检测和诊断流感病毒的筛选方法

专利名称：检测和诊断流感病毒的筛选方法
1．发明领域本发明涉及筛选方法和试剂盒，以及用所述筛选方法和试剂盒检测和诊断流过病毒感染的方法。具体地讲，本发明涉及以用于检测流感神经氨酸酶的快速、特异性的检测系统为基础，用于检测和诊断流感病毒感染的筛选方法。本发明还包括以流感神经氨酸酶的种特异性检测为基础的用于诊断流感病毒感染的试剂盒。此外，本发明涉及快速、特异性的高通量检测系统以筛选与流感病毒神经氨酸酶相互作用并可用作抗病毒药物的试剂。
2．发明背景2．1流感病毒感染流感病毒感染是一种世界性的重要临床疾病。对流感已有数个世纪的了解，它是一种周期性发生的流行病，开始得很快，传播迅速，而且经常是世界性的。事实上，在历史上，流感曾引起最大的瘟疫之一；在1917至1918年间，约2千万人死于流感感染。尽管流行病是周期性发生的，但流感每年都爆发。仅在美国，每年约4千万人会受到流感的感染。在这些个体中，约15万人入院治疗，而1万至4万人死于流感或与流感有关的并发症(Welch，S1988，Gilead’s OralInfluenza Drug Proves Positive in Phase Ⅲ，BioWorld Today9∶1，3)。在美国，每年因流感病毒引起的治疗费用、生产力损失以及工资达约100亿美元。
流感是一种与全身症状有关的急性呼吸性疾病。这种疾病起因于由流感病毒感染引起的上呼吸道细胞层、气管和支气管的破坏、流感病毒进入鼻咽，随后扩散到表达特异性粘蛋白受体的细胞中。尽管病毒必须通过呼吸分泌物，呼吸分泌物含有病毒颗粒可结合的粘蛋白，但并不会阻断感染，因为病毒神经氨酸酶可水解粘蛋白，使其成为无效的抑制剂。
急性流感病毒感染导致病毒复制，随后被感染的细胞坏死以及呼吸道上皮大范围脱落。这直接引起与急性感染有关的呼吸症状。与急性流感病毒感染有关的全身症状包括发烧、寒战、全身性疼痛、头痛、虚脱和食欲缺乏。通常，因流感病毒感染引起的疾病是自限性的，持续3-7天。继发细菌感染(例如，金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌和β溶血性链球菌)造成大部分因流感引起的死亡。仅因流感病毒感染引起的死亡很少见。2．2流感病毒流感病毒是被膜病毒，含反义成片断的单链RNA基因组。流感病毒是正粘病毒科的成员。根据其核壳和M蛋白质抗原，将流感病毒进一步分成三型(属)，流感病毒A、B和C。A和B型流感病毒的新变体不断出现，根据免疫独特表面抗原、血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)糖蛋白的表达，将其分成亚型(种)。这两种表面抗原的抗原变异是由抗原性漂移引起的。有两种截然不同形式的抗原性漂移小抗原性漂移和主要抗原性漂移。小抗原性漂移反映了因病毒的HA和NA基因突变而引起的改变。主要抗原性漂移产生于流感病毒的人与动物株之间的重组(即基因重新配对)。因此，在混合感染过程中，病毒可以重新配对基因并产生世界上大部分人无免疫力的新病毒种。
流感病毒粒子由一个含单链RNA基因组的内核糖核蛋白核心(螺旋核壳)和一个内层有基质蛋白(M)的外层脂蛋白被膜组成。A和B型流感病毒的成片段基因组由编码10个多肽的8个线性、负极性单链RNA组成(C型流感病毒是7个)，所述多肽包括形成核壳的RNA指导的RNA聚合酶蛋白质(PB2、PB1和PA)和核蛋白(NP)；基质蛋白(M1，M2)；核外输蛋白；从脂蛋白被膜伸出的两个表面糖蛋白(HA)和神经氨酸酶(NA)；和一个非结构蛋白(NS1)。在下表Ⅰ中总结了流感病毒的基因和其蛋白质产物。
表Ⅰ流感病毒基因组RNA片段和编码安排a片段 长度b编码的 长度d每个病毒备注(核苷酸) 多肽c(氨基酸) 粒子的分子12341 PB2 759 30-60 RNA反转录酶组分；宿主细胞RNA帽结合22341 PB1 757 30-60 RNA反转录酶组分；反转录的开始；核酸内切酶活性 32233 PA 716 30-60 RNA反转录酶组分；mRNA链的延长 41778 HA 566 500 凝素；三聚体；被膜糖蛋白；介导与细胞的粘附51565 NP 498 1000 核蛋白；与RNA有关；RNA反转录酶的结构组分61413 NA 454 100 神经氨酸酶；四聚体；被膜糖蛋白71027 M1252 3000 基质蛋白；被膜的内层M296 质膜中的结构蛋白；剪接的mRNA8890 NS1230 非结构蛋白NEP 121 核外输蛋白a 改编自R.A.Lamb and P.W.Choppin(1983)，转载自AnnualReview of Biochemistry，Volume 52，467-506b A/PR/8/34株的c 由生物化学和遗传方法确定的
d 由核苷酸序列分析和蛋白质测序确定的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)是流感病毒表达的两种主要表面糖蛋白。HA介导病毒粒子与宿主细胞的粘附，这是病毒感染的第一步，通过与糖缀合物中的末端唾液酸残基结合而实现的。与HA活性相反，NA催化除去与糖蛋白和糖脂连接的末端唾液酸。NA在感染过程中的作用尚不清楚。据推测，NA活性用于通过消化HA受体中的唾液酸，从感染的细胞中释放刚形成的病毒。此外，NA可以促进病毒通过呼吸道粘膜的运动，由此增强病毒的感染力。
对于A型流感病毒株而言，已根据其血清学特性将其分成9个亚型。B型流感病毒没有任何亚型。A和B型流感病毒的NA仅有30％的氨基酸序列同源性(Kim，C.H.等人，1997，Journal of the AmericanChemical Society 119∶681)。但是，不同株之间的NA酶活性是相同的，这表明了该酶活性位点的高度保守性。NA分子形成以盒状头部区为顶的细长茎组成的四聚突起。已确定了三种流感病毒亚型A/Tokyo，A/Tern和B/Beijing的NA的X射线结晶结构(Varghese，J.H.and Coleman，P.M1991，Journal of Molecular Biology221∶473；Bossart-Whitaker，P.等，1993，Journal of MolecularBiology 232∶1069；Burmeister，W.P.等，1992，EMBO Journal11∶49)。结构研究表明NA由6个四链反向平行的β片层的对称折叠图形组成，所述片层象螺旋桨的浆片那样排列。结晶学研究揭示出在所有检测过的流感病毒株中，在活性位点中结合囊壁内层和周围的氨基酸是高度保守的。
尽管许多研究工作集中于发现流感病毒神经氨酸酶的抑制剂(yon Itzstein，M.等，1993，Nature 363∶418-423；Kim，C.H.等，1997，Journal of the American Chemical Society 119∶681-690；Bischofberger，N.等，美国专利5763483；Kim等人，美国专利5512596；Kim等人，国际专利申请Wo 98/17647；Bischofberger，N.等，国际专利申请W 96/26933；Colman，P.等人，国际专利申请WO 92/06691；Luo，M等人美国专利5453533)，但是，仍没有一种有效的神经氨酸酶抑制剂可用于治疗流感。事实上，目前尚没有有效的药物可用于治疗流感。目前，治疗流感病毒感染的唯一方法是通过接种进行预防。但是，开发一种有效的疫苗需要正确预测下次“流感暴发”特有的流感病毒株。因此，仍然需要可有效抑制流感病毒感染的药物。
