专利名称：放射性标记的抗凝血多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型抗凝血多肽，它能够被放射性标记，可用作检测体内的凝血酶或作为诊断盒的适当样品的试剂。
抗凝血剂可用作急性深静脉血栓形成、肺栓塞、四肢末端急性动脉栓塞、心肌梗塞及散布性血管内凝血的药物治疗的治疗剂。据信预先服用抗凝血剂可以预防患风湿性或动脉硬化的心脏疾病的患者的栓塞重发，或预防某些外料手术的血栓栓塞并发症。也已证明服用抗凝血剂可用于治疗冠状动脉疾病和脑血管疾病。动脉尤其是供应心肌和脑的动脉血栓形成是导致死亡的原因。
水蛭素为从水蛭的唾液腺分离出的65个氨基酸多肽，它是凝血酶专一性抑制剂，因此可用作抗凝血剂。尽管具有很大的潜力，但从水蛭提取物分离出的水蛭素的临床应用仍然是靠不住的，因为它数量有限、价格昂贵、并导致过敏反应(服用这种大小的任何外源蛋白质普遍引起过敏反应)本申请人最早发现了水蛭素的一个特定区，它(至少部分)负责抗凝血活性。用化学方法合成了该肽区(水蛭素的55-65氨基酸)，并显示它与凝血酶的识别位点结合;该识别位点在空间上不同于酶切位点，同时也显示合成肽的结合竞争性阻止了纤维蛋白原与凝血酶识别位点的结合，而后者是纤维蛋白产生和凝血块形成的重要先决条件。因此该肽具有作为抗凝血剂的潜在医学价值。
申请人现已制备了该肽的某些碘酪氨酸及放射性同位素标记的酪氨酸衍生物。本发明提供了一种标记水蛭素肽同时保持其结合位点活性的方法，本发明的碘酪氨酸和放射性同位素衍生物也维持了它们原来作为抗凝血剂的特性，因此也可成为有科学价值及显著疗效的添加剂。具体地说，将氢和碘的放射性同位素加入肽中并维持该肽的生物活性的能力在抗凝血剂的药物试验及使用中提供了一种新的重要的试剂。预计这种试剂在动物及生物化学研究(即放射性免疫检测、药物兴奋剂和拮抗剂的筛选、药物动力学和生物分布)和诊断成像中非常重要。而且，碘酪氨酸或其放射性同位素的存在可能证明在药物开发及抗凝血剂的试验中的价值，这些衍生物本身的效价可能增强，作用时间也可能延长。
下式所示的肽衍生物作为抗凝血剂可用于诊断成像、诊断检测和“药盒”中的定量检测，或者作为一种抗凝血剂，并且至少一个取代基含有放射性同位素X-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-Y其中X为选自氢原子、一个或两个C1-10烷基、一个或两个C2-10酰基、苄氧羰基及叔-丁氧羰基的氨基末端残基;
A1为水蛭素或其天然变异体的序列或其一部分、一键，或为含有任何氨基酸的1-11个残基的肽;
A2为I-Tyr、〔3H-〕Tyr、〔125I〕-Tyr、〔131I〕-Tyr的0-5个残基，或者当A9含有一放射性标记的氨基酸时为L-芳香族氨基酸;
A3为Glu，Asp，Ala;
A4为任何氨基酸;
A5为Ile，Val，Leu，Nle，Ald或phe;
A6为Pro，Hyp，Azt，Pip，DhPro，噻唑烷-4-羧酸酯，Sar，NMepgl或D-Ald;
A7为任何氨基酸;
A8为任何氨基酸;
A9为选自Tyr、I-Tyr、(131I〕-Tyr、〔125I〕-Tyr、〔3H〕-Tyr、Met、Trp、Phe、Leu、Nle、Ile、Val、Cha、His、Ala和Pro的亲脂性氨基酸，或者是含有这些氨基酸或任何亲脂性氨基酸中至少一个的二肽;
A10为水蛭素或其天然变异物的序列或其一部分、一键或为含有1-11个任何氨基酸残基的肽;
Y为选自OH、(C1-C8)烷氧基、氨基、单或双-(C1-C4)烷基取代的氨基酸的羧基末端残基;
在本说明书中使用了下面的通用缩写来分别代表(1)氨基酸及其三字母代码，(2)经修饰的和异常的氨基酸，(3)末端氨基和羧基取代基(1)氨基酸及其三字母代码L-氨基酸 D-氨基酸Ala-丙氨酸 D-Ala-D-丙氨酸Arg-精氨酸 D-Arg-D-精氨酸Asn-天冬酰胺 D-Asn-D-天冬酰胺Asp-天冬氨酸 D-Asp-D-天冬氨酸Cys-半胱氨酸 D-Cys-D-半胱氨酸Gly-甘氨酸Glu-谷氨酸 D-Glu-D-谷氨酸
