×100％)。结果见表8：表8结果表明，实施例1的变异系数cv均在10％以下，与对比例相比，具有更好的重复性。所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12