2．3 现有的可用于诊断流感病毒感染的方法现在有许多方法可用于临床诊断流感病毒感染。传统上，通过用生物样品接种细胞培养物，然后用血凝素抑制、ELISA或者免疫荧光检测来评估病毒的存在来检测流感病毒。尽管这种方法是高度灵敏和特异性的，但是培养、分离以及鉴定所需的时间为2-10天。由于流感病毒感染一般是自限的，因此，这种方法对于诊断没有用处。
流感病毒感染可通过免疫学方法检测和诊断，所述方法可检测是否存在病毒特异性抗体或病毒特异性抗原。目前有许多免疫学技术可用于检测病毒特异性抗体和病毒特异性抗原，包括ELISA(酶联免疫吸附检测)、固态放射性免疫检测和免疫荧光检测。以检测病毒特异性抗体为基础的流感病毒感染的临床诊断需要提高抗体滴度，因为在感染时，大多数个体已具有了抗流感病毒的抗体。另一方面，利用免疫学方法检测病毒特异性抗原取决于识别流感病毒抗原之抗体的使用，因而，不可能检测新的病毒株。此外，用于检测流感病毒的免疫学方法实验室和具有技术专长的人员来完成检测。
还可以以神经氨酸酶的酶活性为基础检测并诊断流感病毒感染。在文献(例如，Santer，U.V.等，1978，Biochimica et Biophysica523∶435-442；Potier，M.等，1979，analytical Biochemistry94∶287-296；Yolken，R.H.等，1980，Journal of InfectiousDiseases 142∶516-523；von Itzstein，M.等，1993，Nature363∶418-423；Turner，G.等，国际专利申请WO 91/09975；Turner，G.等，国际专利申请WO 91/09972；Turner，G.等，国际专利申请WO91/10744；Turner，G.等，国际专利申请WO 91/09971；Reece，P.A.等，国际专利申请WO 97/32214；Liav，P.A．等美国专利5719020)中已描述过利用这些方法的各种检测方法。但是，由于其缺乏敏感性和/或特异性，因此，利用上述神经氨酸酶酶活性依赖的检测来诊断流感是有问题的。比色和荧光测定检测系统不灵敏，因此，不足以检测某些生物样品中的低浓度神经氨酸酶。尽管尽管荧光测定检测系统比比色检测系统更灵敏，但是，生物材料的荧光受高蛋白质水平的影响，高蛋白质水平可以弱化荧光信号。此外，多种生物体均含有神经氨酸酶，包括哺乳动物、细菌(霍乱孤菌，产气荚膜梭菌、肺炎链球菌和Arthrobacter sialophilus)和病毒(副流感病毒、腮腺炎病毒、新城疫病毒、家禽瘟疫病毒和仙台病毒)，而现有的神经氨酸酶检测法并未灵敏到可以区分这些病毒的程度。
对于个体或零星的病例来说，通过实验室检测来进行临床诊断一般太贵。另外，用于诊断流感病毒感染的试验费时并需要实验室来完成诊断。此外，尚没有可靠的治疗方法来治疗患流感感染的个体。因此，带有流感病毒的个体不得不依赖医生的揣测性诊断，而且几乎没有可靠的治疗方法。因此，需要一种可以在医生办公室完成的简单、快速和准确的诊断试剂盒用于诊断流感病毒感染。
3．发明概述本发明涉及可用于检测和诊断流感病毒感染并可用于鉴定具有抗流感病毒活性之试剂的检测方法。本发明的检测方法用流感病毒神经氨酸酶(NA)为靶，并部分以申请人设计的高度敏感和特异性的检测系统为基础，所述检测系统用于检测流感病毒NA、与流感病毒NA特异性结合的配体或化合物和/或抑制流感病毒NA酶活性的配体或化合物。所述检测可用于以高通量方式来筛选复杂组合文库中的大量化合物以鉴定候选的抗病毒药物或先导化合物，或产生可用作检测临床样品中流感病毒NA的指纹的活性图。所述检测系统可制成试剂盒的形式，所述试剂盒可由医护中心的护理人员或患者使用。
在一个实施方案中，以流感病毒NA或NA酶活性的存在作为检测临床样品中流感病毒的标志。为此，可将可检测的神经氨酸酶抑制剂(例如标记的神经氨酸酶抑制剂)与临床样品接触--可检测的神经氨酸酶抑制剂与样品的结合表明存在NA，由此表明存在流感病毒。或者，可用标记的NA底物来检测NA的酶活性，当用神经氨酸酶进行酶处理时，所述底物可产生可检测的信号。至少可采用两种方法可将样品与流感病毒NA特异性的标记底物混合--可检测信号的产生直接表明存在流感病毒NA，由此表明存在流感病毒。或者，在存在和不存在NA特异性抑制剂的条件下使用非特异性标记的底物--在该检测中可检测信号的减弱间接地表明存在流感病毒NA，由此表明存在流感病毒。
根据本发明的方法，可以评估大量不同分子的文库对复杂的生物样品中存在的潜在结合位点的结合亲和性，并产生样品显示的结合亲和性的图形，从而提供了该样品特有的指纹。在本发明的一个实施方案中，可以评估含特异性和非特异性底物和抑制剂的不同分子的文库与可能存在于生物学样品中的流感神经氨酸酶的结合亲和性，并产生结合亲和性图形以鉴定特定的流感病毒株。
在另一个实施方案中，本发明涉及鉴定新试剂与神经氨酸酶或其他病毒组分相互作用之能力的快速、特异性、高通量的筛选方法。在一个实施方案中，可通过将流感病毒神经氨酸酶与试验试剂混合并用本发明的组合筛选方法检测试验试剂的相互作用来检测可与神经氨酸酶相互作用的试剂。根据本实施方案，可通过将流感病毒神经氨酸酶的标记的特异性或非特异性底物与流感病毒神经氨酸酶和试剂混合，来检测可调节流感病毒神经氨酸酶活性的试剂。可减弱底物的酶处理的那些试剂将被认为是流感病毒神经氨酸酶活性的抑制剂。
本发明还包括通过本文所述的筛选检测方法鉴定的新试剂。本发明涉及用神经氨酸酶为介入靶的用于治疗病毒感染的治疗模式和药物组合物。本发明更具体地涉及通过靶向神经氨酸酶来治疗流感病毒感染的治疗模式和药物组合物。本发明还涉及本发明鉴定的抗病毒试剂与其他已知抗病毒剂在抑制病毒复制的组合治疗中的用途。
本发明部分基于本申请人设计的灵敏、快速、均相的检测系统，所述检测系统可以检测样品，包括但不限于复杂生物样品中的NA。本发明的均相检测系统利用不需要不同的NA检测步骤的高效检测系统。优选的检测系统是荧光偏振和化学发光。
从神经氨酸酶的角度利用实施例描述本发明，但不是为了限制本发明，本发明的组合筛选检测方法还涉及检测其他病毒蛋白质，包括血凝素、核外运蛋白、基质蛋白、核蛋白和RNA指导的RNA聚合酶蛋白质的调节剂或抑制剂以鉴定潜在的病毒感染抑制剂。
4．发明的详细描述本发明涉及基于本发明的组合筛选试验和检测方法的用于检测和诊断病毒感染的新方法，包括将高度多样化的化合物文库与生物样品接触，产生可以鉴定生物样品间存在的特定分子差异的指纹。本发明的组合筛选试验和检测方法的成功应用至少需要三种组分(1)多样化的配体文库(探针)；(2)临床样品源(对照和检测样品)；和(3)用于检测配体/受体相互作用的灵敏检测方法。可将本发明的组合筛选方法设计成用于诊断病毒感染的高度灵敏的检测方法。在另一实施方案中，将本发明的组合筛选检测方法用作灵敏的高通量筛选工具以鉴定与神经氨酸酶相互作用的新试剂，并由此鉴定用于治疗流感病毒感染的潜在药物。
本发明涉及以检测临床样品中的流感病毒神经氨酸酶为基础，用于诊断流感病毒感染的快速、特异性的检测系统和试剂盒。根据本发明，将与流感病毒神经氨酸酶特异性结合的标记底物与临床样品混合，然后通过神经氨酸酶对底物的酶处理产生可检测的信号。该检测可直接表明存在流感病毒神经氨酸酶，并由此表明存在流感病毒。或者，将标记的流感病毒神经氨酸酶非特异性底物与临床样品和一种神经氨酸酶特异性抑制剂混合。
在该检测中可检测信号的减弱间接表明存在流感病毒神经氨酸酶，并由此表明存在流感病毒。另一种检测方法通过检测标记的神经氨酸酶特异性抑制剂与流感病毒神经氨酸酶的相互作用来确定在临床样品中是否存在流感病毒。在该检测方法中，只有在临床样品中存在流感病毒神经氨酸酶时，才会产生可检测的信号。