Val-缬氨酸 D-Val-D-缬氨酸Gln-谷氨酰胺 D-Gln-D-谷氨酰酸His-组氨酸 D-His-D-组氨酸Ile-异亮氨酸 D-Ile-D-异亮氨酸Leu-亮氨酸 D-Leu-D-亮氨酸Lys-赖氨酸 P-Lys-D-赖氨酸Phe-苯丙氨酸 D-Phe-D-苯丙氨酸Met-蛋氨酸 D-Met-D-蛋氨酸Pro-脯氨酸 D-Pro-D-脯氨酸Ser-丝氨酸 D-Ser-D-丝氨酸Thr-苏氨基 D-Thr-D-苏氨酸Trp-色氨酸 D-Trp-D-色氨酸Tyr-酪氨酸 D-Tyr-D-酪氨酸(2)经修饰的和异常的氨基酸Aba-α-氨基-正丁酸PC｜Phe-对-氯-苯丙氨酸Cha-环己基丙氨酸Chg-环己基甘氨酸Hyp-羟脯氨酸I-Tyr-3-碘酪氨酸(3-I-Tyr)，5-碘酪氨酸(5-ITyr)，3，5-二碘酪氨酸(3，5-diI-Tyr)〔3H〕-Tyr-〔3-3H〕-酪氨酸(〔3-3H〕-Tyr)〔5-3H〕-酪氨酸(〔5-3H〕-Tyr)，〔3，5-di3H〕-酪氨酸(〔3，5-di3H〕-Tyr)。
〔125I〕-Tyr-〔5-125I〕-碘酪氨酸(〔5-125I〕-Tyr)，〔3-125I〕-碘酪氨酸(〔3-125I〕-Tyr)，〔3，5-di125I〕-二碘酪氨酸(〔3，5-di125I〕-Tyr)，〔131I〕-Tyr-〔3-131I〕-酪氨酸(〔3-131I〕-Tyr)，〔5-131I〕-酪氨酸(〔5-131I〕-Tyr)，〔3，5-di131I〕-酪氨酸(〔3，5-di131I〕-Tyr)3，5-diI-Tyr-3，5-二碘酪氨酸YMeGlu-D-谷氨酸γ甲酯NMephe-N-甲基苯丙氨酸NMepgl-N-甲基苯基甘氨酸Npa-β-(萘基)丙氨酸Dhpγo-3，4-二羟脯氨酸pNO2Phe-对-硝基-苯丙氨酸pCphe-对-氯-苯丙氨酸Nle-正亮氨酸Orn-乌氨酸Pip-2-
啶酸酯pba-对-氨基苯基丁酸PSubphe-对-取代的苯丙氨酸Pgl苯基甘氨酸Sar-肌氨酸(N-甲基甘氨酸)Subphe-邻、间或对-单或双取代的苯丙氨酸Tha-β-(2-噻吩)-丙氨酸
Tig-四氢异喹啉3-羧酸酯氨基和羧基末端酸取代基Ac-乙酰基Azt-氮杂环丁烷-2-羧酸酯Ciu-肉桂酰DhCin-3，4-二氢肉桂酰Glt-戊二酰Mal-马来酰基Oac-8-氨基辛酸Oct-正辛基Suc-琥珀酰基Tfa-三氟乙酰基＃-C-末端酰胺下面显示了已知的天然存在的水蛭素氨基酸变异物的序列1 5 10 15Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys LeuIle Thr
20 25 30Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn Lys Cys Ile LeuLys35 40 45Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly ThrAsn Lys GlyGln Asp
50 55 60Pro Lys Pro Gln Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile ProAsn Glu AsnGln65Glu Glu Tyr Leu GlnAspAsp Glu(Ala63Tyr64Leu/Asp65Glu66)除甘氨酸外，所有天然氨基酸都含有一个手性碳原子。除非另有特别说明，本文中所指的光学活性氨基酸均具有L-构型。例如，A1或A10组的任何氨基酸可为D-构型或L-构型。按照习惯写法，本文中的肽结构中氨基末端位于链的左边而羧基末端位于链的右边。
烷基和烷氧基的烷基部分包括直链烷基、支链烷基或环烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、仲戊基、环戊基、己基、异己基、环己基和环戊基-甲基、庚基、辛基(Oct)、8-氨基辛酸(Oac)，C2-10酰基包括每一基团含有1个或2个羰基的直链、支链、环状、饱和及未饱和的酰基，例如乙酰基(Ac)、氮杂环丁烷-2-羧酸酯(Azt)、苯甲酰基、琥珀酰基、肉桂酰基(Cin)、DhCin、马来酰基(Mal)及戊二酰基(Glt)烷基和酰基取代基包括带有卤素取代基的基团，卤素基团为氟、氯、溴或碘，例如，三氟乙酰基(Tfa)。
