专利名称：同时鉴定新型生物靶和用于药物开发的引导结构的方法
1．发明领域本发明涉及同时具有重要治疗和诊断意义的新型生物靶的发现和鉴定，更具体地说，本发明涉及同时发现和鉴定用于药物开发的新型生物靶和引导结构的方法。
2．发明背景最近，研究者们发现，在患有某些大病的病人血浆中存在独特的染色体物质循环(Umovitz等，Chronic Disease Syndromes Symposium，美国微生物学会，1997年5月)。类似地，最近，不同的表达技术被用来证明，正常细胞与赘生细胞相比，超过500种RNA转录子以明显不同的水平表达(Zhang，L.等，正常和癌细胞中的基因表达图谱，Science.276∶1268-72，1997)。这些发现说明，正常细胞和异常细胞间存在大量的分子差异。事实上，可以有理由地假定，存在着成百甚至上千的现有技术没有检测到的潜在生物受体。
目前使用的技术能为治疗和诊断的靶提供有价值的信息，其基础是鉴定正常和异常样品间的单个差异。但是，这些技术不能有效地提供能鉴定相似样品间观察到的差异图谱的信息。相似样品间观察到的差异的图谱可以为更全面的确定特殊疾病亚型提供有价值的信息，它们不仅能帮助分类亚型，而且能帮助确定特殊亚型的合适治疗方案。很清楚，新型生物靶的发现能获得大量的信息，并且大量的这种靶仍没有被检测到，因此急需发现它们的有效方法。
人们早已认识到，化学文库，不管是人工制备还是天然来源的，可用根据对已知生物受体如蛋白质、酶等的亲和性进行筛选。亲和筛选可以用以下已知的技术来完成，例如荧光偏振、闪烁亲近测定法、酶联免疫吸附测定或其他。最近，一种多孔硅生物传感器也得到了公开，该方法事实上可以检测任何能以高亲和性与另一种分子结合的分子。当生物受体是一种有重要治疗意义的靶时，显示对该靶有高亲和性和特异性的文库成员在诊断和/或药物开发中有很高的价值。组合化学的发展大大增加了可用于亲和筛选的配体数目。
闪烁亲近测定法(SPA)，例如美国专利4，568，649中介绍的方法，被用于在大的化学文库中检测对一种已知受体的亲和性。在一个标准的SPA试验中，受体用一种载有闪烁剂的珠子标记，并在溶液中对放射标记的配体进行筛选。如果标记的配体对受体具有亲和性，并被结合，结果放射标记的配体与玻珠上的闪烁剂接近，导致闪烁剂被激活，并发光。如果标记的配体对受体只有很少或没有亲和性，放射标记将不能有效地在闪烁剂附近积累来从放射衰变转移能量，因此几乎检测不到发光。SPA的一个明显缺陷是系统中存在“噪声”或背景放射活性，这是由标记配体的非特异性吸附引起的。由于这个原因，通常将玻珠与一种封闭剂如白蛋白、去污剂或奶粉一起温育，封闭引起这种非特异性吸附的位点。SPA的另一个问题是需要使用放射活性物质，对健康造成了威胁，这种物质很难消除，并且使用非常昂贵。
SPA试验的修改型已被用于一种竞争型的筛选程序，其中受体被固定在一种载有闪烁剂的玻珠上，然后置于一种含有放射标记的该受体底物的溶液中。然后将配体样品加入到混合物中，能够成功地与底物竞争固定受体的化合物将减少发光量。在Wang，P.“靶鉴定，试验开发和药物发现的高通量筛选”，Sino-American PharmaceuticalProfessionals Association(SPPA)，The 5thRegional Symposium onDrug Discovery and Development，1997，Kenilworth，NJ中介绍了SPA用于高通量筛选。
荧光偏振是另一种频繁使用的、用于鉴定对一种特殊受体具有亲和性的化合物的试验系统。当荧光分子附着于与配体连接的寡聚体的一端时，受体与配体的结合严重限制了荧光分子的旋转。当偏振光通过一种含有荧光团标记的寡聚体、并且寡聚体上结合或吸附有一种受体的溶液时，其发出的光也被偏振。
另一种亲和筛选技术最近由Lin，V_Motesharei，K_Dancil，K_Sailor，M_和Ghadiri，M.在“一种以多孔硅为基础的光学干扰生物传感器”(A porous silicon-based optical interferometricbiosensor)，Science 278，840-43(1997)中公开。简单地说，该技术涉及一种薄硅片的使用，该硅片已被蚀刻而产生了一种多孔表面。当光照射照射在多孔物质上时，就产生了一种干涉图谱，其位置在周围介质的折射率改变时移动。应用已知的化学知识，将各种分子识别元件吸附于多孔表面，然后将其与一种来源的靶分子反应。当固定在多孔表面的探针分子与一种靶分子结合时，所产生的折射率改变在干涉图谱中产生移动，这种移动可被一种电荷偶联的仪器探头检测到。该传感器能检测非常微小(例如飞摩尔)浓度的DNA以及识别小的有机分子。传感器的识别元件事实上可以基于任何大分子相互作用，例如核酸杂交、酶底物结合、凝集素-碳水化合物相互作用、抗体-抗原结合、宿主-寄生物复合等。
组合化学能制备含有成百上千化合物的文库，这些化合物很多可能在结构上相似。虽然高通量筛选程序能在这些大型文库中针对已知靶进行亲和筛选，但人们已发展了新的方法，这些方法能提供容量较小但化学多样性最大的文库(见Matter，H.“从结构数据库中选择最理想的变异化合物二维和三维分子描述的合理研究”，Journal ofMedicinal Chemistry，1997，40∶1219-1229)。
亲和指纹检测法早先被用于检测小分子差异文库对一组确定的蛋白的结合亲和性。筛选所获得的指纹被用于预测单个文库成员对其他蛋白或所需受体的亲和性。将指纹图谱与用已知能与所需蛋白反应的其他化合物获得的指纹图谱进行比较，来预测文库化合物是否能进行相似的反应。例如，不是在一个大的文库中对每一种配体检测其与一种与特殊药学活性(例如，抗组胺或抗胆碱能活性)有关的已知受体的相互作用，而只是对那些具有与已知具有该活性的其他化合物相似的指纹的配体进行检测。(见Kauvar，L.M.等，“通过亲和指纹预测能结合蛋白的配体”，Chemistry and Biology，1995，2∶107-118；Kauvar，L.M_“亲和指纹”，Pharmaceutical Manufacturing International.1995，8∶25-28；Kauvar，L.M.“农业化学免疫试验前沿中的图谱识别毒性化学检测”，D.Kurtz.L.Stanker and J.H.Skerritt.Editors，1995，AOACWashington，D.C_305-312)。
目前使用的技术和试验对治疗和诊断的已知靶和受体来说是有价值的，但它们在本质上非常特殊，因而只能提供有限的信息。例如，差异表达的重点只在检测mRNA表达的不同水平，它不能检测序列差异的存在。而且，这种方法不能提供有关生物系统中其他改变如转录后修饰的信息，后者不会导致表达水平改变，并且在多数场合不能提供邻近细胞对异常细胞应答的信息。
因此，我们需要一种能广泛地检测生物样品之间的特殊差异和改变的检测方法。这样一种方法还能提供有助于鉴定用于诊断和药物开发的生物靶和引导结构的方法。
3．发明简述本发明的组合筛选试验和检测方法使用高多样性的化合物文库对复杂的混合物进行探索和研究，来鉴别生物样品间存在的特殊分子差异，后者可用作诊断或发展治疗方法的靶。
本发明部分基于申请者设计的敏感、快速、均一的试验系统，这种系统能使用复杂的、高多样性的分子探针文库对样品进行评价、探索和分析。能够以一种均一的方式进行高通量的试验增加了筛选的敏感性。此外，均一方式还能使相互作用的分子维持它们的天然或活性构象。而且，本发明的均一试验系统使用了强有力的检测系统，这种检测系统不需要单独的步骤来检测反应产物。在一个优选实施方案中，荧光偏振被用来检测样品与文库组分之间的相互作用。
在另一个实施方案中，试验可以以一种非均一的方式进行，其中一个反应组分(例如文库或样品组分)以可释放的方式与固相支持物连接。样品与文库作用产生的反应产物释放到液相中，使用强有力的检测系统例如荧光偏振，反应产物可以优先被检测。
本发明的试验可用于诊断、药物的筛选和发现、目标驱动的药物发现以及蛋白组学和基因组学领域，用来鉴定疾病标记和药物靶。
在一个实施方案中，本发明的高敏感性的组合筛选试验和检测方法将配体/受体相互作用用作一种发现工具来检测复杂生物混合物中存在的、但迄今尚未检测到的受体。本发明的组合筛选试验和检测方法评价多样性的配体与生物样品中潜在的上千的受体的结合相互作用，并鉴定该样品独特的或特征性的结合相互作用，后者可能是一种特定病理(包括但不限于疾病、紊乱和感染)的指标。因此，本发明不仅鉴定新型的受体，还分析相同类型的正常和疾病细胞和/或组织之间出现的特殊差异。本发明的筛选试验和检测方法能比现有的靶发现方法如基因组学或重点在于检测基因型改变和仅检测DNA或RNA改变的差异表达技术提供更多的信息；而且，蛋白组学不检测非蛋白配体，并因而只涉及由特殊序列编码的蛋白。相反，本发明的方法检测所有类型的配体/受体相互作用，受体可以是蛋白、碳水化合物、核酸或任何具有能发生结合相互作用的形状的分子。
根据本发明的方法，可以评价多样性分子文库对复杂的生物样品中存在的上千的潜在结合位点的结合亲和性，并产生一个由该样品显示的结合亲和性图谱，后者为该样品提供一个独特的指纹。
本发明使用多样性的化合物文库，为复杂的生物混合物例如血清提供指纹检测的方法。由文库成员与生物样品中的分子之间产生的特异性结合相互作用为样品提供了独特的指纹。这种指纹能鉴定一种特殊样品中产生的新型相互作用，当样品涉及一种特殊的病理过程时，这种指纹就能鉴定相同类型的正常和异常或有病或无病细胞和/或组织之间存在的特殊表型差异。而且，一旦新型相互作用被鉴定，参与其的分子可用作引导结构、受体或靶，用于诊断和/或药物开发。