本发明还涉及根据其与神经氨酸酶或某些其他病毒组分相互作用的能力来鉴定新试剂如药物、配体(天然的或合成的)、配体拮抗剂、肽、小有机分子等的快速、特异性的、高通量筛选检测方法。所述检测系统提供了鉴定与流感病毒神经氨酸酶相互作用的试剂以及调节流感病毒神经氨酸酶活性之试剂的方法。在本发明的检测系统中，将含待测样品的生物样品与探针文库接触，探针文库包括已知的配体即多种特异性和非特异性底物和抑制剂以及未知的配体，即待测化合物，然后将待测化合物的结合活性与已知化合物进行比较。鉴定调节流感病毒神经氨酸酶活性之新试剂的检测系统涉及筛选防止流感病毒神经氨酸酶与其底物相互作用的试剂。在本发明的另一实施方案中，可将高效的组合筛选方法用于检测神经氨酸酶酶活性的高度特异性抑制剂。通过抑制底物的酶处理而减弱可检测信号的那些试剂将被认为是流感病毒神经氨酸酶活性的抑制剂并可将其用于治疗流感病毒感染。
本发明包括含有用本文所述筛选方法鉴定之新试剂的药物组合物。本发明涉及用神经氨酸酶或某些其他病毒组分作为介入靶的用于治疗病毒感染的治疗方式和药物组合物。本发明还涉及将本发明筛选方法鉴定的抗病毒试剂与抑制病毒复制的其他已知抗病毒试剂联用。
4．1 配体/探针根据本发明的一个实施方案，当将已知的生物样品如唾液、血液、血清、组织样品、细胞、病毒、微生物或包括RNA、DNA、肽和蛋白质的小有机分子与一系列已知试剂接触，产生一组反映结合作用图的数值时，就建立了“指纹”。根据本发明的神经氨酸酶为基础的检测方法，所述多种配体文库例如可包括特异性神经氨酸酶底物、非特异性神经氨酸酶底物、特异性神经氨酸酶抑制剂、非特异性神经氨酸酶抑制剂、从各种病毒和微生物分离的神经氨酸酶样品、特异性和非特异性的神经氨酸酶抗体、或上述部分的变体。
本发明的配体或探针包括任何生物分子，包括天然的或合成的，并且可由核酸，包括DNA或RNA、小有机分子、肽、蛋白质、糖蛋白、多糖、糖或无机分子组成。
在所述检测中可用作底物的神经氨酸酶底物包括，但不限于N-乙酰神经氨酸(NANA)及其衍生物如4，7-二烷氧基-N-乙酰神经氨酸衍生物，包括是流感病毒A和B神经氨酸酶之特异性底物，但不与副流感病毒1、2、3、4病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞体病毒、腺病毒或细菌神经氨酸酶相互作用的4，7-二烷氧基Neu5Ac，在美国专利5719020(该文献全部引入本文作为参考)中所述的流感病毒A和B神经氨酸酶之非特异性底物的4-烷氧基-Neu5c；WO 91/09972(该文献全文引入本文作为参考)中所述的NANA的产色衍生物，包括4-位修饰的NANA；WO 91/10744(该文献全文引入本文作为参考)中所述的9-位修饰的NANA；WO 91/09971(该文献全文引入本文作为参考)中所述的5-位修饰的NANA；以及WO 91/09945(该文献全文引入本文作为参考)中所述的7-或8-修饰的NANA。可用于本发明检测方法的神经氨酸酶底物包括美国专利5453533(该文献全文引入本文作为参考)中所述的NANA的三糖衍生物和NANA的荧光衍生物如4-甲基伞花基(umbelliferyl)-NANA。检测所用的底物浓度是以滴定试验的结果为基础的。将使用可以使对流感病毒神经氨酸酶活性的检测产生最大灵敏度的底物浓度。
在所述检测系统中，可以用已知的流感病毒NA特异性和非特异性抑制剂作为探针，包括但不限于天然抑制剂，包括GB 2238049(该文献全文引入本文作为参考)中所述的抑制流感病毒A0、A1、A2神经氨酸酶的金黄色葡萄球菌糖脂蛋白；非碳水化合物抑制剂，如在美国专利5453533(该文献全文引入本文作为参考)中描述的A和B型流感病毒神经氨酸酶抑制剂；WO 98/17647(该文献全文引入本文作为参考)中所述的抑制病毒和细菌神经氨酸酶的哌啶化合物；美国专利5512596(该文献全文引入本文作为参考)中所述的抑制病毒和细菌神经氨酸酶的芳香化合物；US 5763483(该文献全文引入本文作为参考)中所述的抑制病毒和细菌神经氨酸酶的碳环化合物；WO 92/06691(该文献全文引入本文作为参考)中所述的具有抗正粘病毒和抗副粘病毒活性的2-脱氧化合物；WO 91/16320(该文献全文引入本文作为参考)中所述的2-脱氧-2，3-二脱氢-Na-鲸蜡基神经氨酸衍生物和类似物；WO 96/36628(该文献全文引入本文作为参考)中所述的6-甲酰胺二氢吡喃衍生物；以及WO 96/26933(该文献全文引入本文作为参考)中所述的抑制病毒和细菌神经氨酸酶的一般抑制剂如哌啶化合物。所述检测方法利用抑制剂与流感病毒神经氨酸酶结合的这一已知的特定性质。检测中所用抑制剂的浓度是以滴定试验的结果为基础的。在检测系统中使用对于检测流感病毒神经氨酸酶可产生最高灵敏度的抑制剂浓度。此外，所述检测系统中所用的探针可由可以是底物或抑制剂的化合物组成，例如WO 97/32214(该文献全文引入本文作为参考)中所述的带有6-位间隔基的神经氨酸类似物，所述类似物在间隔基的末端有一可检测标记或表面-结合配对物以便在固体表面上浓缩/检测。
4．1．1 配体/探针的标记本文所述的是用于可检测标记分子的方法，所述分子能够与流感病毒神经氨酸酶相互作用。可将在上述检测系统中所用的神经氨酸酶-相互作用分子、神经氨酸酶底物和抑制剂标记、尾标或者结合以便当所述分子与神经氨酸酶相互作用时产生信号。标记、尾标或结合物包括但不限于，荧光化合物、放射性碱基和化学发光化合物。
可被可检测地结合到荧光化合物上的探针/配体包括但不仅限于，荧光素(FL)、4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称引达省(s-indacene)-3-丙酸(BO或BODIPY)、4-甲基-2，4-二羟基肉桂酰基、荧光素、异硫氰酸盐、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和fluoroescamine。神经氨酸酶与荧光标记的神经氨酸酶-相互作用剂之间的相互作用可通过分光荧光计或者优选通过荧光偏振分析混合物来检测。
还可将神经氨酸酶的底物与产色和荧光化合物例如香豆素结合。当将这些化合物与底物结合时，它们是检测不到的。结合的化合物经流感病毒神经氨酸酶的水解作用产生肉眼可见的颜色或者通过分光荧光计可检测的荧光化合物。
还可用放射性同位素例如32P、125I或135I标记神经氨酸酶特异性抑制剂。神经氨酸酶与神经氨酸酶特异性抑制剂之间的相互作用可通过使用γ计数器或闪烁计数器或放射自显影这样的方法来检测。
在一个优选的实施方案中，将神经氨酸酶特异性的或非特异性的底物与化学发光化合物如羟苯基二氧杂环丁烷化合物结合。在这种情况下，神经氨酸酶对底物的酶处理将会发射出用光电倍增管或电荷耦合装置(CCD)照相可检测的光子。
探针与生物样品组分间的结合作用还可通过ELISA(酶联免疫吸附检测)检测。可将探针标记或者与类似生物素、链霉抗生物素蛋白或者异羟基洋地黄毒苷的分子结合。用这些分子标记的探针可用所述标记特异性的酶结合的抗体来检测。或者，可将探针用抗体标记，所述抗体是否与酶结合均可。不与酶结合的抗体可通过与酶结合的二级抗体来检测。酶结合的抗体将与适宜的底物反应，产生例如通过分光光度法、荧光检测或肉眼可检测的化合物部分。可用于可检测标记抗体的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
