一种肠道微生物代谢物在制备自闭症诊断试剂盒中的用途的制作方法

本发明涉及自闭症诊断领域，尤其涉及一种肠道微生物代谢物在制备自闭症诊断试剂盒中的用途。
背景技术：
：自闭症谱系障碍(autismspectrumdisorders，asd)，简称自闭症，又称为孤独症谱系障碍或孤独症，是一种广泛性的神经发育障碍，主要表现为社交障碍，语言障碍以及重复和刻板行为。根据《中国自闭症教育康复行业发展状况报告》(2015年版)的调查结果，中国约有1000万自闭症患者(按1％的发生率计)，包括约200万名儿童(0-14岁)。自闭症已经为社会公共卫生系统和患者家庭带来了沉重的负担。自闭症作为一类病因复杂的神经认知功能障碍，其发病过程受到遗传和环境因素的影响。一方面，数据表明只有大约18％自闭症患者是在3岁以前最终确诊的，相反地，asd患者错过了在早期干预和治疗的机会，以至进展为严重的个体智力水平和社会功能障碍。因此，可靠的自闭症风险水平的测定方法，对筛选自闭症发病易感性和及时有效地治疗自闭症，具有积极的意义。另一方面，目前为止，自闭症的诊断过程常依赖量表进行评估，没有分子生物学上的诊断标准。这类诊断方式容易受到主观经验的干扰，导致诊断准确率较低，也限制了相关治疗手段的开发。所以，高效量化的诊断指标将大大提高自闭症的准确诊断率。自闭症患者多存在肠道功能紊乱，同时，肠道功能异常也加重了自闭症症状。因此，对自闭症人群和健康人群肠道微生物代谢物的研究，具有实际意义。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种肠道微生物代谢物在制备自闭症诊断试剂盒中的用途。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种自闭症发病风险预测或自闭症诊断试剂盒，所述自闭症诊断试剂盒包括检测肠道微生物代谢物浓度的试剂，所述肠道微生物代谢物包括乙酸、酪胺、组胺、γ-氨基丁酸、二羟基苯丙氨酸、去甲肾上腺素中的至少一种。本发明通过大样本研究发现健康受试者和自闭症患者中肠道微生物代谢物乙酸、酪胺、组胺、γ-氨基丁酸、二羟基苯丙氨酸以及去甲肾上腺素的水平有显著性差异，以这些肠道微生物代谢物作为标志物预测自闭症发病风险或诊断自闭症，不会受到主观经验的干扰，诊断准确率较高，提供了一种新预测自闭症发病风险或诊断自闭症的手段，具有重要的医用前景和经济价值。作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述肠道微生物代谢物来自粪便。作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述自闭症诊断试剂盒包括提取肠道微生物代谢物的试剂以及肠道微生物代谢物定量检测试剂。另外，本发明的另一目的是提供一种药物组合物，所述肠道微生物代谢物包括乙酸、酪胺、组胺、γ-氨基丁酸、二羟基苯丙氨酸以及去甲肾上腺素中的至少一种。作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述肠道微生物代谢物来自粪便。作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述自闭症诊断试剂盒包括提取肠道微生物代谢物的试剂以及肠道微生物代谢物定量检测试剂。作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述肠道微生物代谢物为乙酸，所述提取肠道微生物代谢物的试剂为磷酸溶液。作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述肠道微生物代谢物为酪胺、组胺、γ-氨基丁酸、二羟基苯丙氨酸或去甲肾上腺素，所述提取肠道微生物代谢物的试剂为甲醇/乙腈溶液。本发明的有益效果：本发明发现健康受试者和自闭症患者中肠道微生物代谢物的水平有显著性差异，且发现乙酸含量与自闭症严重程度评分呈负性相关关系；酪胺、组胺、γ-氨基丁酸、二羟基苯丙氨酸和去甲肾上腺素的含量分别与自闭症严重程度呈正相关关系，因此可通过粪便样本肠道微生物代谢物水平来诊断自闭症患病，具有较高的准确性。附图说明图1：本发明肠道微生物代谢物浓度和自闭症患病关系的pls-da分析图。图2：本发明pls-da分析中变量投影重要度(variableimportancefortheprojection，vip)图。图3：本发明自闭症患病关系与粪便样本中肠道微生物水平的spearman相关性分析图。图4：乙酸、酪胺、组胺、γ-氨基丁酸、二羟基苯丙氨酸以及去甲肾上腺素作为诊断模型对全部自闭症病例的roc图。图5：将乙酸、酪胺、组胺、γ-氨基丁酸、二羟基苯丙氨酸以及去甲肾上腺素作为诊断模型对轻度自闭症(a)、重度自闭症(b)样本的roc图。具体实施方式在没有特殊说明的情况下，本发明中所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。下面参考具体实施例和附图，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，均按照常规实验条件，或按照制造厂商说明书建议的条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1粪便样本中乙酸含量测定本实施例通过检测健康人群和自闭症患者的粪便样本，继而进行相关性分析，以确定粪便样本中肠道微生物代谢物乙酸水平与自闭症发病和症状严重程度的相关性。具体步骤如下：(1)样品来源自闭症组：来自山西方舟自闭症康复研究院，年龄分布0-14岁。