本发明的筛选试验不仅包括鉴定个别的新型受体，更重要的是，还包括鉴定结合相互作用的图谱，后者是一种病理过程或一类病理过程的特征。这种结合亲和性图谱可为更全面和更精确地确定和分类疾病亚型提供有价值的信息。准确诊断不仅对疾病的检测非常重要，而且对疾病的处理和治疗也非常重要，它们都能产生可预测的临床结果。
利用本发明的原则，可以从多个不同的个体收集样品，并检测其与一种确定的文库的相互作用，所产生的数据可用来产生一个包括所有被鉴定的结合相互作用的数据库。接着可将与从表现一种所研究病理过程或疾病的个体获得的样品有关的数据抽出进行分析，并与数据库中保留的记录进行比较，来鉴定能预测病理过程或疾病状态的相互作用或相互作用图谱。这样鉴定的相互作用和图谱不仅可用于分析和分类特殊的病理过程或疾病状态，还可用来组织一种诊断检测方法或发展一种治疗或药物。
4．附图简述
图1-5分别是实施例4至7中编辑的数据的图示。
图6、探针对人和牛血清的差异结合。该图描述了使用各种探针从人和牛血清获得的荧光偏振值。
图7、探针18对表7中列出的生物样品的差异结合。用探针18从每个样品获得的荧光偏振值用图进行了描述。
图8、探针70对表7中列出的生物样品的差异结合。用探针70从每个样品获得的荧光偏振值用图进行了描述。
图9、探针147的结构和差异结合图谱。(A)描述了探针147的结构。(B)该图描述了使用探针147从表7列出的每个样品获得的荧光偏振值。
图10、探针129的结构和差异结合图谱。(A)描述了探针129的结构。(B)该图描述了使用探针129从表7列出的每个样品获得的荧光偏振值。
图11、探针135的结构和差异结合图谱。(A)描述了探针135的结构。(B)该图描述了使用探针135从表7列出的每个样品获得的荧光偏振值。
图12、探针D6的差异结合。使用荧光素标记的探针D6测定了金黄色葡萄球菌(SA)、二甲氧基苯基青霉素抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)、大肠杆菌和未接种的心脑浸出培养基(BHI)的培养样品的荧光偏振值。该图描述了经过各个培养温育阶段后从各细菌菌株和未接种的BHI培养基获得的荧光偏振值。
图13、以用探针D6获得的荧光偏振值为基础对细菌培养物进行分类。由12个未知培养物的荧光偏振试验获得的结果根据它们的荧光偏振值进行了分组。
图14、探针对正常(Lot HS300)和糖尿病人血清的差异结合。该图描述了使用各种探针从正常和糖尿病人血清获得的荧光偏振值。
图15、探针对脱脂的糖尿病和正常(Lot HS300)人血清的差异结合。该图描述了使用各种探针从脱脂的正常和糖尿病人血清获得的荧光偏振值。
5．发明详述本发明涉及能以高亲和性与靶分子结合的化合物的应用，这种化合物不仅可能是发展药物的引导化合物，而且还是一种信息分子。
在多样性的化学组合文库中，一种化合物与一种特殊的靶结合的频率非常低(可能是0.0001％或更低)。但如果有大量的靶，这种频率会急剧增加。例如，当不是一个靶分子而是可能有1000个靶分子时，得到一次“击中”的可能性就会提高到0.1％。复杂的生物系统含有成千上万的不同分子，它们中多数在一种特殊的疾病状态如前列腺癌或乳腺癌中可能改变；因此，在多样性的有机分子组合文库的成员和临床样品的信息组分之间获得高亲和性相互作用的的可能性比获得“击中”一个单个靶的可能性要高得多。在按照本发明对这些相互作用进行检测和定量后，就可组成非常完整的样品图谱(依赖于进行评价的系统中文库组分的数量和多样性)。
本发明的组合筛选试验和检测方法包括高多样性的化合物文库，后者用作指纹来鉴定生物样品间存在的特殊分子差异。用本发明的组合筛选试验和检测方法鉴定的特殊分子差异是诊断和发展治疗方案的潜在的靶。要想成功地应用本发明的组合筛选试验和检测方法，需要至少三个组成部分(1)一种多样性分子文库(探针)；(2)一种临床样品来源(对照和检测样品)；(3)一种检测文库成员与样品组分间相互作用的敏感试验。
因此，本发明的一个方面是分析一种病理过程的方法，所说的方法包括鉴定(a)病理过程有关的生物样品中存在的受体或靶与(b)配体或探针文库之间的结合相互作用的图谱，其中结合相互作用的图谱能提供该病理过程的独特指纹。根据本发明，“受体”或“靶”是证明对一种配体或探针具有结合亲和性或相互作用的生物分子。这种受体或靶的例子包括任何能被差异表达或修饰以及能与探针或配体相互作用的生物活性分子，但不限于蛋白，包括酶；脂类；核酸，包括DNA、RNA；碳水化合物；抗原；抗体等。配体或探针的例子包括天然或人工的任何分子，它可用于与受体或靶相互作用或结合来测量或指示所说的配体或探针在一种给定的生物样品中的存在。
在一个特殊的实施方案中，本发明的组合筛选试验和检测方法可用于检测或分析一种病理过程。根据该实施方案，被鉴定或分析的病理过程可包括但不限于一种转化表型、遗传缺陷、恶变、癌症、肿瘤、遗传紊乱、病毒感染、细菌感染、真菌感染或一种寄生虫的存在。
脊椎动物特别是人在生理上非常复杂。正是这种复杂性使进行精确的诊断非常困难和消耗时间。例如，血浆含有成千上万的蛋白质、碳水化合物、脂类和核酸。这些组分中的任何一个或多个的变化或改变都可能对特殊疾病状态有很高的诊断意义或产生一种特殊的治疗方法，但系统的高复杂性阻碍了这些改变的精确检测和分析。在一个方面，本发明能对非常复杂的生物系统进行快速分析，例如血浆或血清、组织匀浆物、脑脊髓液、尿液、痰或其他任何临床物质，包括但不限于那些能以流体形式获得或制备的的物质。
本发明的一个实施方案是医学诊断。本发明可以应用的诊断领域包括但不限于各种癌症的早期诊断、感染的检测和鉴定、治疗的毒性副作用的检测以及其他疾病状态和病理过程。对于任何给定的病理过程，在有机体的复杂生物系统中都有大量生理改变发生。有些改变是病理过程的直接结果，而其他是机体对该病理过程应答产生的。任何或所有这些改变可以进行诊断。但不幸的是，对多数疾病来说，可诊断的改变是未知的，并且在本发明之前，还没有敏感、快速的方法用于检测这些可诊断的改变。在某些场合，以抗体为基础的诊断被用来检测与特殊病理过程有关的新抗原(例如与前列腺癌有关的PSA抗原)，但以抗体为基础的诊断依赖于首先鉴定该抗原。而且，抗体生产既昂贵又耗时。在本发明中，大的、多样性的化学文库与生物样品、血浆(例如来自具有特殊病理过程的个体)的结合相互作用与来自正常群体的样品进行比较，并对差异进行分析。这种差异可以是定性的或定量的，并可是与任何分子结合的结果，这些分子的例子如蛋白质、脂类、碳水化合物或核酸、酶、抗原等。该方法对其能检测的分子的类型没有倾向性。在进行研究或者一种独特的图谱可识别后，这种结合相互作用可导致能诊断该病理过程的单个或少量的结合相互作用被发现。两种鉴定独特结合相互作用的方法都可装配成一种廉价的、快速的、以荧光偏振为基础的试验，这种试验可在诊所中或其他地方进行。
本发明的一个应用是诊断和治疗各种类型的癌症，这些癌症的例子如前列腺癌、宫颈癌、卵巢癌。目前，前列腺癌的诊断依赖于以抗体为基础检测PSA抗原。其他地方来源的最新证据表明，评价特定细胞因子的水平也可对这种疾病进行诊断。这两个指标可能不是已经存在的前列腺癌的最早指标，本发明提供了一种快速的方法，用于鉴定其他尚未知道的诊断指标。因此，本发明能通过使用一个荧光探针文库对诸如来自前列腺癌个体的血浆样品进行检测来发现新的诊断标记。使用这种筛选试验导致的发现接着可导致治疗方法的发展。因此，本发明包括用于诊断试验或试剂盒的探针或标记的发现以及它们随后在药物发现中的应用。
本发明还可用于Pap涂片样品中的诊断标记的检测。根据本发明，从个体中获得的正常和异常Pap涂片样品可用一个标记探针文库进行筛选，对恶变或感染性疾病有诊断意义的结合相互作用可用于以荧光偏振为基础的诊断。而且，与一种恶变或感染疾病有关的生物分子的发现可接着用于发展治疗。
本发明可用于为卵巢癌筛选生物标记，后者可用于为卵巢癌发展一种诊断试剂盒。最近，卵巢癌活化因子(OCAF)被认为是卵巢癌的一种生物标记。目前，一种针对CH125的血清学试验被用于检测卵巢癌，CH125是卵巢癌的一种生物标记。根据本发明，本发明中介绍的荧光偏振试验、DNA阻塞试验和闪烁亲近试验(SPA)可用于临床研究，来研究卵巢癌的已知生物标记(OCAF和CA125)和鉴定卵巢癌的新型生物标记。这些试验系统将提供使用一种标记探针或标记探针文库筛选临床样品的简单、快速、敏感和精确的方法。
例如，荧光化合物与从患有卵巢癌的病人获得的样品(血液、血清、血浆或其他体液)相互作用的荧光偏振值可与由患有其他种类的妇科癌症、非妇科癌症或无癌症的病人的临床样品获得的荧光偏振值进行比较。患有卵巢癌的病人的样品与其他样品比较，其偏振值改变就表明一种试剂能差异性地与来自卵巢癌病人的样品中存在的(一种)组分结合。这样，这种试剂就可能是一种有用的生物标记，来将卵巢癌样品与非卵巢癌样品区别开来。来自患有卵巢癌的病人的样品的偏振值与其他样品没有明显的差异，就说明该试剂不能用作一种生物标记来将卵巢癌样品与非卵巢癌样品区别。被鉴定为能与不同类型的癌症差异结合的试剂可以单独使用或与其他试剂组合使用，用来检测和诊断不同类型的癌症。而且，被鉴定的试剂可用来发展治疗癌症的疗法。
本发明还提供鉴定糖尿病发作的一种早期指标的方法。目前用于检测糖尿病的方法只在疾病完全发展并且很多损害已经发生后才有用。确实，诊断只在主要症状存在后进行。用另一种方法表述，目前的诊断方法仅仅证实该疾病的存在。本发明介绍的方法为鉴定能作为糖尿病的早期指标的试剂提供方法。例如，血液蛋白的糖基化是糖尿病的一个特征，它能产生独特的结合位点，这些位点可用本发明介绍的方法使用来自一个标记的多样性的分子文库的探针进行检测。根据本发明那些被鉴定为糖尿病发病的早期指标的探针可用于以荧光偏振为基础的试验。这种试验可在诊所或诊断实验室用作诊断手段。