这里所用的术语“任何氨基酸”并不打算包括具有氨基取代基的羧酸，而是象肽衍生物领域的熟练技术人员所通常使用的那样，并且包括天然存在的氨基酸以及当制备合成天然肽类似物时肽化学领域人员通常使用的其它“非蛋白质”α-氨基酸。天然存在的氨基酸为L-氨基酸”甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、组氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、乌氨酸和赖氨酸。“任何氨基酸”也包括天然存在氨基酸的D-氨基酸(D-异构体)，D-丙氨酸、D-缬氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-丝氨酸、D-蛋氨酸、D-苏氨酸、D-苯丙氨酸、D-酪氨酸、D-色氨酸、D-半胱氨酸、D-脯氨酸、D-组氨酸、D-天冬氨酸、D-天冬酰胺、D-谷氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸，还包括“非蛋白质”α-氨基酸，如正亮氨酸、正缬氨酸、别异亮氨酸、高精氨酸、硫代脯氨酸、二氢脯氨酸、羟脯氨酸(Hyp)、高丝氨酸、环己基甘氨酸(Chg)、α-氨基-正丁酸(Aba)、环己基丙氨酸(Cha)、氨基苯基丁酸(Pba)、邻、间或对位被单取代或双取代的苯丙氨酸(如对位被取代的苯丙氨酸(Psubphe)和对一氯-苯丙氨酸及对-硝基苯丙氨酸(pNPhe))或苯基位置带有(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、卤素或硝基的一个或二个的苯丙氨酸或被亚甲二氧基取代的苯丙氨酸、β-2-和3-噻吩基-丙氨酸、β-2-和3-呋喃丙氨酸、β-2、β-3-和β-4-吡啶丙氨酸、β-(苯并噻吩-2-和3-基)丙氨酸、β-(1-和2-萘基)丙氨酸(Npa)、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的0-烷基化衍生物、谷氨酸甲酯和天冬氨酸甲酯、S-烷基化半胱氨酸、酪氨酸的0-磺酸酯、及卤化的酪氨酸，如3-碘酪氨酸、5-碘酪氨酸、3，5-二碘酪氨酸。
术语“放射性标记的氨基酸”包括3-〔3H〕-酪氨酸、5-〔3H〕-酪氨酸、3-〔I125〕-碘酪氨酸、5-〔I125〕-碘酪氨酸、3，5-〔I125〕-二碘酪氨酸、3-〔I131〕-碘酪氨酸、5-〔I131〕-碘酪氨酸及3，5-〔I131〕-二碘酪氨酸。术语“水蛭素及其天然变异物的序列”是指发现的天然来源的水蛭素的氨基酸序列。
当提到水蛭素及其变异物时所用的术语“及其部分”包括得自水蛭素或其变异物的至少4个氨基酸的连续区域。
术语“亲脂性氨基酸”包括Tyr、Phe、Leu、Met、Nle、Ile、Val和Pro，术语“L-芳香族氨基酸”包括酪氨酸和苯丙氨酸，以及那些含有芳环的氨基酸。
术语“含有1-11个任何氨基酸残基的肽”是指将氨基酸加到组成核心结构的核心氨基酸(A2-A9)的氨基或羧基末端并保持其固有活性。
“I-Tyr、〔3H〕-Tyr、〔131I〕-Tyr、〔125I〕-Tyr的0-5个残基“指包括含有单个、多个或与其它氨基酸结合的I-Tyr、〔3H〕-Tyr、〔125I〕-Tyr或〔131I〕-Tyr的任何氨基酸的1-5个残基的序列。还包括I-Tyr、〔3H〕-Tyr和〔125I〕-Tyr、〔131I〕-Tyr的相应位置类似物，如3-碘酪氨酸、5-碘酪氨酸、3，5-二碘酪氨酸、〔3-3H〕-酪氨酸、〔5-3H〕-酪氨酸、〔3-125I〕-碘酪氨酸、〔5-125I〕-碘酪氨酸、〔3，5-di125I〕-二碘酪氨酸、〔3-131I〕-酪氨酸、〔5-131I〕-酪氨酸及〔3，5-di131I〕-酪氨酸，含有单个、多个或与其它氨基酸结合的I-Tyr、〔3H〕-Tyr、〔125I〕-Tyr或〔131I〕-Tyr的任何氨基酸中的1-5个残基的序列的例子为SucI-TyrI-Tyr Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Cha YMeGln(实施例3)或在I-Tyr二肽之前、之间或之后插入氨基酸或其任意组合。