4．1．2 配体文库的合成本发明的方法可以使用按照本发明技术人员已知的任何技术合成的配体文库。优选，利用常规溶液相反应或固相合成技术合成。可将所研究的有机分子，例如含伯胺或仲胺基或羟基或硫羟的生物活性化合物或醛或酮或羧酸用适宜的荧光分子(染料)溶液标记以得到相应的荧光-标记的配体。这些方法和染料描述于Haugland，R.P.荧光探针和研究化合物手册(Handbook of Flrorescent Probes andResearch Chemicals)，6thEd1996。在本发明的一个优选的实施方案中，在适宜的极性有机溶剂或溶剂混合物如DMF、DMSO、THF中用稍微过量的染料来完成液相合成以确保完全标记。在有机合成中，通过标准技术如用酸或碱液-液提取、结晶和色谱(薄层或柱)来纯化所得的荧光标记的配体。如下文实施例所述，还可以使用其他纯化方法，例如用聚合物结合的清除剂进行液-固相提取以除去未反应的染料，接着进行简单的过滤(参见Obrecht，D and Villalgordw，J.MSolid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis ofSmall-Molecular-Weight Compound Libraries，Pergamon，1998，Chapter 3)。
方案Ⅰ液相反应(通过清除树脂纯化产物)在本发明的一个实施方案，用常规固相技术制备本发明的文库。参见例如Bodanszky，肽合成原理(Principles of PeptideSynthesis)(Springer-Verlag1984)；Bodanszky，et alThePractice of Peptide Synthesis(Springer-Verlag1984)；Baranyand Merrifield The PeptidesAnalysis，Synthesis and Bioloy Vol.2，Chapter 1(Academic Press1980)；Atherton，etal，Bioorg.Chem.Vol.8(1979)。这是由于固相合成比传统合成方法有许多优点。例如，可以使用大大过量的试剂或起始材料以启动单个反应的完成，因为产物附着在固体支持物上，所以通过简单的过滤和洗涤即可完成纯化和分离。此外，树脂结合的物质的相对定位分离可以抑制许多类型的分子间副反应。
下文描述特别适用于合成本发明文库的固相合成法。该方法能够快速有效地形成多种多样的荧光标记之配体的文库，包括两个常规步骤。首先，将荧光染料与固体支持物共价相连。第二步，按照需要可以重复多次，固定的染料与化合物或化合物之混合物反应形成所需的配体混合物。本发明包括利用文库的检测方法，所述文库在制备后与固体支持物相连，或者与不同的支持物相连。但是，优选在第三步中，将配体混合物从支持物上裂解下来。在方案Ⅱ所列的本发明合成方法的优选实施方案中包括所述可有可无的第三步。 其中＆＃60A＆＃62、＆＃60B＆＃62、＆＃60C＆＃62、＆＃60D＆＃62和＆＃60E＆＃62代表适用于形成所需产物或式(b)-(g)所代表的中间产物的反应条件，方括号(即[])代表任选的平行或连续反应、反应物和/或产物。
本发明反应方案Ⅱ选择下列式(a)的染料分子S-D-Y式(a)其中D是荧光部分，X和Y是功能基，分别独立地选自卤素、醇、硝基、硫羟、醚、酯、羧酸、α卤代羧酸衍生物、胺、酰胺和其保护的和未保护的衍生物。式(a)染料分子的实例包括但不限于荧光素衍生物如二氯三氮基氨基荧光素(dichlorotriazylaminofluorescein，DTAF)、二氯磺基荧光素(DCSF)和硝基荧光素；色氨酸衍生物；香豆素衍生物；萘基衍生物；二吡啶(bpy)衍生物；三吡啶衍生物；菁蓝罗丹明和有机金属复合物如Ru(bpy)3和其衍生物。染料分子的选择取决于许多因素包括例如大小、溶解度、在固相反应条件下对降解的免疫性、吸收和发射波长、量子产率以及量子产率和发射波长对周围化学环境的敏感性。从文献中很容易确定这些因素中的大部分以及这些和其他适宜化合物的合成。参见例如Haugland，R.PHandbook of Fluorescent Probesand Research Chemicals(6thed.；1996)。
再根据反应方案Ⅱ，选择式(b)的活泼底物树脂-L-E式(b)其中树脂代表任何适用于固相合成的固体支持物；L是与固体支持物相连的衔接物；E是与L结合的离去基团。适宜的固体支持物包括例如聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物和聚乙二醇-PEG-PS-DVB共聚物。连有和不连有衔接物的Wang(聚合物-结合的4-苄氧基苯甲醇)和Rink树脂可以从Aldrich Chemical CoMilwaukee，WI；Novabiochem，San Diego，CA；和Advanced Chemtech，Louisville，KY得到。
选择衔接物L-E以便在反应方案Ⅱ＆＃60E＆＃62代表的反应条件下很容易裂解其与固体支持物的键。适宜的衔接物是本领域技术人员已知的，包括例如卤素、硫羟、醇、醚、酯、醛、酮、羧酸、硝基、胺、酰胺、硅烷，以及其保护的和未保护的衍生物。所述衔接物与固体支持物的连接可以通过本领域技术人员熟知的方法完成。参见例如Bunin，B.AThe Combinatorial Index，Academic Press，1998。
除上述标准外，选择衔接物L-E以便它可以在反应条件＆＃60A＆＃62下与式(a)染料分子的荧光部分D形成共价键，产生式(c)的固定化染料树脂-L-D-Y式(c)取决于树脂L、E和X的适宜反应条件＆＃60A＆＃62是本领域技术人员熟知的，或者是本领域技术人员很容易确定的。通常，它们包括利用引起树脂膨胀并与X反应的溶剂。适宜的溶剂包括例如二甲基甲酰胺(DMF)，1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)，四氢呋喃(THF)，CH2Cl2，和其混合物。反应条件＆＃60A＆＃62还包括一种碱例如二异丙基乙胺(DIPEA)，三乙胺，二甲基氨基吡啶(DMAP)或者N-甲基吗啉(NMM)以中和反应过程中产生的酸。
式(c)的固定化染料作为形成文库配体(由反应方案Ⅱ中式(g)表示)的基础。如果保护活泼部分Y，必须在进行其他反应前将其脱保护。在反应方案Ⅱ＆＃60B＆＃62代表的反应条件下，完成所述任选的脱保护以形成脱保护的部分Y’。随保护基改变的这些条件是本领域技术人员熟知的。参见，Greene，T.W.and Wuts，P.G.MProtective Groups inOrganic Chemistry(第2版，1991)。
然后在反应条件＆＃60＆＃62下，将固定化的染料与式E1R1G1的化合物反应产生式(d)的化合物树脂-L-D-R1-G1式(d)其中E1和G1可以相同或不同，E1是离去基团或保护基，G1是R1的末端或者离去基团或者保护基，R1为含至少一个保护或脱保护的活泼部分的任何化学片段，所述活泼部分能够在适宜的催化和/或脱保护条件下将R1加到荧光部分D上。适宜的活泼部分包括但不限于卤素、硫羟、醇、醚、酯、醛、酮、羧酸、硝基、胺、酰胺、硅烷，以及其保护的和未保护的衍生物。适宜的反应条件＆＃60＆＃62包括已开发出用于固相组合化学法的那些条件。参见例如Brown，rContemporaryOrganic Synthesis，216(1997)；Felder，E.Rand Poppinger，DAdv.Drug Res30∶111(1997)；Balkenhohl，F等，Angew.Chem.Int.Ed.Enl.35∶2288(1996)；Hermkens，P.H.H.等人，Tetrahedron 52∶4527(1996)；Hermkens，P.H.H.等人，Tetrahedron53∶5643(1997)；Thompson，L.A.等人Chem.Rev.96∶555(1996)和Chem.Rev.97(2)(1997)。举证性的加成反应包括伯胺与醛形成亚胺的反应，亚胺可以与各种不同的部分包括例如β-内酰胺、吡咯烷、噻唑烷酮和酰胺反应。酸也是易变的，并可用于在Ugi多组分缩合条件下例如与醛、胺和异腈反应形成小酰胺或杂环化合物。