本发明进一步提供鉴定和区分感染性微生物以及它们引起的疾病的方法。感染性微生物在其宿主中可产生广泛的、大多未进行分析的蛋白、碳水化合物和其他分子。而且，应答于感染，宿主有机体产生独特的蛋白质如特异性抗体、特异性受体、趋化因子和细胞因子。所有这些独特的分子都是探针结合的候选物并因而代表感染性疾病的新的诊断靶。本发明提供鉴定能区分感染性微生物和/或它们引起的疾病的结合候选物的方法。所鉴定的结合候选物可接着用于诊断感染性疾病，并可导致药物治疗的发展。实施例10介绍了从一个小的探针文库中发现一种独特的探针，该探针能将金黄色葡萄球菌与二甲氧基苯基青霉素抗性的金黄色葡萄球菌区分。
本发明不仅可用于感染性细菌的检测，还可用于其他感染性物质如真菌、寄生虫、病毒和有可能甚至是阮病毒的检测。例如，神经氨酸酶抑制剂已被发展来抑制甲型和乙型流感病毒。这些药物的有效应用需要有快速的诊断试剂盒来鉴定流感病毒的存在。本发明提供发现对病毒神经氨酸酶或某些其他病毒组分具有高亲和力的标记分子的方法。这些探针可随后整合进一种快速诊断检测方法来检测流感病毒的存在。
上面的讨论证明了使用本发明介绍的试验系统检测具有与临床样品差异结合能力的已知试剂和鉴定新试剂的某些优点。那些被鉴定的试剂可单独或与其他试剂组合使用，来检测和诊断病理过程或疾病。一旦使用本发明的方法被鉴定，这种试剂可用作快速和廉价的诊断手段(例如，诊断试剂盒)来检测和诊断各种病理过程和疾病。
本发明的另一个方面是鉴定有重要治疗和诊断意义的生物靶和发展药物的引导结构的方法，包括将两种生物样品与两种相同的探针文库作用，其中一种生物样品是对照，检测每种探针与生物样品的组分之间的结合相互作用，并鉴定是第二种(非对照)生物样品的特征的结合相互作用。这样鉴定的配体或靶是一种生物靶，并且对该生物组分具有亲和性的探针是发展药物的引导结构。
在一个优选的实施方案中，第二种生物样品包括来自疾病个体血清或患病的或其他与对照为相同类型的异常细胞或组织。因为诊断通常以一种可检测的生物靶为基础，因此该方法在发展与被筛选的细胞或组织有关的病理过程的诊断工具中有很高的价值。而且，因为每当一种新的受体或靶被发现，对该受体有亲和性的化合物也被发现，因此该方法是发展用于治疗该病理过程的药物的引导结构的一种来源。
在另一个实施方案中，本发明的原则可用于潜在药物的毒理学筛选。本发明包括确定一种化合物的毒性特性的方法以及确定在一个个体中毒性化合物的存在的方法，这通过测定对毒性化合物的生物应答来进行。许多药物以及它们的代谢产物具有有害副作用或有毒。迫切需要能预测毒性损害的早期指标而不是仅仅证明损害已经发生。目前，毒性特性或副作用的预测在药物发展的早期非常困难，因为它发生在临床试验之前。使用本发明的原则，毒性特性的存在或缺如可在比目前可能的早得多的发展阶段进行预测。检测这些早期警告信号的初步研究可使用细胞培养研究如利用肝细胞来完成。在这种方法中，肝细胞培养物可用已知毒素处理，一段时间后，取出样品，用一个标记化合物的多样性文库进行检测。在处理培养物中出现而在对照中不出现的结合相互作用可能是细胞或组织损害的早期标记。这些探针可随后在动物模型中进行检测。这样本发明提供了检测药物或其他化合物造成的可能造成损害的预测性早期标记的方法。
根据本发明的这个方面，培养的细胞或组织用已知有毒或无毒的化合物进行处理，然后从培养物中制备抽提物，并用一个标记化合物文库进行检测。这种标记化合物文库检测提供了能反映细胞或组织对有毒或无毒化合物应答的“指纹”。分析与毒性特性有关的指纹图谱的任何改变，并还可进一步分类。接着，已经按上述方法建立了指纹图谱的培养细胞或组织用具有未知毒性特性的待测化合物处理，从处理的培养物中制备抽提物，并用标记化合物文库进行检测。然后将所产生的细胞或组织应答的指纹或图谱与用已知有毒或无毒的化合物在该细胞或组织上产生的参考图谱进行比较，来预测待测化合物的本质。
在另一个实施方案中，本发明的原则可用于分析一种表达蛋白的功能。基因组测序计划包括人类基因组计划产生了大量的基因序列数据，这些基因序列可被克隆，这些基因编码的蛋白可被表达。不幸的是，已知一个基因的序列或从该序列表达一种蛋白通常不能揭示该蛋白的功能、它在疾病中的作用、或与该表达蛋白在生活细胞相互作用的其他分子。
认识到基因组在提供这类信息中的缺点，几个公司已接受了“蛋白组学”方法。在蛋白组学中，二维(2-D)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)被用来根据电荷和质量分离蛋白。然后将所产生的蛋白图谱进行比较，并试图根据独特的图谱将病人群体分类。这种方法的优点是研究表型(是什么)而不是基因型(可能是什么)。众所周知，2-D电泳不能检测或解决非常复杂样品中的大量蛋白。本发明的方法没有这个难题，因为一种标记探针与小的、中等的、大的靶都能给出清楚的分辨信号。而且，本发明是三维(3-D)的，除了靶分子非常小(小于几个千道尔顿)外，每一个结合事件都能给出一个清晰的分辨信号。而且PAGE是被设计来检测蛋白质，而本发明是被设计来检测一种标记探针与任何大于几千道尔顿的生物分子之间的结合相互作用。最后，进行和分析2-D凝胶非常耗时、费力和昂贵，而相反，本发明的方法非常快速和廉价。在任何直接比较时，能够产生预测的本发明的方法优于蛋白组学或基因组学。
本发明提供一种查明表达蛋白的生物学功能的方法。当表达蛋白用小的有机分子的标记文库进行检测时，能发现一些数量的探针与这些蛋白的结合位点结合。这些探针本身是这些表达蛋白的潜在抑制剂。这些探针可加入到细胞培养物或其他系统中，来确定它们的生物影响，并因而可用于确定该蛋白的活性。此外，标记探针可用作一种人工底物与未标记的分子进行竞争性试验来发现具有更高亲和力的抑制剂。这些未标记的分子可随后在动物模型中检测来确定这些激动剂或拮抗剂对细胞功能的影响。按这种方式，一种以前未知或未分析的表达蛋白的功能可使用本发明介绍的技术进行测定。
从细菌到人的有机体的基因组的测序基因正在被大规模克隆和表达。本发明提供快速阐明这些蛋白的功能并同时发现开发新药物的线索的方法。此外，本发明包括发现潜在的抑制剂或亲和性配体的方法，它们可用于纯化或分析这些酶学或结构功能未知的蛋白。这种蛋白靶包括用基因组方法鉴定的蛋白靶。
本发明还提供这样一类方法，它们可用于分出任何目的的群体。例如该技术可用于分出进行临床试验的组。而且，本发明允许对病理过程的早期检测或各种疾病的分布图谱进行大量而廉价的筛选。一旦信息探针已被发展，筛选的费用将非常低。筛选只需要廉价的荧光偏振仪器和探针。探针不仅制备低廉，而且一次试验只需要纳摩尔级。
本发明的大量其他方面、特征和优点在下面的优选实施方案的详述和所附的权利要求中非常明显。但应当理解，本公开应被认为是本发明的原则的举例，并且不应认为本发明被这里介绍的内容所限制。
5．1 探针的多样性配体文库及其检测根据本发明的一个实施方案，当生物样品如血液、血清、体液如尿液、脑脊髓液、羊水、唾液、粘液、组织样品、细胞、病毒、微生物、或有机分子如RNA、DNA、肽和蛋白、以及小的有机分子与一组已知试剂接触而产生一组反映结合相互作用图谱的数值时，就建立了“指纹”。根据本发明，多样性配体文库包括能与受体或靶反应或结合的已知试剂或探针组，它可用来指示受体或靶在一种给定生物样品中的存在。本发明的配体或探针包括但不限于任何天然或合成的生物分子，并可包括但不限于核酸包括DNA或RNA、小的有机分子、肽、糖蛋白、蛋白、多糖、糖类或无机分子。
根据本发明，配体或探针文库可用于产生差异结合图谱来准确地区分生物样品。在本发明的一个优选的实施方案中，多样性的配体文库包括已知的分子，这些分子在与一种生物样品接触时能产生一组反映结合相互作用图谱的数值。当本发明的指纹被用于区分样品如鉴定或区分一种特殊的微生物如病毒、细菌、寄生虫或真菌的一个特殊菌株时，配体多样性文库应包括已知能特异性或非特异性地与该微生物的一个组分相互作用的配体或探针。
在本发明的另一个实施方案中，当受体或靶是未知的时，待测生物样品可与一种包含部分随机选择的分子的配体或探针文库作用，这样就可鉴定独特的结合相互作用，后者可随后用已知方法进行鉴定。被发现仅在待测样品中存在或在待测样品中以不同浓度存在的受体可用作与该待测样品有关的特殊病理过程诊断或治疗的潜在的靶。此外，被发现对该受体有高亲和性和特异性的配体可提供药物发展的引导结构。
在一种生物样品与一组特征性提供的配体作用时，对样品中存在的一种受体具有高亲和性的配体将与该分子结合，形成配体/受体结合物，后者可用各种试验技术进行鉴定。正常或对照样品中发生的结合相互作用可与在包含与对照相同类型的异常细胞或组织的第二个样品中发生的结合相互作用进行比较，来鉴定两种样品中的特殊差异。所介绍的试验系统中使用的探针/配体可进行标记、尾标或接合，这样当生物样品中的组分与探针结合时，就可产生一种可检测的信号。探针/配体可用本领域已知的标记物进行标记，包括但不限于放射性同位素、荧光分子、化学发光化合物和生物发光化合物。
在用于液闪亲近试验时，分子优选用一种放射性同位素标记，包括但不限于32P、35S、125I或131I。放射性同位素可用γ计数器或液闪计数器进行检测。