按照本发明，可与水蛭素结合的放射性标记的分子的其它例子包括放射性卤化的分子。用于诊断成像的放射卤素包括但不限于通过用γ照像机对患者扫描而成像的125I及123I，或用于正电子断层成像的18F、75Br或76Br。
式Ⅰ的多肽可与任何无毒性的有机或无机酸形成可作药用的盐。形成合适盐的无机酸的例子包括盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸以及酸性金属盐，如磷酸-氢钠和硫酸氢钾。形成合适盐的有机酸的例子包括单、双和三羧酸，这些酸如乙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、羟基马来酸、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯基乙酸、肉桂酸、水杨酸、2-苯氧苯甲酸和磺酸，如甲磺酸、2-羟乙磺酸。羧基末端氨基酸残基的盐包括与任何合适的无机或有机碱形成的无毒羧酸盐，这些盐的典型例子包括碱金属，如钠和钾的盐;碱土金属如钙和镁的盐;ⅢA族轻金属包括铝的盐;以及有机伯、仲和叔胺，如三烷基胺(包括三乙胺)、普鲁卡因、二 基胺、1-乙胺、N，N′-二 基乙二胺、二氢枞酸基胺、N-(低级)烷基 啶及任何其它合适的胺。
某些化合物为优选的化合物，申请人优选的式Ⅰ肽的衍生物，其中
X为氢、乙酰基或琥珀酰基;
A1为水蛭素或其天然变异物的序列，包括氨基酸1-54或其区间;或为一键;
A2为I-Tyr、〔3H〕-Tyr、〔125I〕-Tyr、〔131I〕-Tyr的1-5个残基，或Trp、Glu、His、Leu、Phe、D-phe、Snbphe、NMephe、Tha、3，4-Dhcin、Cin、Nap、β-(2-和3-噻吩基)丙氨酸、β-(2-和3-呋喃)丙氨酸、β-(2-，3-和4-吡啶)丙氨酸、β-(苯并噻吩基-2-和3-基)丙氨酸或β-(1-和2-萘基)丙氨酸;
A3为Glu，Ala;
A4为Gju，Asp，Pro或Ala，Azt或Pip;
A5为Ile，Lcu;
A6为Pro，Sar，D-Ala，Hyp或NMepgl;
A7为Glu，Gln，Asp，或Ala;
A8为Glu，Asp，或Ala;
A9为I-yr，〔3H〕-Tyr，〔125I〕-Tyr，〔131I〕-Tyr，或Tyr，Ala，Pro，Cha，或二肽Ala-TyrTyr-Leu，Ala-Phe，Tyr-Tyr，Ala-Leu，Tyr-Ala，Glu-Leu，D-Tyr-Leu，Leu-Phe，Sar-Cha，Pro-Cha，Cha-Leu，Ala-Cha，Tyr-Cha;
A10为一键，或YMeGlu，Glu，D-Glu，Asn，D-Asn，Pro，Gln，Ala，Lys，D-Lys，Asp，Orn，Asp，或为Ala;
Y为选自OH、(C1-C8)烷氧基、氨基、单或双(C1-C4)烷基取代的氨基酸的羧基末端残基。
尤其优选的式Ⅰ肽衍生物为其中X为琥珀酰基;
A1为一键，A2为I-Tyr，〔3H〕-Tyr，〔125I〕-Tyr或〔131I〕-Tyr;
A3为Glu，A4为Glu或Pro;
A5为Ile;
A6为Pro;
A7为Glu，A8为Glu或Asp;
A9为Ala-Cha;
A10为YMeGlu，Y为OH，合成本发明的蛋白质可采用本领域熟练技术人员所熟知的多种方法来制备。这些方法包括液相肽合成法，固相序列和单元合成法、基因克隆以及这些技术的结合法。固相序列可使用已建立起来的自动化方法(使用自动化肽合成仪)来完成。在这一方法中，肽是从C-末端被保护的氨基酸开始在树脂上构建，所使用的树脂支持物可以是固相多肽制备领域所通常使用的任何合适树脂，仇选的是已被约0.5-3%二乙烯基苯交联的聚苯乙烯，它已被氯-甲基化或羟甲基化以提供与首先加入的α-氨基被保护的氨基酸形成酯的位点。对于C-末端酰胺，可使用对-甲基苄基羟胺树脂。在序列偶联完成后，BOC保护基被留在原处或保护基被除去并进行了N-末端氨基酰化。使用合适的氨基醇可从树脂上置换出被保护的片段。