如反应方案Ⅱ所示，还可将式(c)的固定化染料分子与化合物的混合物反应，所述每种化合物是不同的，但具有通式E1R1G1；即，E1R1G1+(E1R1G1)’+(E1R1G1)”+…+(E1R1G1)i，其中i是混合物中化合物的数量并且是整数，优选少于约50。在这种情况下，产生式(d)化合物的混合物，每种化合物有不同的R1G1片段，即树脂-L-G-R1G1+树脂-L-G-(R1G1)’+树脂-L-G-(R1G1)”+…+树脂-L-G-(R1G1)i。但是优选式(c)化合物仅与式E1R1G1的一种化合物反应。
由于许多药物活性化合物含有活泼部分例如胺和羧酸，所以本发明认为式E1R1G1包括所述化合物，其中可能需要或不需要进一步的反应。但是，如果式(d)化合物的R1部分是活泼部分，则可以在反应方案Ⅱ＆＃60D＆＃62集中所指的反应条件下完成n-1个随后的加成反应，其中n代表与荧光部分D结合的部分数，并且优选是小于约100的整数。
如上所述，每个随后的加成反应均可使用式EkRkGk化合物中的一种化合物或化合物的混合物，其中K是2至n-1之间的整数，Rk是与固定化荧光部分D结合的第K部分(经已与D结合的K-1部分)，Ek和Gk相同或不同，Ek是离去基团或保护基，Gk是Rk的末端或离去基团或保护基，Rk代表含至少一个活泼部分的任何化学片段，所述活泼部分能够将Rk加到固定的化合物上。适宜的反应条件＆＃60C＆＃62包括使用催化剂、脱保护剂以及可促进Rk加至固定的荧光化合物上的条件。
上述反应的完成形成式(f)的固定化化合物树脂-L-D-Rn式(f)或式(f)固定化化合物的混合物；即树脂-L-D-(R1R2R3…Rn)+树脂-L-D-(R1R2R3…Rn)’+树脂-L-D-(R1R2R3…Rn)”+…+树脂-L-D-(R1R2R3…Rn)m，其中在有最大数量化合物的EkRkGk混合物中，当i等于化合物数时，m为约1*n的最大值。为了简单起见，将Gn从式(f)中删除，因为配体的末端(例如Rn)再没有加成反应。
在反应方案Ⅱ的最后步骤中，在反应条件＆＃60E＆＃62下从固体支持物上裂解染料-配体化合物，形成式(g)化合物的文库P-D-Rn式(g)其中应理解式(g)包括由反应方案Ⅱ所示之反应产生的所有可能的化合物和化合物的混合物。适宜的裂解条件＆＃60E＆＃62是本领域技术人员已知的并取决于树脂和L间的键。裂解可以在酸或碱性条件下完成，或者可以是光可诱导的。在文献中已报道了许多适宜的裂解方法。例如，在反应方案Ⅲ中列出了通过用三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷溶液处理式(f)的改性树脂而完成的一些裂解反应 其中(j)是Wang树脂衍生物；(k)是Wang氨基甲酸酯树脂衍生物；(1)是Wang氨基酸树脂衍生物；(m)是Rink树脂衍生物；(n)是Rink氨基酸树脂衍生物；(o)是三苯甲基或氯三苯甲胺(即X=NH)或醇(即X=0)树脂衍生物；L1代表在固相反应条件下稳定的任何侧链或间隔基。适宜侧链的实例包括但不限于取代的和未取代的烷基、芳香基和芳烷基。
裂解后，优选除去溶剂以分离荧光文库。然后将文库溶解在适用于本发明检测的溶剂如二甲亚砜(DMSO)中。
在反应方案Ⅳ-Ⅷ中列出了反应方案Ⅱ方法的具体实施方案。为了清楚起见，这些反应方案并未列出混合物的反应和形成。但是应理解所列的每个反应均代表有许多可能的平行反应。
在反应方案Ⅳ中列出了反应方案Ⅱ一般方法的特别简化的实施方案 其中L1是在所示的反应条件下不发生空间位阻或抑制偶联反应的任何部分；P代表从固体支持物上裂解后L1的末端；R1和R2相同或不同并可以是提供具有优选结构和反应特征之文库的任何理想的部分。适宜部分的实例包括但不限于取代的和未取代的烷基、芳基和芳烷基。
根据反应方案Ⅳ，将DTAF用氨基甲酸二氨基酯Wang树脂或氨基酸Rink树脂或二氨基/氨基醇三苯甲基/氯三苯甲基树脂固定在固体支持物上。反应优选在室温下完成。将DTAF与0.5-3倍量碱如DIPEA、三乙胺、DMAP或NMM溶解在适宜的溶剂如DMF、NMP、THF、二氯甲烷或其混合物中。在室温用过量对称二胺(优选在约2-约6倍量之间)的DMF或NMP溶液取代三嗪环上的剩余氯可产生用于进一步合成的新反应基团。可将该过程按需要重复许多次，并可用许多不同的反应物重复，然后从反应支持物上裂解荧光化合物或化合物的混合物。
在反应方案Ⅴ中列出了反应方案Ⅱ一般方法的另一实施方案 其中将DCSF经与树脂结合的仲烷基胺，优选环状仲胺的氯原子的取代与固体支持物相连。L1因此形成环状二胺的一部分。适宜的环状二胺包括但不限于哌嗪、高哌嗪、4，4’-三亚甲基二哌啶、其衍生物和其异构体。如所示，R1还形成环状二胺的一部分，尽管HNR1NH可由带有适宜反应基团的任何化合物取代。R2和R3代表适宜掺入本发明文库之荧光配体内的任何部分，包括但不限于天然氨基酸的侧链；取代的和未取代的烷基、芳基和芳烷基等。
如反应方案Ⅳ所示，在标准酰胺形成条件(即PyBrOP/DMAP/DMF)下，通过荧光化合物之游离氨基与Fmoc氨基酸的反应，将N-Fmoc保护的氨基酸与荧光树脂相连。用DMF中的哌啶除去Fmoc基团后，用例如酰基氯、chloroformates或异氰酸酯将氨基酸提供的新氨基衍生化得到各种荧光标记的化合物。在反应方案Ⅵ中提供了适宜异腈化合物的非限制性实施例 如对本领域技术人员显而易见的，含活泼部分如氨基酸、酰基氯、chloroformate和异氰酸酯的许多其它部分(即R4，R5，…Rn)均可用于形成与DCSF结合的配体。同样，与反应方案Ⅳ之R2和R3基团相连的化学片段可以由可以使与染料分子结合的链延长的任何其它基团取代，只要反应条件是用适宜的方式改变的。
在反应方案Ⅶ中列出了反应方案Ⅱ一般方法的最后一个实施方案 其中将DTAF与Rink氨基酸树脂结合，然后用上述方法衍生化。L1、R1和R2如上所定义的。
除上述方法外，还可通过一般的固相合成技术(Obrecht，D.andVillalgordo，J.MSolid-Supported Combinatorial andParallel Synthesis of Small-Molecular-Weight CompoundLibraries，Pergamon，1998；and Bunin，B.AThe CombinatorialIndex，Academic Press，1998)制备荧光标记的配体文库。在本发明的一个优选的实施方案中，按照文献中描述的方法在固体支持物上合成所需的化合物。从固体支持物上裂解前，将固体支持物上的化合物用适宜的染料处理以便在树脂上得到荧光标记的配体。然后从树脂上裂解配体，得到荧光标记的配体。
在一种方法中，通过将固体支持的活泼嵌段与不同的活泼嵌段逐步反应，以线性方式合成配体。然后如反应方案Ⅷ所示，在裂解前最后一步加入染料以得到标记的配体。在该反应方案中，制备荧光标记的N-羟基喹唑啉酮。喹唑啉酮是一种最常见的含杂环的生物活性氮(参见Sinha，S.and Srivastava，M.in Progress in DrugResearch，1994，vol．43，143-238)。它们在人和动物中有广谱生物和药理学活性。已将其作用抗惊厥剂、抗菌剂和治疗糖尿病药。因此，荧光标记的喹唑啉应可用于诊断和药物发现。
在另一种方法中，用多组分缩合反应如Ugi缩合(Tempest，P.A.等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1996，vol.35，640-642)以聚集的方式制备配体。用这种方法，由于将过量的Rink胺树脂和醛、Fmoc-保护的氨基酸以及异腈加至用MeOH/DCM(1∶2 v/v)膨胀的树脂中，所以可将胺组分固定在固体支持物上(反应方案Ⅸ)。组合利用不同的醛、酸和异腈，可以合成大量的配体。