纳入标准：①根据国际最新诊断标准，即《美国精神障碍诊断与统计手册第5版》(diagnosticandstatisticalmanualofmentaldisorders，5thedition，dsm5)，诊断为自闭症的患者，共49例，其中轻度41例，重度8例；②性别不限。排除标准：①患有其他精神疾病(如精神分裂症)和其他神经发育障碍疾病；②患有遗传代谢性疾病；③患有严重神经疾病以及颅脑损伤史等重大躯体疾病史；④近1个月内有胃肠道感染病史或抗生素使用史。对照组：来自山西大同绿野寻踪英式幼儿园。纳入标准：①身体健康，无神经发育障碍疾病；②与患者组年龄及性别匹配。排除标准同自闭症组。所有入组儿童家长对本研究知情并签署知情同意书。本研究经中山大学附属第七医院医学伦理委员会批准，伦理编号：2018041901。(2)粪便样本的采集健康受试者和自闭症患者自行将粪便排在指定的粪便采集盆，然后准备医用一次性粪便采样管，戴手套，采集粪便，采集中断，避免因疏忽造成的污染，一旦发现污染，应重新采样，采集完成后迅速冷冻保存于-80℃，备用。粪便样本采集量在0.3克左右(>0.2g)。(3)粪便样本乙酸含量分析方案a.第一样本制备将样本在冰上解冻，取适量样本加入50μl15％磷酸溶液，再加入5μg/ml的内标(异己酸)溶液150μl混匀1min，于4℃12000rpm离心10min，取上清进入气相色谱-质谱分析(gc-ms)检测。b.gc-ms分析使用gc-ms对样本中的短链脂肪酸进行检测，并采集数据一套，具体gc-ms条件见表1。表1色谱和质谱仪器信息columnmsdb-wax(30m×0.25mm×0.25μm)agilent(4)数据分析采用标准品建立标准曲线，计算样本中的各检测到的乙酸含量。实施例2粪便样本中酪胺、组胺、γ-氨基丁酸、二羟基苯丙氨酸和去甲肾上腺素含量测定对采集到的粪便样本继续进行其他肠道微生物代谢物分析，具体步骤如下：(1)第二样本制备(第二样本和实施例1步骤(3)中第一样本为来源于同一粪便样本的两个样本)每份称取适量，加入1％fa200μl预冷超纯水，进行mp匀浆，再加入1％fa800μl甲醇/乙腈(1:1，v/v)，涡旋混合，低温超声30min，-20℃孵育1h沉淀蛋白，14000rcf4℃离心20min，取上清，真空干燥。质谱检测时加入1％fa100μlacn/water(1:1，v/v)复溶，14000rcf4℃离心15min，取上清进样分析。另取样本适量，等量混合为qc样本。qc样本按照上述方法平行进行制备。(2)hiliclc-ms/ms分析使用hilic对样本进行分离，采集mrm模式数据一套。主要对样本中神经递质类物质进行相对定量分析，得到峰面积。具体lc-ms/ms条件见表2。表2色谱和质谱仪器信息columnmswatersuplcamide2.1*100mm，1.7umq-trap5500(3)数据分析使用analystsoftware软件对神经递质的mrm原始数据进行提取，得到各代谢物的峰面积，计算出酪胺、组胺、γ-氨基丁酸、二羟基苯丙氨酸和去甲肾上腺素的含量。实施例3粪便样本肠道微生物代谢物含量与自闭症相关性分析利用pls-da分析(偏最小二乘判别分析)实施例1和实施例2中测定的自闭症组和对照组的粪便样本肠道微生物代谢物含量。结果如图1所示，两组样本(自闭症组和对照组)分别被划在两个圈内，表明这两组代谢物整体的表达模式有区别，因此微生物肠道代谢物浓度能显著区分健康受试者和自闭症患者(解释变异度11.28％)。如图2所示，为pls-da分析中变量投影重要度(variableimportancefortheprojection，vip)。vip是pls-da模型变量的变量权重值，可用于衡量各代谢物积累差异对各组样本分类判别的影响强度和解释能力，vip≥1为常见的差异代谢物筛选标准。其中粪便样品中乙酸是判别自闭症患病的最主要贡献者(vip>1)。如图3所示，分别为自闭症发病和严重程度与粪便样本中肠道微生物水平的spearman相关性分析图。相关系数如表1所示，相关系数为正，表明正相关，相关系数为负，表明负相关。表明粪便样本中乙酸含量与自闭症患病(是/否)、自闭症严重程度(轻/重)呈负性相关关系，酪胺、组胺、γ-氨基丁酸、二羟基苯丙氨酸和去甲肾上腺素的含量分别与自闭症患病(是/否)、自闭症严重程度(轻/重)呈正相关关系。表1肠道微生物水平的相关系数代谢物与自闭症患病的相关性与自闭症严重程度的相关性乙酸-0.44-0.43酪胺0.300.28组胺0.360.33γ-氨基丁酸0.340.32二羟基苯丙氨酸0.340.36去甲肾上腺素0.370.38实施例4粪便样本肠道微生物代谢物水平诊断自闭症患病准确性分析如图4所示，将乙酸、酪胺、组胺、γ-氨基丁酸、二羟基苯丙氨酸以及去甲肾上腺素作为诊断模型对全部自闭症病例进行roc曲线分析后(受试者工作特征曲线分析)，显示auc值(roc曲线下的面积值)为0.872。auc被定义为针对分类器将假阳性率(特异性)相对于真阳性率(灵敏度)绘制的roc曲线下的面积。auc是分类器能够区分两个诊断组的准确程度的量度(越接近1，准确度越好)。表明通过粪便样本肠道微生物代谢物水平来诊断自闭症患病，具有较高的准确性。如图5所示，将乙酸、酪胺、组胺、γ-氨基丁酸、二羟基苯丙氨酸以及去甲肾上腺素作为诊断模型分别对轻症病例(a)和重症病例(b)进行roc分析，auc值分别为0.874和0.882，表明通过肠道微生物代谢物水平来诊断轻度和重度自闭症，均具有较高的准确性。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。当前第1页12