一个羟甲基树脂的例子已由Bodanszky等在Chem.Ind.(London)38，1597-98(1966)上加以叙述。氯甲基化树脂可从Bio Rad Lakoratouies，Richmond，Calikonnia购买到，这种树脂的制备过程已由Stewtut等加以叙述(“Solid Phase Peptide Synthcsis”(Fneeman Co，San Franlisco 1969)，Chaptes1PP.1-6)，被保护的氨基酸可用Gisin的方法结合到树脂上(Helv.Chem.Acta，S6，1476(1973))。许多与树脂结合的被保护的氨基酸可从商业上得到。例如，为了制备其中羧基末端为YMeGlu残基的本发明的多肽，就可使用结合到
基化的、羟甲基化的苯基乙酰氨基甲基(PAM)树脂上的被叔丁氧羰基(Boc)保护的YMeGlu。
α-氨基被保护的氨基酸与树脂支持物偶联之后，可使用合适的方法除去保护基，例如使用溶于二氯甲烷的三氟乙酸、单独的三氟乙酸或溶于二噁烷的Hcl。去保护是在0℃至室温的温度条件下进行。还可以使用其它的标准裂解试剂及除去特定α-氨基保护基的条件。在除去α-氨基保护基之后，就可将其它的氨基被保护的氨基酸按所需次序逐步偶联。或者，在与树脂支持的氨基酸序列偶联之前通过溶液法将多个氨基酸偶联。
被加入到多肽序列中去的每一氨基酸利用的α-氨基保护基可以是本领域已知的任何保护基。α-氨基保护基的主要类型有(1)酰基型保护基，如甲酰基、三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、甲苯磺酰基(tosyl)、苯磺酰基、硝基苯磺酰基、三苯甲基磺酰基、邻-硝基苯氧乙酰基和α-氯丁酰基;(2)芳香族尿烷型保护基，如
氧羰基和取代的苄氧羰基如对-氯苄氧羰基、对-硝基苄氧羰基、对-溴苄氧羰基、对-甲氧基苄氧羰基、1-(对-二苯基)-1-甲基乙氧羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧基苄氧羰基及二苯甲氧羰基(3)脂族尿烷保护基，如叔丁氧羰基(BOC)、二异丙基甲氧羰基、异丙氧羰基、乙氧羰基和烯丙氧羰基;(4)环烷基尿烷型保护基，如环戊氧羰基、金刚烷氧羰基和环己氧羰基;(5)硫代尿烷型保护基，如苯硫羰基;(6)烷基型保护基，如三苯基甲基(trityl)和苄基;优选的α-氨基保护基为叔丁氧羰基。
已知在固相肽合成法中许多氨基酸带有在链的制备过程中需要保护的官能团。使用和选择合适的保护基是在本领域熟练技术人员的能力范围之内，并且它取决于所要保护的氨基酸以及位于肽上的其它被保护氨基酸的存在。这种侧链保护基的选择很关键，它必须是那些在α-氨基残基的保护基的裂解过程中不被除去的保护基。例如，赖氨酸的合适侧链保护基为苄氧羰基和取代的苄氧羰基，所说的取代基选自卤素(如氯、溴、氟)和硝基(如α-氯苄氧羰基、对-硝基苄氧羰基、3，4-二氯苄氧羰基)、甲苯磺酰基、叔戊氧羰基、叔丁氧羰基和二异丙基甲氧羰基。苏氨酸和丝氨酸的醇羟基可被乙酰基、苯甲酰基、叔丁基、三苯甲基、苄基、2，6-二氯苄基或苄氧羰基保护。优选的保护基为苄基。
选择合适的偶联剂也在本领域的技能范围之内。所加氨基酸为Gln、Asn或Arg的尤其合适的偶联剂为N，N′-二异丙基碳化二亚胺和1-羟基苯并三唑。使用这些试剂防止了腈和内酰胺的形成。其它的偶联剂为(1)碳化二亚胺(如N，N′-二环己基碳化二亚胺和N-乙基-N′-(Y-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺);(2)氨基腈(如N，N′-二苄基氨基腈);(3)乙烯酮亚胺;(4)异噁唑鎓盐(如N-乙基-5-苯基-异噁唑鎓-3′-磺酸盐;(5)在其环上含有1-4个氮原子的芳香族单环杂环酰胺，如咪唑酰胺、吡唑酰胺和1，2，4-三唑酰胺，可利用的具体杂环酰胺包括N，N′-羰基二咪唑和N，N-羰基-二-1，2，4-三唑;(6)烷氧化的乙炔(如乙氧乙炔);(7)与氨基酸的羧基基团形成混合酐的试剂(如氯甲酸乙酯和氯甲酸异丁酯)或形成偶联氨基酸的对称酐的试剂(如BOC-Ala-O-Ala-Boc);(8)在一个环氮原子上带有羟基的含氮杂环化合物(如N-羟基邻苯二甲酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和1-羟基苯并三唑);(9)Castro氏试剂(BOP)。其它活化剂及其在肽偶联中的应用已由Kapoor等加以叙述(J.Pham.Sci.59，PP1-27(1970))。申请人优先选用对称酐作为除Arg、Asn和Gln外的所有氨基酸的偶联剂。