探针/配体还可用一种荧光分子如荧光素(FL)、罗丹明、4-4-difluoro-5，7-dimethyl-4-bora-3a，4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid(BO或BODIPY)、异硫花菁、花菁或其他荧光染料进行标记。荧光标记的探针/配体与生物样品的组分之间的相互作用可用荧光分光光度计或优选通过分析混合物的荧光偏振来检测。
探针与生物样品的组分之间的结合相互作用还可用ELISA(酶联免疫吸附试验)进行检测。探针可标记或接合到这样的分子如生物素、链亲和素或地高辛上。用这些分子标记的探针可用该标记特异的酶联抗体进行检测。此外，探针可用一种抗体进行标记，该抗体可以接合或不接合一种酶。不接合酶的抗体可用接合了一种酶的第二抗体进行检测。酶联抗体将以这样一种方式与一种合适的底物反应，它可产生一种可检测的例如使用分光光度计、荧光光度计或肉眼方法的化学半分子。可以用来检测性标记抗体的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、Δ5-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬氨酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
本发明的方法可使用按照本领域的技术人员熟知的任何技术合成的配体文库。它们优选通过使用传统的液相反应或固相合成技术来制备。所感兴趣的有机分子如含有第一个或第二个氨基基团、或羟基基团或硫基团或醛基或酮基、或羧酸的生物活性化合物可直接用合适的荧光分子(染料)在溶液中进行标记，来制备相应的荧光标记的配体。这些方法和染料在Haugland，R.P.“荧光探针和研究化合物手册”，6thED_1996中介绍。在本发明的一个优选实施方案中，液相合成在一种合适的极性有机溶剂或溶剂混合物如DMF、DMSO、THF中进行，使用略微过量的染料以保证完全标记。所产生的荧光标记的探针用有机合成的标准技术如使用酸或碱的液相-液相抽提、结晶和色谱(薄层或柱)进行纯化。也可以按下面实施例中的介绍使用其他的纯化方法如使用聚合物结合的清除剂的液相-固相抽提并接着简单过滤以去除未反应的染料(见Obrecht，D.和Villalgordo，J.M_“小分子量化合物文库的固相支持的组合和平行合成”，Pergamon，1998，第3章)。 方案Ⅰ液相反应(产物用清除剂树脂纯化)在本发明的一个实施方案中，本发明的文库使用传统的固相技术制备。见诸如Bodanszky，“肽合成的原则”(Springer-Verlag1984)；Bodanszky等，“肽合成实践”(Springer-Verlag1984)；Barany和Merrifield，“肽分析、合成和生物学”，2卷，1章(Academic Press1980)；Atherton等，Bioorg.Chem.Vol．8(1979)。这是因为固相合成比更传统合成方法具有几种优越性。例如，可以使用大大过量的反应剂或起始物质来驱动单个的反应至完成，并且纯化和分离可通过简单地过滤和洗涤来进行，因为产物被吸附在固相支持物上。而且，树脂结合种类的相关位点分离可抑制多种类型的分子间副反应。
下面介绍一种被发现特别适合于合成本发明的文库的固相合成方法。这种方法能快速而有效地组成荧光标记的配体多样性文库，它包括两个通用步骤。在第一步中，一种荧光染料被共价连接到一种固相支持物上。在第二步中，固化的染料与一种化合物或化合物的混合物反应，来形成所需的配体混合物，这一步在需要时可重复多次。本发明包括使用粘附到它们被合成的固相支持物上的文库或粘附到不同固相支持物上的文库的试验。但配体混合物优选在第三个步骤中从支持物上切割下来。这个可选用的第三步骤包含在示于方案Ⅱ的本发明的合成方法的优选实施方案中 方案Ⅱ其中，＆＃60A＆＃62、＆＃60B＆＃62、＆＃60C＆＃62、＆＃60D＆＃62和＆＃60E＆＃62代表适合于通式(b)-(g)表示的所需产物或中间物形成的反应条件，框号(即[])表示可选用的平行和顺序反应、反应剂和/或产物。
根据方案Ⅱ，通式(a)的一种染料分子选自
X-D-Y通式(a)其中D是一种荧光半分子，X和Y是独立选自卤素、醇基、硝基、硫羟基、醚、酯、羧酸、α-卤代羧酸衍生物、胺、酰胺及其保护或非保护衍生物的官能团。通式(a)的染料分子的例子包括但不限于荧光素衍生物如dichlorotriazylaminofluorescein(DTAF)、dichlorosulfofluorescein(DCSF)和硝基荧光素、色氨酸衍生物、香豆素衍生物、萘衍生物、双吡啶衍生物(bpy)、三吡啶衍生物、花菁、罗丹明和有机金属复合物如Ru(bpy)3及其衍生物。染料分子的选择依赖于多种因素，包括诸如大小、溶解性、对固相反应条件下降解的敏感性、吸收和发射波长、量子产生、以及量子产生和发射波长对周围化学环境的敏感性。这些因素中的多数以及这些和其他合适化合物的合成可从文献中方便地确定。见诸如Haugland，R.P_“荧光探针和研究化合物手册”(6thed_1996)。
同样，根据方案Ⅱ，通式(b)的一种反应底物选自树脂-L-E通式(b)其中树脂代表适合于固相合成的任何固相支持物，L是附着在固相支持上的一种接头，E是结合在L上的一种游离基团。合适的固相支持包括诸如聚苯乙烯-二乙烯苯(PS-DVB)共聚物和聚乙烯甘油-PEG-PS-DYB共聚物。带有或没有合适接头的Wang(聚合物结合的4-苄氧基苄基醇)和rink树脂可从Aldrich Chemical Co_Milwaukee，WI；Novabiochem，San Diego，CA；和Advanced Chemtech，Louisville，KY.获得。
接头L-E按下面的要求进行选择，即它与固相支持的结合可在方案Ⅱ中＆＃60E＆＃62所示的反应条件下方便地切割。合适的接头对本领域的技术人员来说是熟知的，包括诸如卤素、硫羟、醇、醚、酯、醛、酮、羧酸、硝基、胺、酰胺、硅烷、以及它们的保护或非保护的衍生物。这种接头与固相支持物的连接可使用本领域的技术人员熟知的方法来完成。见诸如Bunin，B.A_“组合物索引”，Academic Press，1998。
除了上面介绍的准则，接头L-E还可按如下要求进行选择，即它将与通式(a)的染料分子的荧光半分子D在反应条件＆＃60A＆＃62下形成一种共价键，产生一种通式(c)的固化染料
树脂-L-D-Y通式(c)合适的反应条件＆＃60A＆＃62依赖于树脂、L、E和X，它为本领域的技术人员所熟知或可方便地测定。一般来说，它们包括使用一种能使树脂膨胀并与X反应的溶剂。合适的溶剂包括诸如二甲基甲酰胺(DMF)、1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、四氢呋喃(DHF)、CH2Cl2及其混合物。反应条件＆＃60A＆＃62还可包括一种碱例如二异丙基乙胺(DEPEA)、三乙胺、二甲氨基吡啶(DMAP)、或N-methylmorphaline(NMM)来中和反应中产生的酸。
通式(c)的固化染料用作形成配体文库(方案Ⅱ中通式(g)表示)的基础。但如果反应半分子Y是被保护的，它就必须在其他反应前去保护。这个可选用的、形成脱保护半分子Y’的去保护过程在方案Ⅱ中＆＃60B＆＃62表示的反应条件下进行。这些条件依保护的基团而不同，它们对本领域的技术人员来说是熟知的。见Greene，T.W.和Wuts，P.G.M_“有机化学中的保护基团”(2nded_1991)。
然后，固化的染料在反应条件＆＃60C＆＃62下与一种通式E1R1G1的化合物反应，产生一种通式(d)的化合物树脂-L-D-R1-G1通式(d)其中E1和G1可以相同或不同，E1是一种离去基团或保护基团，G1或者是R1的末端或者是一种离去基团或保护基团，R1代表具有如下特征的任何化学片段，它至少含有一个保护性或非保护性反应半分子，后者能在合适的催化和/或去保护条件下使R1添加到荧光半分子D上。合适的反应半分子包括但不限于卤素、硫羟、醇、醚、酯、醛、酮、羧酸、硝基、胺、酰胺、硅烷及其保护性和非保护性衍生物。合适的反应条件＆＃60C＆＃62包括那些已为固相组合化学发展的条件。见诸如Brown，R_“当代有机合成”，216(1997)；Felder，E.R.和Poppinger，D_Adv.DrugRes_30∶111(1997)；Balkenhohl，F.等，Angew.hem.Int.Ed.Engl.35∶2288(1996)；Hermkens，P.H.H.等，Tetrahedron 52∶4527(1996)；Hermkens，P.H.H.等，Tetrahedron 53∶5643(1997)；Thompson，L.A.等，Chem.Rev.96∶555(1996)；和Chem.Rev.97(2)(1997)。加成反应的例子包括一个初始的胺与醛加成，形成一个亚胺，后者又可与多种不同的半分子反应，包括诸如β-内酰胺、吡咯烷、thiozolidinones和酰胺。酸性基团具有同样的柔性，并可用来与诸如醛、胺和异腈在Ugi多组分浓缩条件下反应，形成小的酰胺或杂环化合物。
如方案Ⅱ所示，通式(c)的固化染料分子也可与化合物的混合物反应，这些化合物每种都不同但具有通式E1R1G1；即E1R1G1+(E1R1G1)’+(E1R1G1)”+…+(E1R1G1)i，其中i是混合物中化合物的数目，并且是一个小于约50的整数。在这种情况下，制备一种通式(d)化合物的混合物，每种化合物都具有不同的R1G1片段，即树脂-L-D-R1G1+树脂-L-D-(R1G1)’+树脂-L-D-(R1G1)”+…+树脂-L-D-(R1G1)i。但通式(c)的化合物优选只与通式E1R1G1的一种化合物反应。