4．2 生物样品本发明提供了得到从各种来源得到的含病毒神经氨酸酶之复杂生物混合物或样品的指纹的方法。神经氨酸酶可得自患者样品、由表达神经氨酸酶之病毒感染的细胞、重组表达的神经氨酸酶或者利用标准分子生物学和蛋白质纯化技术得到的纯化的神经氨酸酶。可用本发明的方法鉴定正常和异常例如未感染的或感染的细胞和/或组织间特异性表型的差异。还可将本发明方法用于鉴定或辨别微生物、病毒、细菌、真菌或寄生虫物种。
本发明的方法可检测所有类型的配体/受体相互作用，因此，神经氨酸酶可以是纯化的蛋白质、编码NA的核酸或者NA调节元件，或者能够代表神经氨酸酶形状即与神经氨酸酶特异性探针或配体相互作用的任何分子。本文所用靶受体--神经氨酸酶可以指“生物学受体”、“受体”、“生物学靶”、“靶”和“生物样品组分”。
因此，本发明的一个方面是用于表征流感病毒感染的方法，所述方法包括鉴定生物样品中存在的神经氨酸酶受体或靶与配体或探针文库间的结合作用图，其中所述结合作用图提供了所述疾病特有的指纹。
根据本发明，“受体”或“靶”是代表或模拟神经氨酸酶结合亲和性或酶活性的生物分子，包括但不限于蛋白质，包括酶、抗原、抗体，类脂、核酸包括DNA和RNA，碳水化合物包括植物凝血素，细胞表面蛋白或受体等。
所述方法中所用的生物样品可以是生物分子源的任何样品，包括但不限于生物材料例如血清、组织样品、细胞提取物、体外转录和翻译系统的产物(例如通过king等人的美国专利5654150的方法得到的)等。此外，还可以使用来自含致病生物如细菌、角膜、真菌、病毒、原生动物等的提取物或体液。在这些情况下，与病原体中的蛋白质或其它受体有高度亲和性和特异性的配体可揭示新靶并可检测其对所述病原体的抑制作用。
可用本发明方法筛选的生物样品可得自各种来源。例如，但不限于生物样品或混合物可得自患者，包括体液、血液、血清、粘液，包括口腔、直肠或肠粘膜、尿、粪等。此外，生物样品可包括组织样品、活检组织、细胞样品，包括骨髓细胞、淋巴细胞、免疫细胞、从口腔、直肠或肠粘膜层得到的粘膜细胞等。在另一实施方案中，生物样品或混合物可以包括细胞溶解产物或其部分、碳水化合物包括植物凝集素；蛋白质包括糖蛋白、细胞表面受体、肽；核酸包括DNA或RNA等。在另一实施方案中，生物样品可以是或可得自病毒、细菌、微生物或寄生虫或含所述生物样品的体液，例如检测供水系统的微生物含量。
本发明的生物样品可以得自患因感染病毒、细菌或其它微生物引起的疾病、失调或病理状态的个体。在另一实施方案中，所述生物样品可通过将组织、培养中的细胞、细胞提取物等与毒素或致病剂接触，或者通过遗传工程方法处理培养中细胞的基因组以编码已知与任何给定之疾病或失调有关的突变或蛋白质或肽。
可以从医院或国家研究机构收集生物样品作为临床样品源。
4．3 检测临床样品中流感病毒神经氨酸酶的筛选方法由于某种疾病的临床材料常常是以有限量提供的，因此，本发明的第三个方面，是灵敏的检测系统必须能够检测在微升样品中发生的结合作用，另外，必须能够检测低于最佳亲和性的结合作用。本发明的检测系统还必须能够消除或者大大降低配体与样品中受体的非特异性结合。考虑这些因素，本发明的组合检测系统和检测方法对现有的系统例如荧光偏振、闪烁亲近检测(SPA)和酶联免疫吸附检测(ELISA)进行了改进。
本发明提供了快速、特异性的用于检测和诊断流感病毒的检测方法。更具体地讲，本发明提供了检测流感病毒神经氨酸酶(NA)的方法。
以NA为基础，至少有三种方法可用于检测流感病毒感染。一种方法是利用一种标记的流感病毒神经氨酸酶特异性底物，其在酶处理后产生可检测信号。该方法提供了一种直接表明神经氨酸酶存在，并由此表明存在病毒的方法。另一种方法是利用一种标记的流感病毒NA非特异性底物，在酶处理后产生可检测信号，但存在流感病毒NA特异性抑制剂的情况下除外。在存在流感病毒NA特异性抑制剂的条件下，所述信号可被减弱。该方法提供一种间接表明神经氨酸酶存在并由此表明存在病毒的方法。第三种方法是利用一种标记的病毒NA特异性抑制剂，所述抑制剂与NA作用后产生可检测信号。该方法提供了一种直接表明神经氨酸酶存在并由此表明存在病毒方法。
4．3．1 流感病毒感染的诊断通过患流感感染个体的鼻(或咽)棉拭或吸出物来对所述个体进行诊断。然后将所述棉拭或吸出物与少量体积的载体液体混合。在优选的实施方案中，用约0.5毫升载体液体稀释所述棉拭或吸出物。加入标记的NA特异性或非特异性底物或者在载体液体中含所述底物。NA底物与临床样品混合在通过流感病毒NA的酶处理后将产生可检测信号。为了确保用非特异性底物检测的酶活性是流感病毒神经氨酸酶的酶活性，应将流感病毒神经氨酸酶特异性的抑制剂加至反应混合物中。将流感病毒神经氨酸酶特异性的抑制剂加入到合流感病毒NA非特异性底物和临床样品的混合物中将使可检测信号减弱。诊断流感病毒感染中所用的这两种方法利用了流感病毒神经氨酸酶的酶活性。
诊断流感病毒神经氨酸酶的另一种方法是从个体中得到鼻拭或吸出物，然后将其放在载体液体中与标记的神经氨酸酶特异性抑制剂混合。如果在临床样品中存在神经氨酸酶，那么神经氨酸酶特异性抑制剂与临床样品的混合将产生可检测信号。在该检测方法中，能够检测出信号将表明存在流感病毒。
在优选的实施方案中，在医生的办公室内就可完成这些检测来诊断流感病毒感染。所述检测系统给医生提供了快速、特异性以及准确地诊断流感病毒感染的方法。在另一优选的实施方案中，神经氨酸酶的检测方法足够灵敏到可以检测出约100个或更少的颗粒。
4．4 用于检测新的调节神经氨酸酶活性之试剂的高通量筛选方法在另一实施方案中，通过高通量检测系统可以鉴定调节神经氨酸酶活性的新试剂。这些新试剂可以包括但不限于药物、配体(天然的或合成的)、配体拮抗剂、肽、小有机分子等。用于鉴定新的调节神经氨酸酶活性之新试剂的一种方法是将在含流感病毒或流感病毒神经氨酸酶之载体液体中的试剂与流感病毒NA的底物混合。如果所述试剂不能抑制流感病毒NA活性，将产生可检测信号。通过试剂减弱流感病毒NA对非特异性或特异性流感病毒NA底物进行酶处理产生信号的能力，可以检测抑制神经氨酸酶活性的试剂。
4．5 用于鉴定新的与神经氨酸酶相互作用之试剂的高通量筛选方法在另一实施方案中，通过快速、特异性的高通量检测系统可以鉴定与神经氨酸酶相互作用的新的试剂。这些试剂包括但不限于药物、配体(天然或合成的)、配体拮抗剂、肽、小有机分子等。鉴定与流感病毒神经氨酸酶相互作用之新试剂的一种方法是标记试剂，然后筛选与神经氨酸酶相互作用的那些试剂。另一种方法是标记神经氨酸酶，然后筛选与神经氨酸酶相互作用的试剂。有许多不同的检测系统可用于检测试剂与神经氨酸酶间的相互作用，所述检测系统包括但不限于闪烁亲近检测法(SPA)、DNA阻塞检测法、荧光偏振检测法。
4．5．1 闪烁亲近检测法在SPA检测法中，可将神经氨酸酶或试剂与闪烁体负载的珠结合。在标准的SPA检测中，可用闪烁体-负载的珠标记神经氨酸酶，然后对放射性标记的试剂溶液进行筛选。但是，颠倒这种顺序也是可能的，即将试剂与所述珠结合，然后将神经氨酸酶进行放射性标记。在珠上可合成多种试剂。在所述系统中，将负载闪烁体并用试剂涂覆的珠浸在含放射性标记的神经氨酸酶的液体中。如果标记的神经氨酸酶与标记的试剂有亲和性，则二者结合，放射性标记的神经氨酸酶与珠中闪烁体的亲近导致闪烁体激活并发出光。如果标记的流感病毒神经氨酸酶对试剂几乎没有或没有亲和性，则放射性标记与闪烁体无法足够接近从而允许放射性衰变后发生能量转移。由于SPA不需要洗涤步骤，因此，可以检测相对低亲和性的试剂/神经氨酸酶结合作用。在优选的实施方案中，用阻断剂如白蛋白、洗涤剂或奶粉阻断珠以阻断引起非特异性吸附的阻断位点。