每种被保护的氨基酸或氨基酸序列是以4倍的过量加到固相反应器中，并且偶联是在二甲基甲酰胺∶二氯甲烷(1∶1)介质、单独的二甲基甲酰胺介质或单独的二氯甲烷介质中进行。优选在单独的二氯甲烷介质中进行。当发生不完全偶联时，可在固相反应器中的下一个氨基酸偶联之前，于除去α-氨基保护基之前重复偶联步骤。合成过程中每一步骤的偶联反应的成功可通过水合茚三酮反应进行监测(见EKaiser等，Analyt.Biochem.34，595(1970)〕α-氨基被保护的氨基酸偶联至树脂支持物后，可使用任何合适的步骤除去保护基，如使用溶于二氯甲烷的三氟乙酸、单独使用三氟乙酸或使用溶于二噁烷的HCl。去保护是在0℃至室温的温度条件下进行。其它标准裂解剂和除去特定α-氨基保护基的条件也可被使用。除去α-氨基保护基之后，按所需次序将其它氨基被保护的氨基酸依次偶联。或者，在与树脂支持的氨基酸序列偶联之前将多个氨基酸基团通过溶液法进行偶联。
在得到所需的氨基酸序列后，从树脂支持物上取出肽并脱去保护。这一步骤可通过水解来完成，例如在清除剂(如苯甲醚)存在的情况下用无水液体HF处理与树脂结合的多肽。通常是在肽链合成之后除去保护基，但也可在任何其它合适的时候除去保护基。
可使用多种标准方法对去保护的肽进行纯化和分析。选择适当的纯化和分析方法是在本技术领域的技能范围之内。制备HPLC是一合适的纯化方法。可通过分析性HPLC、氨基酸分析法、快速原子轰击质谱分析及任何其它合适的分析方法对已被纯化的多肽进行分析。
放射性标记的肽本发明的放射性标记的肽可在研究和治疗中用于凝血酶和凝血酶复合物的体外和体内检测，或者是用于其检测或诊断药盒中，以制备放射性标记凝血酶结合剂。本发明的一个实施方案是对结合凝血酶的肽进行放射性标记，该肽减少或消除了用于维持该复合物稳定的凝血酶的血栓溶解活性。其实例是血栓加入到凝血块的放射成像、标记的水蛭素肽与凝血碱结合后就能够通过放射成像技术测定血栓的位置和分布。
通常使用氯胺T法对肽进行放射性碘化。标记肽的其它方法包括(1)一氯化碘法;(2)交替化学氧化法;(3)电解碘化法;(4)酶促碘化法，或者(5)本领域技术人员所熟知的用于蛋白质和多肽碘化的共轭标记法，它使用N-琥珀酰亚胺基3-(4-羟基5-〔125I〕碘苯基)丙酸酯(Bolton-Huntes试剂);或者其它合适的标记法，例如对-羟苄基亚氨酸甲酯盐酸盐已被用作碘化剂，如同放射性碘化的重氮化苯胺一样。使用氧化钯和氚气进行催化还原可将碘化的肽转化为含有氚的肽。
治疗应用根据患者情况、被治疗的血栓病态程度以及所选择的肽衍生物，本发明的肽衍生物的抗凝血剂量为0.2-250mg/患者体重kg/天。对一具体患者所用的合适剂量可被很容易地确定。优选每天服用1-4次剂量，每一剂量中通常含有5-100mg活性化合物，抑制或防止体外介质如贮存的全血中血液凝结所需要的本发明肽的量可被本领域熟练技术人员很容易地测得。
已证明抗凝血剂疗法可用于治疗和预防各种血栓疾病，尤其是冠状动脉疾病和脑血管疾病。进行过这一领域实验的人都能很容易地意识到需要抗凝血剂疗法的情况。这里所用的术语“患者”意指哺乳动物，如灵长类，包括人、羊、马、牛、猪、狗、猫、大鼠和小鼠。抑制血液凝结不仅可用于患血栓病的患者的抗凝血剂疗法，而且还可用于其它任何需要抑制血液凝结的地方，例如防止贮存的全血的凝结和防止用于试验或贮存的其它生物样品中的凝结。
尽管通过口服并经内脏后某些肽衍生物仍然存在，但申请人仍优选非口服方式给药，如皮下注射、静脉注射、肌肉注射或腹膜内注射;制备移植物;或以气溶胶的形式施用于鼻、喉和支气管的粘膜上，该气溶胶中含有以喷雾剂或干粉形式存在的本发明的肽衍生物。
对于非肠道给药，该化合物可以其在可作药用的稀释剂中的溶液或悬浮液的可注射剂量给药，它含有药物载体，如水和油等无菌液体，并加有或未加表面活性剂和其它可作药用的辅助剂。可用于这些制剂中的油的例子有石油、动物油、植物油或合成油，如花生油、豆油和矿物油。一般来说，水、盐水、水溶性葡萄糖和相关的糖溶液、乙醇及丙二醇或聚乙二醇等甘醇是优选的液体载体，尤其适用于可注射溶液。