因为许多药物活性化合物含有反应性的半分子如胺和羧酸，本发明认为这种化合物被通式E1R1G1所包括，在这种情况下，可以需要或不需要进一步的反应。但如果通式(d)的化合物的R1片段是一个反应性的半分子，那么n-1次顺序加成反应可在总体上参照方案Ⅱ的＆＃60D＆＃62中的条件下进行，其中n表示与荧光半分子D结合的半分子的数目，并且是一个优选小于约100的整数。
如上所述，这些顺序加成反应的每一个都可使用通式EkRkGk的单种化合物或其混合物，其中k是介于2和n-1之间的一个整数，Rk是结合到固化的荧光半分子D上的第K个半分子(通过已经与D结合的第k-1个半分子)，Ek和Gk可以相同或不同，Ek是一个离去基团或保护基团，Gk是Ek的末端或一个离去基团或保护基团，Rk表示具有如下特征的任何化学片段，即它至少含有一个能使Rk加成到固定化合物上的反应性半分子。合适的反应条件＆＃60C＆＃62包括催化剂、脱保护剂和其他能促进Rk加成到固化的染料化合物上的试剂的使用。
完成上面介绍的反应可形成通式(f)的固化的化合物树脂-L-D-Rn通式(f)或通式(f)的固化化合物的混合物，即树脂-L-D-(R1R2R3…Rn)+树脂-L-D-(R1R2R3…Rn)’+树脂-L-D-(R1R2R3…Rn)”+…树脂-L-D-(R1R2R3…Rn)n，其中m具有最大值I*n，而I等于含有最大数量化合物的EkRkGk混合物中的化合物的数量。为了简便，Gn从通式(f)中忽略，因为配体的末端(例如Rn)不经历进一步的加成反应。
在方案Ⅱ的最后步骤中，染料-配体化合物在反应条件＆＃60E＆＃62下从固相支持上切割下来，产生通式(g)的化合物文库P-D-Rn通式(g)其中应当理解，通式(g)包含由方案Ⅱ中所示的反应产生的所有可能的化合物或化合物的混合物。合适的切割条件＆＃60E＆＃62对本领域的技术人员来说是熟知的，并依赖于树脂与L之间的键。切割可在酸性或碱性条件下完成，或可由光诱导。多种合适的切割方法已在文献中报道。例如，方案Ⅲ中显示了一些用三氟乙酸(TFA)在二氯甲烷中处理通式(f)的修饰树脂来完成的切割反应 方案Ⅲ其中(j)是一种Wang树脂衍生物；(k)是一种Wang氨基甲酸酯树脂衍生物；(m)是一种Rink树脂衍生物；(n)是一种Rink氨基酸树脂衍生物；(o)是一种三苯甲基或氯三苯甲胺(即X=NH)或醇(即X=0)树脂衍生物；L1表示任何在固相反应条件下稳定的侧链或间隔。合适的侧链的例子包括但不限于被取代和未被取代的烷基、芳香基和芳烷基。
切割后，优选除去溶剂来分离荧光文库。文库可随后溶于一种适合在本发明的试验中使用的溶剂如二甲基亚砜(DMSO)。
方案Ⅱ的方法的特殊实施方案示于方案Ⅳ-Ⅷ。为清楚起见，这些方案没有显示混合物的反应和形成。但应当理解，所显示的每个单独反应都表示大量平行反应的可能性。
方案Ⅱ的通用方法的一个特别简化的实施方案示于方案Ⅳ 方案Ⅳ其中L1是在所示的反应条件下不会阻碍或抑制偶联反应的任何半分子；P表示L1从固相支持物上切割下来后的末端；R1和R2可以相同或不同，并可以是任何所需的为文库提供优选的结构和反应特征的半分子。合适的半分子的例子包括但不限于被取代和未被取代的烷基、芳香基和aralkyl基团。
根据方案Ⅳ，使用二氨基甲酸酯Wang树脂或氨基酸Rink树脂或二氨基/氨基醇三苯甲基/氯三苯甲基树脂将DTAF固化到所给的monochlorotriazylaminofluorescein树脂的固相支持物上。该反应优选在环境温度下进行。DTAF与一种大约0.5至大约3倍量碱如DIPEA、三乙基胺、DMAP或NMM一起溶解在一种合适的溶剂如DMF、NMP、THF、methylene chloride或其混合物中。使用过量的(优选大约2至6倍量之间)、诸如DMF或NMP中的、对称的二胺取代三嗪环上剩余的氯基，为进一步的合成提供新的反应基团。这个过程可根据需要使用多种不同的反应剂重复多次，然后将产生的荧光化合物或化合物的混合物从反应支持物上切割下来。
方案Ⅱ的通用方法的另一个实施方案示于方案Ⅴ 方案Ⅴ其中DCSF通过用仲烷胺并优选是一个环形的仲胺取代一个氯原子结合到树脂上来附着在固相支持物上。这样L1组成了环二胺的一部分。合适的环二胺包括诸如哌嗪、同型哌嗪、4，4’-三亚甲基双哌嗪及其衍生物和异构体。如图所示，虽然HNR1NH可以被任何具有合适的反应基团的化合物取代，R1也组成了环二胺的一部分。R2和R3表示任何适合于整合到本发明的荧光配体文库中的半分子，并包括诸如天然氨基酸的侧链、被取代和未被取代的烷基、芳香基和aralkyl基团等。
如方案Ⅳ所示，通过在标准酰胺形成条件下(即PyBrOP/DMAP/DMF)荧光化合物的游离氨基与Fmoc氨基酸的反应，一种N-Fmoc保护的氨基酸被结合到荧光树脂上。在DMF中用哌啶除去Fmoc基团后，氨基酸所提供的新的氨基可用诸如酰基氯、氯仿或异氰酸进行衍生来产生多种荧光标记的化合物。合适的异氰化物的非限制性的例子在方案Ⅵ中提供 方案Ⅵ对本领域的技术人员来说非常明显，大量的含有反应性半分子如氨基酸、酰基氯、氯仿和异氰酸的其他半分子(即R4、R5、…、Rn)可用来形成与DCSF结合的配体。与此类似，只要反应条件适当改变，方案Ⅳ的R2和R3基团所连接的化学片段可以被任何其他能使结合染料分子的链延长的化学片段取代。
方案Ⅱ的通用方法的最后一个实施方案示于方案Ⅶ 方案Ⅶ其中DTAF结合到一种Rink氨基酸树脂上，并随后用上面介绍的方法进行衍生。L1、R1和R2的定义如上。
除了上面的方法，荧光标记配体文库也可用通用的固相合成技术进行制备(Obrecht，D.和Villalgordo，J.M_“小分子量化合物文库的固相支持的组合和平行合成”，Pergamon，1998；和Bunin，B.A_“组合物索引”，Academic Press，1998)。在本发明的一个优选实施方案中，所需的化合物按文献中介绍的方法在固相支持物上合成。在从固相支持物上切割下来前，固相支持物上的化合物用合适的染料处理来制备树脂上的荧光标记的配体。然后将配体从树脂上切割下来，获得荧光标记的配体。
在一种方法中，配体通过固相支持的反应性封闭物与不同的反应性封闭物一步一步地反应来以线性的方式合成。然后在切割前的最后一步加入染料，获得方案Ⅷ所示的标记配体。在此方案中，制备了荧光标记的N-hydroxyquinzolinones。Quinzolinones是最常见的含有杂环的生物反应性氮之一(见，Sinha，S.和Srivastava，M.“药物研究进展”，1994，vol.43，143-238)。它们在人和动物中显示广谱的生物学和药学活性。它们已被用作抗惊厥剂、抗细菌和抗糖尿病试剂。因此荧光标记的quinzolinones对诊断应用和药物发现来说非常有用。 方案Ⅷ在另一种方法中，配体使用多组分浓缩反应如Ugi浓缩以一种聚合的方法制备(Tempest，P.A.等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1996，vol.35，640-642)。使用这种方法，胺组分固定在固相支持物如Rink胺树脂上，醛、Fmoc保护的氨基酸和异氰化物以过量的方式加入到在MeOH/DCM(1∶2 v/v)混合物中膨胀的树脂中(方案Ⅸ)。通过组合使用不同的醛、酸和异氰化物，可以合成大量的配体。 方案Ⅸ5．2 生物样品本发明提供对复杂的生物混合物或可从广泛来源获得的样品进行“指纹”分析的方法。本发明的方法可用来鉴定在正常或异常、健康或疾病、非转化或转化、非感染或感染的细胞和/或组织之间存在的特殊表型差异。本发明的方法还可用于鉴定或区分微生物、病毒、细菌、真菌或寄生虫的种类。
本发明的方法可检测所有类型的配体/受体相互作用，其中受体可以是蛋白质、碳水化合物、核酸或任何具有一种能与探针或配体相互作用的形状的分子。用于此处，“生物受体”、“受体”、“生物靶”、“靶”和“一种生物样品的组分”用来包括在待测样品如疾病或其他异常细胞和/或组织中诸如差异表达或差异修饰的任何生物分子、结合表面、结合位点等。任何一种这种受体都可用作诊断和/或发展潜在治疗方法的靶。
因此，本发明的一个方面是分析病理过程的一种方法，所说的方法包括鉴定该病理过程有关的生物样品中存在的受体或靶与一种配体或探针文库之间的的结合相互作用的图谱，其中该结合相互作用图谱为该病理过程提供了一个独特的指纹。
根据本发明，“受体”或“靶”是一种生物分子，在一种待测样品中它被证明与配体或探针文库有结合亲和性或相互作用，这种结合亲和性或相互作用在待测样品和对照样品中可以相同或不同。这种受体或靶的例子包括但不限于蛋白包括酶、抗原、抗体、脂、核酸包括DNA和RNA、碳水化合物包括凝集素、细胞表面蛋白或受体等等。
该方法中使用的生物样品可以是任何生物分子来源的样品，包括但不限于生物物质例如体液如血浆、血清、尿液、脑脊髓液、羊水、唾液、粘液、组织样品、细胞抽提物、体外转录和翻译系统的产物(例如通过King等在美国专利5，654，150中提交的方法获得)等。而且从含有细菌、酵母、真菌、病毒和原生动物等的液体获得的抽提物也可以使用。在这些情况下，对病原体中的一种蛋白或其他受体显示高亲和性和特异性的配体可揭示新的靶，并可用来检测其对该病原体的抑制影响。
能够按照本发明的方法进行筛选的生物样品可从广泛不同的来源获得。例如但不是为了限制，生物样品或混合物可以从病人获得，包括体液、血清、粘液包括口腔、直肠或小肠粘液、尿液、排泄物等。此外，生物样品可包括组织样品、尸检组织、细胞样品包括骨髓细胞、淋巴细胞、免疫细胞、从口腔、直肠或小肠粘膜获得的粘膜细胞等。在另一个实施方案中，生物样品或混合物可包括细胞裂解物或其部分、碳水化合物包括凝集素、蛋白包括糖蛋白、细胞表面受体、肽、核酸包括DNA或RNA等。在另一个实施方案中，生物样品可以是或来自病毒、细菌、微生物或寄生虫或含有这些生物样品的液体，例如检测供应水中的微生物含量。