在竞争型筛选方法中可以使用修改的SPA检测，其中将神经氨酸酶固定在闪烁体-负载的珠上，然后放在含已知与神经氨酸酶相互作用之放射性标记的试剂的溶液中。然后将具有未知的神经氨酸酶亲和性的试剂加入到混合物中，与固定受体的已知试剂成功竞争的任何底物都会减弱发出的光量。在Wang，PTarget Identification，Assay Development and High Throughput Screening in DrugDiscovery，in Sino-American Pharmaceutical ProfessionalsAssociation(SAPA)，The 5th Regional Symposium on DrugDiscovery and Development，1997，Kenilworth，NJ中描述了SPA在高通量筛选方法中的用途。
4．5．2 DNA阻塞检测该系统的原理是基于在DNA构建体上存在或不存在限制酶活性和试剂-受体系统，所述DNA构建体已被合成含有单个限制位点。将所述构建体与神经氨酸酶接触时，试剂/神经氨酸酶相互作用将阻断酶与其限制位点的接近，从而在所述位点防止所述构建体的水解。可分离仍完整的构建体并鉴定试剂/神经氨酸酶相互作用。
下面描述DNA限制位点检测系统。将在5’末端含生物素和在3’末端含异羟基洋地黄毒苷的单链DNA寡核苷酸与互补寡核苷酸退火，使退火的双链寡核苷酸含一个位于中央的限制核酸内切酶位点。对互补寡核苷酸进行修饰以便含有带一末端氨基的接头。氨基的位置，在这种情况下位于从5’末端开始的第5个A和第6个T之间，不影响所述限制酶对双链寡核苷酸的活性。所得的构建体如下，其中序列 在单链寡聚物合成的过程中可完成氨基的衍生，而所述氨基仍与CPG珠相连，然后用碱裂解以便从所述珠上释放寡聚物，然后将所述寡聚物与互补的生物素-异羟基洋地黄毒苷寡聚物退火。作为连接试剂的另一种方法，可在合成互补寡核苷酸的过程中掺入衍生的碱基。
当按照本领域熟知的方法与限制位点特异性的限制酶保温时，在所述限制位点水解衍生的构建体以得到如下两部分 水解的混合物与链霉抗生物素蛋白或亲和素涂覆的表面反应导致生物素标记的部分被固定，而异羟基洋地黄毒苷标记部分通过洗涤消除。固定的混合物与抗异羟基洋地黄毒苷-过氧化物酶抗体的反应提供阴性结果，因为异羟基洋地黄毒苷标记的部分已通过限制酶水解和随后的洗涤从混合物中消除。
当将完整的试剂衍生的构建体与流感病毒神经氨酸酶混合时，具有高神经氨酸酶亲和性的那些试剂将与之结合。在保温期后，将反应混合物用适宜的缓冲液稀释，然后用限制酶处理，接着与链霉抗生物素蛋白涂覆的表面保温以固定生物素分子。试剂与神经氨酸酶间的相互作用将阻断所述限制酶与其限制位点的接近，从而预防DNA支架的水解。 在试剂与神经氨酸酶没有相互作用的情况下，所述限制酶将水解DNA支架并释放所述支架的异羟基洋地黄毒苷-标记的部分。可将用抗-异羟基洋地黄毒苷抗体的标准酶联免疫吸附检测(ELISA)用于检测在链霉抗生物素蛋白表面是否存在异羟基洋地黄毒苷。可检测信号表明试剂与神经氨酸酶间的相互作用阻断了限制酶与其限制位点的接近。
可以数种方式修改所述的检测方法。首先，可将神经氨酸酶而不是试剂与DNA支架相连。其次，碱基的缺失可插入在双链DNA支架的一条链中并可利用核酸内切酶而不是限制酶。与以前的实施例类似，试剂与神经氨酸酶的相互作用将阻断核酸内切酶(即绿豆核酸酶或SI核酸酶)接近所述缺口，因此将抑制DNA支架的水解。可改变检测方法的另一种是用放射性碱基标记DNA支架的3’末端而不是用异羟基洋地黄毒苷。此外，可用由肽或peptoid或任何带有中央键的聚合物组成的骨架代替DNA支架，所述中央键可由特定的酶或者其中可通过神经氨酸酶与试剂的相互作用阻断所述裂解的其他机制裂解。
4．5．3 荧光偏振可用于鉴定具有流感病毒神经氨酸酶亲和性之试剂的另一种检测系统是荧光偏振。荧光偏振检测是指测量荧光-标记的化合物与未标记的生物分子的结合。以荧光偏振为基础的检测方法可利用分子量达约10000的荧光标记的化合物以检测与流感病毒神经氨酸酶的相互作用。可以使用的荧光标记的化合物类型包括但不限于小有机分子、肽、小蛋白质、核酸、类脂、多糖。如果在激发和发射的过程中不发生旋转，用平面偏振光激发的荧光分子只在固定的平面内发射光线。发射光的解偏振程度将取决于旋转的分子数量，这又取决于分子的大小。在分子被激发与分子发射荧光的过程中，小分子比大分子旋转更多。当标记的化合物比与其结合的未标记的神经氨酸酶小很多时，就是该检测方法的最佳条件。未结合的小荧光-标记的化合物旋转迅速，发射的光将被解偏振。流感病毒神经氨酸酶与荧光-标记的化合物间的相互作用将提高荧光-标记的化合物的有效大小，并由此减少所述化合物的旋转，这将导致发射的光仍是偏振的。发射的偏振光的强度可通过在检测器前插入可移动的偏振滤光片来检测。在夹角成90°的平面内测量强度，并通常将强度指定为水平强度和垂直强度。在一些仪器中，激发滤光片是可移动的，而发射滤光片是固定的。在某些其他机器中，可用光纤同时测量水平和垂直强度。三个公司PanVera，BMG Lab Technologies和LJL Biosystems销售研究级的荧光偏振仪器，而Abott提供临床实验室仪器。通过下列方程式确定荧光偏振值 荧光偏振值通常用1000除并表示为毫偏振单位(mP)。
5．实施例5．1 流感病毒感染的诊断5．1．1 用于诊断流感病毒的神经氨酸酶活性检测方法在医生的办公室中可诊断患流感病毒样症状的个体。医生用棉签拭个体的鼻通道，然后将棉拭接种在含N-乙酰神经氨酸、流感病毒神经氨酸酶非特异性底物的载体溶液中。临床样品中神经氨酸酶的存在将导致结合底物的水解。为了确保结合的非特异性底物的水解是由流感病毒的存在而引起的，将流感病毒神经氨酸酶特异性抑制剂加到所述混合物中。将流感病毒神经氨酸酶特异性抑制剂如GR 217029或GS 4104加到含结合的N-乙酰神经氨酸和临床样品的载体溶液中将抑制神经氨酸酶水解所述底物并检测不到光。因此，通过加入特异性神经氨酸酶抑制剂后，可检测信号的减弱将表明在临床样品中特异性存在流感病毒。
或者，通过流感病毒神经氨酸酶特异性底物诊断临床样品中是否存在流感病毒神经氨酸酶。在这种情况下，可改变N-乙酰神经氨酸的甘油基侧链以提供特异性。在临床样品中存在流感病毒神经氨酸酶将导致特异性底物的水解并产生可检测信号。
可将神经氨酸酶的特异性或非特异性底物与化学发光的化合物如羟苯基二氧杂环丁烷结合。在临床样品中存在神经氨酸酶活性的情况下，羟苯基二氧杂环丁烷结合的N-乙酰神经氨酸将裂解羟苯基二氧杂环丁烷的N-乙酰神经氨酸氧键，这将使二氧杂环丁烷不稳定并导致光子的发射(反应方案10)。用光电倍增管(发光计)或电子耦合器件(CCD)照相可检测释放的光子。为了确保所检测的酶活性是由流感病毒神经氨酸酶引起的，可将流感病毒神经氨酸酶特异性抑制剂加到所述反应混合物中。流感病毒神经氨酸酶特异性抑制剂的加入将会抑制羟苯基二氧杂环丁烷的N-乙酰神经氨酸氧键的裂解并减弱产生的信号(反应方案Ⅹ)。 5．1．2 以流感病毒神经氨酸酶的存在为基础诊断流感病毒的方法在医生的办公室中可诊断患流感样症状的个体。医生用棉签拭个体的鼻通道，然后将棉拭接种在含荧光标记的特异性抑制剂如GR217029或GS4104的载体溶液中。将样品与标记的特异性抑制剂一起保温一段预定的时间。抑制剂与流感病毒神经氨酸酶间的相互作用将会影响用荧光偏振检测法检测的光的偏振。
需要确定临床样品的荧光偏振检测值以评估偏振的显著性。将临床样品的偏振值与由流感病毒神经氨酸酶和荧光标记的特异性抑制剂组成的阳性对照和由香豆素标记的特异性抑制剂组成的阴性对照进行比较。荧光偏振值接近阳性对照将表明所述个体感染了流感病毒。