该化合物可以储存注射剂或移植物制剂的形式给药，它们可按让活性成分持续释放的形式配制。可将活性成分压缩成丸剂或小圆柱体并作为储存注射剂或移植物移植于皮下或肌肉内。移植物可使用生物降解聚合物或合成硅氧烷等惰性材料，如Dow-Corning Corporation公司生产的硅橡胶。
通过下面的非限定实施例演示本发明。
实施例1Suc3，5-diI-Tyr Glu Pro ILe Pro Glu Glu Ala Cha D-Glu的合成。
使用ABI 430A肽合成仪通过固相法可合成Suc3，5-diI-Tyr Glu Pro ILe Pro Glu Glu Ala Cha D-Glu。使用ABI所提供的双偶联方案将所得的Nα-Boc保护的氨基酸的对称酐依次加到Boc-glu(Bzl)Merrifield树脂(0.34meg/gm)上。使用下列侧链保护3，5-diI-Tyr(3-Br-Bzl);Glu(Bzl)。与树脂结合的肽的N-末端的琥珀酰化可使用琥珀酐来完成。
在苯甲醚存在的情况下用无水HF在0℃处理30分钟可将肽从树脂上裂解。用5%HoAc、30%CH，CN萃取肽，并冷冻干燥。通过逆相HPLC对冻干物进行纯化，所用的层析柱为Beckman Ultraprep C-18(50.8×150mm)，流速为80ml/min，其梯度为30-40%CH，CN/水溶性TFA。
用Na〔125I〕可进行水蛭素肽的直接碘化。存在于0.5M磷酸钠(PH7.5)中的50ug水蛭素肽(2mg/ml)一般通过加入10ul氯胺T(1.25mg/ml，存在于0.5M磷酸盐缓冲液中)来进行碘化。该反应可在24℃进行30秒钟。然后加入25ul偏亚硫酸氢钠(1.25mg/ml，存在于0.5M磷酸盐缓冲液中)以终止反应。将碘化反应立即应用到被0.1M硼酸钠缓冲液(PH8.5)平衡过的Bio-Gel P-2柱上(2.6×50cm)。将约85%的〔125I〕分子转移到通过柱层析进行测定的蛋白质中。然后立即将标记的水蛭素肽加到1%牛血清白蛋白、0.1M硼酸钠缓冲液(1∶1)中，并分装在多个小瓶中于-20℃保存。将标记水蛭素的新鲜融化样品用于每次实验。保存之后标记的水蛭素肽在TKS-3000HPLC柱上进行重层析时产生一个放射性的单峰，它与未标记自水蛭素肽的洗脱分布型相符。
通过催化还原将水蛭素的肽氚化。将15mg肽悬浮在2mlH2O和30ul三乙胺中，向其中加入30ug氧化铂铝，在室温下进行空气还原1小时。在过滤器上用H2O冲洗起始反应物，以除去末加入的标记物，再分离所产生的粗物质(见Pupont-NEN Kesearch Catalog P22，Cat。＃8259，Catalgtui Keduition ioith platium oxide)。
通过对纯化的标记肽进行分析产生了通过FAB-MS得到的所需分子的离子峰，并按照所需肽进行氨基酸分析。在这方面，下面的肽具有如下所述的物理性质。
在凝血酶诱导的血纤维蛋白凝血块抑制检测中对样品进行试验，所有的检测溶液均用含有0.12M氯化钠、0.01M磷酸钠、0.01%叠氮化钠及0.1%牛血清白蛋白的检测缓冲液(PH7.4)制备。将牛凝血酶滴定至合适浓度，以便能够在60分钟内于405nm处通过一微滴定板计数器(Bio-Tek EL 309)对血纤维蛋白凝血块的形成进行监测。将这种凝血酶的溶液(50ul，0.2Pmol)加到含有50ul被测试的合成肽的微滴定板的孔中，搅拌1分钟并于24℃再保温10分钟之后加入100ul以1∶10稀释于0.1%EDTA中的血浆，再旋转20秒，每隔5分钟通过自动计数器测定溶液的浊度。从结果中计算出IC50，并定义为导致相对于不含抑制剂的对照所观察到的浊度的50%的肽浓度。这相当于血纤维蛋白凝血块形成时间增加两倍。对于使用人或牛凝血酶的检测法中，将凝血酶滴定至在30分钟内以同样的速度产生血纤维蛋白凝血块的浓度在这方面，对于下面的具体实例下面的肽具有所述的生物学性质，“+”表示IC50在25-200uM之间;“++”表示IC50＜25uM，“nt”表示末测到。