本发明的生物样品可以获自患有一种疾病、紊乱或感染了一种病毒、细菌或其他微生物的病理过程的病人。在另一个实施方案中，生物样品可以通过将组织、培养的细胞、细胞抽提物暴露于一种毒素或致病试剂来制备，或者通过遗传工程改造培养细胞的基因组，使之编码已知与任何给定的病理过程或紊乱有关的突变、蛋白或肽。
用作临床样品来源的生物物质收集物可从医院或国立研究机构获得。
5．3 配体/受体相互作用的检测试验考虑到对于任何病理状况，通常只能得到有限的临床物质，本发明的第三个要素－敏感的试验系统就必须能检测几个微升样品中发生的结合相互作用，此外，还必须能检测低于最佳亲和的结合相互作用。本发明的试验系统消除了或大大降低了配体与样品中存在的受体之间的非特异性结合。
因此，本发明的试验的一个方面是提供一种检测探针或配体与受体、靶或活性位点之间相互作用的手段。在一种这样的实施方案中，均一的试验被用来检测一种生物样品中存在的受体或靶。该试验包括，在一个微滴定皿或其他孔型设备中用多样性文库与生物样品作用，并检测探针文库的单个成员与系统组分的任何结合。探针文库成员与样品的结合图谱提供了该样品的分子指纹。在一个优选的实施方案中，文库成员与样品组分的结合用荧光偏振进行检测。
在另一个实施方案中，检测生物样品中存在的受体或靶的试验包括，将探针和配体文库连接到含有能被特殊催化剂切割的位点的结构上，该结构或支架的切割为检测探针与受体之间的相互作用提供信号或手段。更具体地说，配体或探针文库的成员连接在带有能被特殊催化剂切割的位点的支架上，该位点的每一侧都有一个标记，从而提供一种配体/支架结构，将配体/支架结构与一种生物样品作用，其中对样品存在的一种受体具有亲和性的配体就与该受体结合，并阻塞了支架的切割位点。当配体/支架结构与特殊催化剂作用时，不含一种被结合的受体的支架被切割，而完整的支架就被鉴定。
该试验的一个优选的实施方案进一步包括，将一种标记如生物素连接到支架上与切割位点相同的一侧，并将第二种标记如地高辛连接到支架上相反的一侧。将支架固定在一个表面，在加入催化剂后洗涤混合物以去除被切割的支架部分和包含第二种标记的部分，这样第二种标记的存在就鉴定了完整的支架。
试验中使用的支架可包含DNA、RNA、肽、肽类似物、寡糖或任何疏水性的或亲水性的、合成或天然的聚合物包括嵌段共聚物。在一个优选的实施方案中，支架是双链DNA，结构物包括一个第一条寡核苷酸、带有一个与其相连的配体的一个互补的第二条寡核苷酸、和一个单一的限制酶切位点。在此实施方案中，特殊催化剂是对该限制位点特异的限制内切酶。第一种标记可以是诸如生物素，而配体结构可以固化在链亲和素或亲和素包被的表面。地高辛是一种优选的第二标记，而抗地高辛－过氧化物酶被用来指示完整支架的存在。
检测受体在一种生物样品存在的另一个试验包括，将配体文库的成员连接在一种支架上，用一种支架特异的结合试剂和一种生物样品处理该支架，并检测配体与生物样品中存在的受体之间的相互作用。该试验中使用的支架可以包括DNA、RNA、肽、肽类似物、寡糖、或任何疏水性的或亲水性的、合成的或天然的聚合物包括阻塞共聚物。在一个优选的实施方案中，支架特异的结合试剂在配体与受体之间发生相互作用时不与该支架的区域结合。支架特异的结合试剂可以是一种药物、肽、糖蛋白、蛋白、多糖、糖、或无机分子。在另一个实施方案中，支架包括一个标记，该标记在支架特异的结合试剂与支架结合时被阻塞，这样标记的进入就表明支架特异的结合试剂的不存在和配体/受体相互作用的存在。在一个优选的实施方案中，支架包括双链DNA，标记是一种生物素化的核苷酸，在受体/配体相互作用发生时，它可用链亲和素或亲和素进行检测。
在另一个实施方案中本发明的原则可用来对潜在的药物进行毒理学筛选。目前，毒性或副作用的预测在发生在临床试验前的药物发展早期非常困难，使用本发明的原则，毒性的存在或不存在可以在比目前可能的更早发展阶段进行预测。
根据本发明的这个方面，用已知的毒性或非毒性化合物处理培养细胞或组织，然后从培养物中制备抽提物，用标记化合物文库进行检测。这种用标记化合物文库检测提供了一种“指纹”图谱，该图谱反映了细胞或组织对毒性或非毒性化合物的应答。与毒性有关的指纹图谱的任何改变都被记录下来，并可进一步用统计学分析或使用人工智能途径(神经网络)分析来分类。接着，已按上面的方法建立了指纹图谱的培养细胞或组织用具有未知毒性的待测化合物处理，从处理的培养物中制备抽提物，并用标记化合物文库进行检测。然后将产生的细胞或组织应答的指纹或图谱与用已知毒性/非毒性化合物处理该细胞或组织产生的参考图谱进行比较，来预测待测化合物的本质。
根据本发明，章节5．3．1至5．3．3介绍了可用于检测探针对生物样品的结合亲和性差异从而产生结合亲和性指纹或图谱的试验。
用本发明获得的结果可帮助区分两种样品群体(例如正常和疾病)，它们可组成两个类别。在第一个类别中，一种或两种探针可用来区分群体，并且探针应答在两个群体间可很容易地区别(“Shiningpebbles”)。在第二个类别中，与两个样品群体结合的微小差别可使用大量的、与样品群体的结合差异很小的探针来区分。这些探针的组合(一种诊断簇)对于为未知样品中的可信差异提供统计学支持是必需的。为产生更有用的分析系统，需要大量的探针，因为全部结合图谱不会受到因个别突变产生的波动的严重影响。在只使用一种或两种探针的系统中，探针的个别突变会使诊断更困难。
分析大量探针与大量样品的结合需要使用智能化的计算机算法。两种类型的分析可用于数据。第一种分析的重点在于确定哪些探针可用于区分两种样品群体的成员。这种类型分析的算法可从统计学分析领域(区别功能分析)或从人工智能领域(受到监督的、反馈增殖的神经网络)获得。可以使用的第二种类型的分析包括根据检测结果将探针结合数据分类，然后在以相应的探针为基础的类别的历史(例如医学)中查询是否有任何的相似性。统计学分析(主要组分分析)和人工智能(非监督的、kohonen神经网络)中已有用于这些类型分析的算法。包含上述功能的数据分析程序或软件包可从商业途径获得。例如，商业程序SPSS(SPSS，Inc_Chicago，Illinois)和SAS(SAS Institute，Inc_Cary，NC)能提供区别功能分析和主要组分分析。几种软件包如Neuroshell 2(Word Systems Group，Inc_Frederick，MD)或Stuttgart Neural Network Simulation(The University of Stuttgart，Stuttgart，Germany)能提供反馈增殖和Kohonen神经网络。
5．3．1 荧光偏振试验在本发明中，荧光偏振试验可用来鉴定配体与生物样品中存在的受体之间的结合相互作用。
荧光偏振试验被设计来测量荧光标记的化合物与非标记的生物分子的结合。荧光偏振试验可以使用分子量高达10，000左右的荧光标记的化合物来检测其与生物分子的相互作用。可以使用的荧光标记的化合物的类型包括但不限于小的有机分子、肽、小蛋白、核酸、脂类和多糖。荧光分子在用平偏振光激发时，只有在激发和发射之间的时间内它们不旋转时，才以一个固定的平面发射光。发射光去偏振的程度依赖于分子旋转的数量，后者又依赖于分子的大小。在激发和发射荧光之间的时间内，小分子比大分子旋转的更多。该试验的最佳条件为标记化合物比与其结合的非标记分子小得多时。未结合的小荧光标记化合物旋转迅速，并且发射光去偏振。生物分子与荧光分子的相互作用增加了荧光标记化合物的有效大小，因而减少了该化合物的旋转，后者导致发射光保持偏振。发射的偏振光的强度可通过在检测器前面插入一个可移动的偏振滤镜进行测量。强度在90°间隔的平面测量，并且多次指定水平和垂直强度。在一些仪器中，激发滤镜是活动的而发射滤镜是固定的。在某些其他的机器中，水平和垂直强度通过光学纤维同时测量。三个公司－Pan Vera、BMG Lab Technologies和LJLBiosystems出售研究级的荧光偏振设备，Abott提供临床实验室设备。荧光偏振值由下面的方程确定 荧光偏振值通常除以1000，并以微偏振单位(mP)表示。
在一种形式的这种试验中，一种荧光分子如荧光素被连接到一个长度足以产生“推动效应”的寡聚体上。然后将一个短接头连接到荧光分子上，寡聚体上与荧光分子相对的末端连接到微滴定皿或其他适用于荧光偏振的孔型设备的壁上。然后用需要筛选的配体对短接头的游离端进行修饰。每个孔中连接配体是已知的。然后将一种受体源加入到每个孔中并温育。接着使用偏振光激发荧光分子，测量发射偏振光的偏振性。能与配体结合的受体将减少荧光分子的自由旋转，从而能检测到偏振性增加。在另一方面，如果没有受体能结合配体，荧光分子就仍能自由旋转，并且发射光将减少和不偏振。为得到任何结合受体对配体的亲和性的近似值，从孔中除去抽提物，加入新鲜缓冲液，测量每个孔中发射的光的偏振值。具有较低亲和性的受体将从受体上解离，发射光的偏振将会降低。重复这个过程就可鉴定具有最高亲和性的配体/受体结合相互作用。
5．3．2 液闪亲近试验(SPA)