5．2 用于鉴定新试剂的高通量检测方法5．2．1 用于鉴定调节流感病毒神经氨酸酶的新试剂的检测方法通过将试剂与流感病毒神经氨酸酶和标记的神经氨酸酶底物混合，可鉴定调节流感病毒神经氨酸酶活性的新的试剂。所用的底物可以是流感病毒神经氨酸酶非特异性(即N-乙酰神经氨酸)的或特异性的。不存在调节流感病毒神经氨酸酶的试剂将导致所结合底物的水解。而调节神经氨酸酶活性的试剂将会抑制神经氨酸酶水解所述底物并检测可检测的信号。
可将神经氨酸酶特异性或非特异性底物与化学发光化合物如羟苯基二氧杂环丁烷结合。存在流感病毒神经氨酸酶活性的情况下，羟苯基二氧杂环丁烷结合的N-乙酰神经氨酸将裂解羟苯基二氧杂环丁烷的N-乙酰神经氨酸氧键，这将使二氧杂环丁烷不稳定并导致光子的发射。用光电倍增管(发光计)或电子耦合器件(CCD)照相可检测释放的光子。与流感病毒神经氨酸酶的活性位点相互作用或与流感病毒神经氨酸酶非竞争性相互作用的试剂将会抑制羟苯基二氧杂环丁烷的N-乙酰神经氨酸氧键的裂解并将减弱所述信号。
5．2．2 用于鉴定与流感病毒神经氨酸酶相互作用的新试剂的检测方法通过将荧光结合的流感病毒神经氨酸酶与试剂混合，可鉴定与流感病毒神经氨酸酶相互作用的新试剂。将所述试剂与荧光标记的神经氨酸酶一起保温一段预定的时间。所述试剂与流感病毒神经氨酸酶间的相互作用将会影响用荧光偏振检测法检测到的光的偏振作用。
需要确定检测到的所述试剂的荧光偏振值以评估偏振作用的显著性。将所述试剂的偏振值与由流感病毒神经氨酸酶和与神经氨酸酶相互作用的已知试剂组成的阳性对照和由荧光标记的流感病毒神经氨酸酶组成的阴性对照进行比较。与阳性对照接近的荧光偏振值将表明所述试剂可与流感病毒神经氨酸酶相互作用。还可用与荧光染料结合的试剂完成该检测，不同于与荧光染料结合的流感病毒神经氨酸酶。
可利用其他检测系统例如DNA支架阻塞检测确定流感病毒神经氨酸酶与试剂间的相互作用。此外，在这些检测系统中，可将试剂或流感病毒神经氨酸酶与放射性碱基或化学发光化合物结合。流感病毒神经氨酸苷酶或试剂与放射性碱基结合时，通过γ计数器或闪烁计数器可检测它们之间的相互作用。此外，当用化学发光化合物标记一种或另一种时，可用发光计检测试剂与神经氨酸酶间的相互作用。
本发明不限于所述具体实施方案的范围，所述实施方案只是作为本发明每个方面的单个说明。实际上，除本文所列和所述的那些外，参照前文描述和附图
，本发明的各种修改对于本领域技术人员是显而易见的。所述修改也在本发明范围内。
本文所引入的参考文献均全文引入本文作为参考。
权利要求
1．检测和/或诊断流感病毒感染的方法，包括(a)将生物样品与化学发光标记的流感病毒神经氨酸酶特异性底物接触；和(b)通过化学发光信号的产生检测底物的酶处理，其中信号的产生表明流感病毒的存在。
2．检测和/或诊断流感病毒感染的方法，包括(a)将生物样品与化学发光标记的流感病毒神经氨酸酶非特异性底物接触；(b)将流感病毒神经氨酸酶特异性抑制剂加到反应混合物中；和(c)通过化学发光信号的产生检测底物的酶处理，其中信号的减弱表明存在流感病毒。
3．检测和/或诊断流感病毒感染的方法，包括(a)将生物样品与化学发光标记的流感病毒神经氨酸酶非特异性底物和流感病毒神经氨酸酶的特异性抑制剂接触；和(b)通过化学发光信号的产生检测底物的酶处理，其中信号的减弱表明存在流感病毒。
4．检测和/或诊断流感病毒感染的方法，包括(a)将生物样品与荧光标记的流感病毒神经氨酸酶特异性抑制剂接触；和(b)通过荧光信号的产生检测神经氨酸酶的存在，其中信号的产生表明存在流感病毒。
5．权利要求4的方法，其中信号的产生通过荧光偏振检测。
6．权利要求1、2、3或4的方法，其中通过用棉拭子揩擦或抽吸个体的鼻通道或咽来得到样品。
7．权利要求1、2、3或6的方法，其中在检测中使用适宜的阳性和阴性对照。
8．权利要求1、2或3的方法，其中将底物与化学发光化合物的前体结合。
9．权利要求2、3或4的方法，其中神经氨酸酶特异性抑制剂是药物、配体(天然或合成的)、肽、糖蛋白、蛋白质、多糖、糖或无机分子。
10．权利要求1、2、3或4的方法，其中所述生物样品是从表现出流感病毒感染症状的个体中得到的临床样品。
11．权利要求4的方法，其中荧光化合物是4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称引达省-3-丙酸、荧光素、异硫氰酸盐、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛、fluoroescamine或香豆素。
12．用于鉴定调节流感病毒神经氨酸酶活性的新试剂的高通量检测方法，包括(a)在存在待测试剂的条件下，将化学发光标记的流感病毒神经氨酸酶底物与流感病毒神经氨酸酶接触；和(b)通过化学发光信号的产生检测底物的酶处理，其中所述信号的减弱表明所述试剂是流感病毒神经氨酸酶的抑制剂。
13．用于鉴定与流感病毒神经氨酸酶相互作用的新试剂的高通量检测方法，包括(a)将化学发光标记的待测试剂与流感病毒神经氨酸酶接触；和(b)通过化学发光信号的产生检测神经氨酸酶与试剂的相互作用。
14．用于鉴定与流感病毒神经氨酸酶相互作用的试剂的高通量检测方法，包括(a)将化学发光标记的待测试剂与流感病毒神经氨酸酶接触；和(b)通过化学发光信号的产生检测神经氨酸酶与试剂的相互作用。
15．权利要求14的检测方法，其中信号的产生通过荧光偏振检测。
16．权利要求12、13或14的检测方法，其中标记待测试剂而不是流感病毒神经氨酸酶。
17．权利要求12、13或14的检测方法，其中所述试剂是药物、配体(天然或合成的)、肽、糖蛋白、蛋白质、多糖、糖或无机分子。
18．权利要求12、13或14的检测方法，其中所述底物是流感病毒神经氨酸酶特异性或非特异性的。
19．权利要求12、13或14的检测方法，其中使用纯化的流感病毒或纯化的流感病毒神经氨酸酶。
20．权利要求12、13或14的检测方法，其中检测系统包括(a)将带有可裂解位点的支架与流感病毒神经氨酸酶接触，其中试剂与神经氨酸酶间的相互作用将阻断所述支架的可裂解位点以便产生可检测信号；和(b)将特异性催化剂加到混合物中，其中不存在相互作用将导致所述支架的裂解以致不产生可检测信号；和(c)基于可检测信号的产生，鉴定流感病毒神经氨酸酶与试剂间的相互作用。
21．权利要求20的检测方法，其中所述支架是双链DNA、多肽或任何聚合物。
22．权利要求21的检测方法，其中DNA支架中的可裂解位点是由核酸内切酶或限制酶位点识别的。
23．用于检测和/或诊断样品中流感病毒神经氨酸酶之存在的试剂盒，包括(a)化学发光标记的神经氨酸酶底物或抑制剂；和(b)用于检测神经氨酸酶与样品中底物结合的装置。
24．权利要求23的试剂盒，其中所述底物是神经氨酸酶特异性的底物。
25．权利要求24的试剂盒，其中所述抑制剂是神经氨酸酶特异性的。
26．药物组合物，含有在可药用载体中的用权利要求12、13或14所述的检测方法鉴定的抑制流感病毒神经氨酸酶活性的试剂。
27．药物组合物，含有在可药用载体中的用权利要求12、13或14所述的检测方法鉴定的与流感病毒神经氨酸酶相互作用的试剂。
28．权利要求26的药物组合物，其中所述试剂是药物、配体(天然的或合成的)、肽、糖蛋白、蛋白质、多糖、糖或无机分子。
29．施用权利要求27的药物组合物用于治疗因流感病毒感染导致的疾病。
全文摘要
本发明包括通过评估流感病毒神经氨酸酶的存在来检测和诊断流感病毒感染的快速、特异性的检测系统。本发明还包括用于鉴定调节流感病毒神经氨酸酶活性的新试剂的快速、特异性的高通量检测系统。本发明还包括用于鉴定与流感病毒神经氨酸酶相互作用的新试剂的快速、特异性的高通量检测系统。
文档编号G01N33/566GK1285003SQ98813706
公开日2001年2月21日 申请日期1998年12月18日 优先权日1997年12月18日
发明者D·L·赫夫纳, C·M·泽普, P·D·鲁斌 申请人:塞普拉科有限公司