1).Suc3，5-diI-Tyr Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Cha D-GluMW1582FAB-MS(MH)+1581氨基酸分析Z(4) Pro(2) Ile(1) Tyr(1)4.09 1.96 0.96 0.98Ala(1)0.99体外效价++(2)Suc〔3H〕-Tyr Glu Pro ILe Pro Glu Glu Ala Cha D-GluMW 1995 FAB-Ms(MH)+1996.3标记和分析缩小到NEN体外效价nt(3)Suc 3.5-diI-Tyr3.5-diI-Tyr Glu Pro Ile Pro Glu Glu Ala Cha D-GluMW1995FAB-MS(MH)+1996.3氨基酸分析Z(4) Pro(2) Ile(1) Tyr(2) Ala(1)4.09 1.96 0.96 1.95 0.99体外效价++
权利要求
1.下式所示的放射性标记的肽衍生物或其可作药用的盐的制备方法X-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-Y其中X为选自氢原子、1-2个C1-10烷基、1-2个C2-10酰基、苄氧羰基或叔丁氧基的氨基末端氨基酸；A1为水蛭素或其天然变异物序列或其一部分、一键、或为含有1-11个任何氨基酸残基的肽；A2为I-Tyr、[3I]-Tyr、[[125I]-Tyr，131I]-Tyr的0-5个残基、或者如果A，含有放射性标记的氨基酸则为L-芳香族氨基酸；A3为Glu，Asp，Ala；A4为任何氨基酸；A5为Ile，Val，Leu，Nle，Ala，D-Leu或Phe；A6为Pro，Hyp，Azt，Pip，Dhpro，噻唑烷-4-羧酸酯，Sar，NMepgl或D-Ala；A7为任何氨基酸；A8为任何氨基酸；A9为选自Tyr、I-Tyr、[125I]-Tyr、[131I]-Tyr、[3H]-Tyr、Met、Trp、Phe、Leu、Nle、Ile、Val、Cha、His、Ala和Pro的亲脂性氨基酸，或为含有以上氨基酸或任何亲脂性氨基酸中至少一个氨基酸的二肽；A10为水蛭素、其天然变异物的序列或其一部分、一键、或为含有1-11任何氨基酸残基的肽；Y为选自OH、(C1-C8)烷氧基、氨基、单或双(C1-C4)烷基取代的氨基酸的羧基末端残基，或者一醇末端残基；该方法包括以下步骤a)使用一种适当结合了一个其C-末端被保护的A10组氨基酸的树脂；b)依次偶联α-氨基被保护的A9至A1氨基酸以达到被保护的所要求氨基酸序列；c)除去所说的保护基，并纯化所需肽；d)用放射性卤素标记该肽，并纯化标记肽。
2.如权利要求1所述的肽衍生物的制备方法，其中A2为I-Tyr、〔3H)-Tyr、或(125I〕-Tyr。
3.如权利要求1所述的肽衍生物的制备方法，其中A3为Glu。
4.如权利要求1所述的肽衍生物的制备方法，其中A4为Pro。
5.如权利要求1所述的肽衍生物的制备方法，其中A5为Ile。
6.如权利要求1所述的肽衍生物的制备方法，其中A6为Pro。
7.如权利要求1所述的肽衍生物的制备方法，其中A7为Glu。
8.如权利要求1所述的肽衍生物的制备方法，其中A8为Glu。
9.如权利要求1所述的肽衍生物的制备方法，其中A9为Ala-Cha
10.如权利要求1所述的肽衍生物的制备方法，其中A10为D-Glu。
11.如权利要求1所述的肽衍生物的制备方法，其中X为H。
12.如权利要求1所述的肽衍生物的制备方法，其中A9为I-Tyr，〔3H〕-Tyr，〔125I〕-Tyr，〔131I〕Tyr。
13.一种减少需要治疗的患者中血液凝结的方法，它包括服用抗凝血有效量的权利要求1-12之一的肽衍生物及其可作药用的载体。
14.一种减少介质中血液凝结的方法，它包括将该介质与抗血液凝结有效量的权利要求1-12之一的肽接触。
15.一种用于诊断成像的检测体内凝血酶及检测权利要求1-12之一的标记的水蛭素肽在患者体内的生物分布方式的方法。
16.使用权利要求1-12之一的标记水蛭素肽测定血液、组织或样品中可得到凝血酶水平的检测体外凝血碱的药盒检测或诊断法。
全文摘要
本发明涉及被碘化的抗凝血肽衍生物的应用。
文档编号G01N33/60GK1050721SQ9010805
公开日1991年4月17日 申请日期1990年9月30日 优先权日1989年10月3日
发明者约翰·L·卡斯特南凯, 西蒙·J·T·毛 申请人:默里尔多药物公司