通常在SPA试验中，受体与载有闪烁剂的玻珠结合，直接或竞争性地针对溶液中的配体进行筛选。但也可以反过来安排，将配体与玻珠结合，将受体置于溶液中。这种改变特别与组合化学适配，因为在多种合成方案中，文库合成是在玻珠上进行的，它可接着按SPA试验系统的需要用闪烁剂饱和。此外，在一个玻珠上可合成一个以上的配体。在这样一种系统中，载有闪烁剂并包被有一种配体的玻珠浸入一种含有放射性标记反应剂的液相中。如果标记的反应剂对一种标记的配体具有亲和性，两者就会结合，所产生的放射性标记反应剂与玻珠上的闪烁剂的接近就导致闪烁剂被激发，并发光。如果标记的反应剂对一种配体只有很少或没有亲和性，放射性标记将不足以在闪烁剂附近积累来将放射衰变后的能量转移。因为SPA不需要洗涤步骤，因此它能检测相对低亲和性的配体/受体结合相互作用。
5．3．3 DNA限制酶切位点阻断试验本系统的原理的基础是存在或不存在对一种DNA结构物的限制内切酶活性，该DNA结构物被合成来包括一个单一的限制酶切位点和一个配体-受体系统。当该结构物与一种生物混合物作用时，配体/受体相互作用将阻断限制酶进入限制酶切位点，从而阻断结构物在该位点被水解。可以分离保持完整的结构物，并鉴定配体/受体相互作用。
这里提供一种DNA限制酶切位点试验系统的说明。将一条在5’端含有生物素在3’端含有地高辛的单链DNA寡核苷酸与一条互补寡核苷酸退火，使所产生的退火的双链寡核苷酸在中间含有一个单一的限制酶切位点。互补寡核苷酸链被修饰来含有一个接头，该接头带有一个末端氨基基团。使氨基基团的位置(在本试验中，氨基基团的位置在5’端的第5个A和第6个T之间)不干扰限制内切酶对该双链寡核苷酸的活性。所产生的结构物示于如下其中序列GGATCC(SEQ ID--)是一个限制酶切位点。
CCTAGG 氨基基团用多样性化学文库的配体进行修饰，形成如下所示的结构 氨基基团的衍生可在单链寡聚体合成的过程中当它仍与CPG玻珠连接时完成，然后可以用碱切割将寡聚物从玻珠上释放出来，接着可将其与互补的生物素-地高辛寡聚物退火。连接配体的另一种方法是，可以在合成互补寡核苷酸时将衍生碱基整合进去。
在按照本领域熟知的方法与对该限制酶切位点特异的限制性内切酶一起温育时，衍生结构物在该酶切位点水解，产生如下所示的两个部分 水解混合物与链亲和素或亲和素包被的表面反应将导致生物素标记的部分被固定，而地高辛标记的部分被洗去。固定的混合物与抗地高辛-过氧化物酶抗体反应将产生阴性结果，因为地高辛标记的部分被限制内切酶水解和随后的洗涤而从混合物中除去。
完整的配体衍生结构物可作为探针检测样品中潜在的受体，当它与一种临床样品混合时，配体将俘获任何对如下结构有高亲和性的受体 温育一段时间后，反应混合物用一种合适的缓冲液稀释，并用限制内切酶处理，然后与一种链亲和素包被的表面温育，来固定生物素分子。当存在一种对结构物上的配体有高亲和性的生物分子时，该分子将阻断酶进入限制酶切位点，并阻止DNA支架的水解，从而导致完整的双链寡核苷酸被固定。另一种情况是，当一种生物分子不能与结构物上的配体结合时，限制性内切酶将不被阻断，造成如上所示的DNA支架水解，并导致一个被剪短的结构物被固定，释放出地高辛标记的部分。一种使用地高辛过氧化物酶抗体的标准酶联免疫吸附试验(ELISA)可用来检测地高辛在链亲和素表面的存在。阳性的试验表明，限制性内切酶被阻断，而这表明一个分子已结合到接头上。这样，该方法可用来检测任何配体与任何具有足够亲和性和大小来阻断限制性内切酶进入其限制酶切位点的受体之间的相互作用。
在上面介绍的方法的一种修改形式中，一个“缝隙”(一个碱基删除)被插入到双链序列的一条链中，并且一个配体按如下所示连接到该缝隙附近 用一种内切酶如绿豆核酸酶或核酸酶S1处理该结构物将导致该结构物在缝隙处水解。水解混合物与固定的亲和素或链亲和素反应并接着洗涤将除去结构物中含有地高辛的部分。如上所述，将该结构物与对该配体具有高亲和性的受体在加入核酸酶前一起温育将防止该结构物在缝隙处水解，并且在检测地高辛存在的试验中将获得强阳性应答。
在DNA限制酶切位点试验的进一步的变化形式中，DNA支架可被一种由肽、肽类似物或任何在其中间有一个能被特殊的酶或其他机制切割的键、并且切割可被在该键附近发生的配体/受体相互作用阻断的聚合物组成的骨架所取代。例如，可以使用一种商业化的聚(甘氨酸)或聚(赖氨酸)骨架，在其中间使用肽合成的标准技术已插入了一个含有苯丙氨酸残基的链和一个附近的配体。酶如胰凝乳蛋白酶A4(EC3.4.21.1)可接着以类似上面介绍的核酸酶的方式进行使用。此外，可通过在合成结构物上与生物素相对的部分时使用放射活性的碱基或配体并将链亲和素连接到载有闪烁剂的玻珠上，来将该试验修改成一种SPA试验。
尽管这里介绍的任何试验都适合于在本发明中使用，此系统能提供下面的优点，例如，它不需要放射活性，尽管放射标记的核苷酸可置于限制酶切位点的下游来将该试验转变成为一种SPA形式；此系统可以通过使用PCR方法作为检测系统而变得超级敏感；整个试验可在链亲和素包被的微滴定皿中进行；只要不改变限制酶切位点，核酸类似物可用来保护DNA骨架不受样品中的核酸酶活性的影响。
在本发明中，可将含有特殊反应基团的膜(可从诸如PallCorporation，East Hills，NY获得)置于一个孔型装置如96孔点印迹装置中。然后可在该设施中合成一个化合物文库，其中在文库合成中加入的一种特殊功能性基团与膜上的特殊反应基团偶联。例如，如果正在合成的文库化合物含有一个氨基基团，该基团将通过一个酰胺键偶联。膜上任何过量的基团将用一种合适的封闭试剂封闭。然后该配体结合的膜就可与事先已被衍生如用生物素或放射活性衍生的生物样品反应。接着可用一种合适的试验来检测配体/受体相互作用。
5．3．4 平衡干扰试验虽然上面介绍的DNA限制酶切位点试验也可被认为是一种平衡干扰试验，但优选的方法是监测配体/分子相互作用对DNA结合蛋白与其识别序列之间的平衡的影响。例如，在筛选能与位于UL9识别序列下游的所选DNA待测序列结合的化合物时，可以使用病毒DNA结合蛋白UL9。该试验的基础是待测序列干扰结合蛋白不与其识别序列结合的平衡的能力。该试验在美国专利No.5，306，619中介绍，该专利在此全文引入作为参考。
根据本发明的原理，位于UL9识别位点下游的待测序列可用作配体文库的骨架，而不是像美国专利No.5，306，619一样用作DNA结合蛋白的靶。一种支架结构物可按如下组成，它含有UL9识别序列，其中一个特殊的核苷酸碱基已用诸如一种标记物如生物素标记，并含有一种配体衍生的寡核苷酸，其末端为地高辛。已知识别序列上生物素的存在不干扰UL9与识别序列的结合，并且当UL9与生物素化的序列结合时，生物素分子被阻断而不能被诸如亲和素或链亲和素固定。UL9可以与该结构物反应并温育至UL9与生物素化的序列之间建立一种平衡。然后可将一种生物样品引入反应混合物，当样品中存在任何对支架上的配体有亲和性的受体时，待测序列将与配体结合，干扰结合蛋白与生物素化的序列之间的平衡，从而使能够与亲和素或链亲和素结合的游离生物素的数量改变。
在该试验方法的一种变化形式中，在与化合物连接前，可以与筛选序列一起合成一种待测序列而不是第二个DNA序列。任何能允许配体连接的支架都可以使用。此外，配体可直接共价连接到筛选序列上而不需要另外的接头或支架。
实施例为更全面地理解这里介绍的本发明，列出了下面的实施例。应当理解，这些实施例仅仅是为了说明，而不是用来以任何方法限制本发明。
实施例1液闪亲近试验是检测配体与受体之间相互作用的一种敏感方法下面的实施例证明了液闪亲近试验(“SPA”)的敏感性。本实施例使用SPA评价了2，5-二苯基恶唑(PPO)-饱和的对氨基苯-β-D-硫代半乳糖苷琼脂糖珠与β-半乳糖苷酶之间的相互作用。
用β-半乳糖苷酶表达载体转化的大肠杆菌在37℃在补加或未补加H235SO4(0.1mCi/mL培养基)的M9CA培养基中生长。用1mM IPTG处理大肠杆菌培养物3小时诱导β-半乳糖苷酶的表达。接着，离心沉淀大肠杆菌培养物，重悬于裂解缓冲液中，通过五轮冻融循环进行裂解。离心除去细胞残渣，用硫酸铵沉淀从上清中分离β-半乳糖苷酶，接着用亲和色谱产生80％的纯化产物。
评价未标记的或标记的β-半乳糖苷酶与2，5-二苯基恶唑(PPO)-饱和的p-氨基苯-β-D-硫代半乳糖苷琼脂糖珠(按Bertoglio-Matte在美国专利4，568，649中介绍的方法制备)之间的相互作用。PPO-饱和的p-氨基苯-β-D-硫代半乳糖苷琼脂糖珠在含有10％奶粉的PBS(8.1mmNa2HPO4、1.5mM KH2PO4、137mM NaCl、2.7mM KCl、0.5mM MgCl2、0.9mM CaCl2)溶液中温育过夜，封闭任何产生非特异应答的位点。另外，可以用试剂诸如白蛋白、去污剂或甚至来自对照溶液的抽提物来封闭珠。接着，将20μL PPO-饱和的p-氨基苯-β-D-硫代半乳糖苷琼脂糖珠与200μL的35S-β-半乳糖苷酶(在液闪混合物中的计数为2.1×105cpm)以及200μL的PBS或200μL的1mg/mL未标记的β-半乳糖苷酶混合。在其他实验中，相同cpm(6.5-7.7×105cpm)的35S标记的大肠杆菌抽提物或H235SO4与20μLPPO-饱和的p-氨基苯-β-D-硫代半乳糖苷琼脂糖珠混合。溶液混合10分钟，然后转入含有1mL 0.2％酪素的PBS的液闪小瓶。珠与β-半乳糖苷酶或H235SO4之间的相互作用通过用Beckman LS 6500液闪计数器评估放射活性来分析。
在含有35S-β-半乳糖苷酶和PPO-饱和的p-氨基苯-β-D-硫代半乳糖苷琼脂糖珠的样品中，检测到了每分钟487+/-52的计数(cpm；n=3)。相反，在同时含有标记和未标记的β-半乳糖苷酶与PPO-饱和的p-氨基苯-β-D-硫代半乳糖苷琼脂糖珠的样品中，检测到了341+／-16 cpm(n=3)。这些结果证明，未标记的β-半乳糖苷酶能竞争性地取代与珠结合的、标记的β-半乳糖苷酶。而且，这些结果表明，SPA能用于检测mM的相互作用。游离的氨基苯硫代半乳糖苷被测定具有仅为1.9 mM的Ki。此外，该结果表明，SPA能用于检测相互之间具有较低亲和性的受体和配体之间的相互作用。在此实施例中，使用PPO，珠对β-半乳糖苷酶的亲和性降低了大约2.3倍。
在含有6.5-7.7×105cpm的35S标记的大肠杆菌抽提物和PPO-饱和的p-氨基苯-β-D-硫代半乳糖苷琼脂糖珠的样品中，检测到了大约3000 cpm。相反，在含有7.7×105cpm的H235SO4和PPO-饱和的p-氨基苯-β-D-硫代半乳糖苷琼脂糖珠的样品中，只检测到了约670cpm。这些结果表明由珠与H235SO4之间的相互作用产生的背景非常低。因此，在含有35S标记的大肠杆菌抽提物的样品中检测到的信号主要是由珠与标记的大肠杆菌蛋白之间的相互作用产生的。在珠与35S标记的大肠杆菌抽提物之间相互作用中检测到的高cpm说明，没有纯化步骤，背景放射活性将掩盖β-半乳糖苷酶与SPA珠的任何特异性吸附。
本实施例证明，液闪亲近试验(SPA)是检测mM水平的配体与受体之间相互作用的一种敏感试验。而且，SPA可用于检测相互之间具有较低亲和性的受体与配体之间的相互作用。
实施例2DNA阻断试验是评估受体和配体之间相互作用的一种敏感方法下面的实施例证明了DNA阻断试验评估受体与配体之间的相互作用的敏感性。
下面显示的两种寡聚体由Clontech，Palo Alto，CA合成(SEQ. ID_) Ⅰ5 ＇ BTT-TTT-TTT-TTT-TAT-ATA-GGA-TCC-TAT-ATA-TTT-TTT-TTT-TTT-TTD-3 ＇B=生物素 D=地高辛(SEQ. ID_)Ⅱ5 ＇AAA-AA-AAA-AAA-AAT-ATA-TAG-GAT-CCA-AAT-TAA-AAA-AAA-AAA-A-3 ＇设计寡聚体，使其在退火时形成一个位于中间的限制酶切位点。使用10∶1比例的Ⅱ∶Ⅰ在退火缓冲液(10mMTris-Cl[pH7.8]、0.1 M NaCl和1.0mM EDTA)中将混合物在65℃温育1小时，接着在57℃温育3小时，使寡聚体退火，然后贮存于-20℃。将两个重复的32.8pmol的退火寡聚体样品在退火缓冲液中稀释，将每个梯度的重复稀释物中的一个按照说明(New England BioLabs，Beverly，MA)用40单位的限制内切酶在37℃水解过夜。对剩下的稀释物进行相同的处理，除了从温育混合物中略去限制内切酶。过夜温育后，将样品加入至链亲和素包被的微滴定皿中，使用HRP衍生的抗地高辛抗体和ABTS底物按照说明(Boheringer Mannheim GmbH，Mannheim，GER)进行分析。然后在405nm处读出样品的吸收值。
用酶处理的样品相对于背景(温育混合物中没有寡聚体)不显示吸收，而未用酶处理的样品即使在低至3pmol的寡聚体浓度时也能显示可清楚检测到的吸收。这样，该系统能检测pmol水平的底物，而基本上没有背景。
实施例3限制内切酶切割DNA支架的能力受到其他试剂与支架的分子相互作用的影响本实施例说明了距限制酶切位点一定距离的分子相互作用能影响限制内切酶活性。
为将DNA寡聚体固定在96孔微滴定板的孔壁上，将65.5pmol的退火DNA样品加入到链亲和素包被的孔中，其中该退火DNA在一个末端用生物素标记，在另一端用地高辛标记，并且含有一个位于中间的限制酶切位点。还建立一个没有DNA的对照孔(表1，第1条)。然后用接合缓冲液中的抗地高辛-过氧化物酶(抗-dig-POD)抗体(Boerhinger Mannheim)处理4个孔。三个孔用没有抗体的接合缓冲液处理。温育1小时后，洗涤孔，三个孔用120单位的限制内切酶在37℃处理1小时(表1，第3、5和7条)。其他孔用不含限制内切酶的相同溶液处理。然后再次洗涤孔，用标准的ELISA检测完整(未水解的)寡聚体。样品中完全的、退火DNA的数量用mOD/mm的Vmax表示。
本试验的结果编辑在下表1中。在没有DNA时，反应的背景Vmax值是0.89。在没有限制酶和没有预处理时(表1，条带2)，完全的、未水解的退火DNA的Vmax值是30.96。相反，当未处理的、固定DNA用限制内切酶处理时，Vmax值是2.52(表1，条带3)。Vmax的降低表明，限制内切酶水解了固定的寡聚体。
用抗dig-POD预处理固定的寡聚体不影响完整寡聚体试验(表1，条带4、6和8)，因为可以分别获得34.96、45.33和53.71的值。但是，用抗-dig-POD预处理能够影响限制内切酶活性(表1，条带5和7)，因为在加入限制内切酶前预处理寡聚体时，寡聚体的水解降低。随后用限制内切酶处理的的预处理样品(表1，条带5和7)分别具有15.17和14.64的Vmax值，而没有经过预处理但进行限制酶切的寡聚体只有2.52的Vmax值。这样，在加入限制内切酶前用抗-dig-POD预处理寡聚体能使限制内切酶的活性降低17倍，这说明抗-dig-POD与地高辛标记的DNA寡聚体之间的相互作用能影响限制内切酶切割寡聚体的活性。这些结果证明，在反应混合物中加入能与寡聚体相互作用的试剂能影响限制内切酶切割寡聚体的能力。
表1 本实施例证明，一种能与DNA骨架上连接的配体相互作用的“受体”能强烈地影响DNA骨架的限制性酶切。
实施例4-8证明了荧光偏振试验的敏感性和生物样品对不同探针的差异结合图谱。这些实施例中使用的分子探针列于表Ⅱ。
实施例4荧光偏振试验是一种检测探针与生物样品之间相互作用的敏感方法下面的实施例证明，各种探针与生物样品的组分结合的能力随该样品中组分的浓度而改变。而且，本实施例还证明了探针与生物样品中的组分的差异结合。
在PBS(pH 7.4)中制备混合的人血清(Sigma Lot#116H4661)的系列稀释物，使样品中的总蛋白的浓度为65.6mg/mL、13.1mg/mL、2.6mg/mL、0.52mg/mL和0.1mg/mL。然后在96孔微滴定板的A1-A6孔中加入150μL PBS和1.0μL含有浓度为1.0×10-3mg/mL的探针#5(表Ⅱ)的DMSO溶液。接着，在A1、A2、A3、A4和A5孔中分别加入10μL含有65.6mg/mL、13.1mg/mL、2.6mg/mL、0.52mg/mL和0.1mg/mL总蛋白的人血清溶液样品。孔A6中不加入人血清溶液。按上述方法制备B1-B6孔作为A1-A6孔中检测样品的一个重复。
与上面的介绍类似，在C1-C6孔中加入150μLPBS和1.0μL含有浓度为1.0×10-3mg/mL的探针#18(表Ⅱ)的DMSO溶液。然后在C1、C2、C3、C4和C5孔中分别加入10μL含有65.6mg/mL、13.1mg/mL、2.6mg/mL、0.52mg/mL和0.1mg/mL总蛋白的人血清溶液样品。孔C6中不加入人血清溶液。按上述方法制备D1-D6孔作为C1-C6孔中检测样品的一个重复。
按上面的介绍对探针#20-24(表Ⅱ)进行类似的处理。然后在Fluorolite FPM-2荧光偏振微滴定系统中对96孔微滴定板进行读数，所获得的荧光偏振(mP)数据用实验重复求取平均值，并对总蛋白作图。结果如图1所示，它证明不同的探针与人血清组分的结合各不相同。而且，人血清中存在的组分的浓度能影响mP值(探针结合的测量)。
实施例5探针#25对混合的人血清和对链亲和素-HRP接合物的剂量应答本实施例证明，探针可用来区别生物样品。而且，本实施例还证明，探针与生物样品的组分结合的能力依该组分浓度的不同而不同。为确定在存在血清蛋白时能否观察到与一种探针的强结合相互作用，我们测定了探针#25(表Ⅱ)对混合人血清和对链亲和素-HRP接合物的剂量应答。在PBS(pH=7.4)中制备混合的人血清(Sigma Lot#116H4661)的系列稀释物，使样品中的总蛋白的浓度为65.6mg/mL、13.1mg/mL、2.6mg/mL、0.52mg/mL和0.1mg/mL。然后在96孔微滴定板的A1-A6孔中加入150μLPBS和1.0μL含有浓度为1.0×10-3mg/mL的探针#25的DMSO溶液。接着，在A1、A2、A3、A4和A5孔中分别加入10μL含有65.6mg/mL、13.1mg/mL、2.6mg/mL、0.52mg/mL和0.1mg/mL总蛋白的人血清溶液样品。A6孔中不加入人血清溶液。按上述方法制备B1-B6和C1-C6孔作为A1-A6孔中检测样品的重复。
在PBS(pH=7.4)中制备链亲和素-HRP接合物(Sigma 59420)的系列稀释物，使样品中的总蛋白的浓度为1.0mg/mL、0.1mg/mL、0.01mg/mL、0.001mg/mL、0.0001mg/mL、和0.00001mg/mL。然后在另一块96孔微滴定板的A1-A7孔中加入150μL PBS和1.0μL含有浓度为1.0×10-3mg/mL的探针#25的DMSO溶液。接着，在A1-A6孔中加入10μL含有1.0mg/mL、0.1mg/mL、0.01mg/mL、0.001mg/mL、0.0001mg/mL、和0.00001mg/mL总蛋白的人血清溶液样品。孔A7中不加入人血清溶液。。按上述方法制备B1-B7孔作为A1-A7孔中检测样品的一个重复。然后用Fluorolite FPM-2荧光偏振微滴定系统测定或测量两块96孔微滴定板中样品的荧光偏振，所获得的荧光偏振(mP)数据用实验重复求取平均值，并对总蛋白的log作图。
数据如图2所示，这些数据说明，探针#25对血清蛋白的结合非常弱，在本实验的条件下，观察到探针的结合需要大约100μg的血清蛋白。相反，探针#25与链亲和素-HRP接合物的结合在存在1.0μg的链亲和素-HRP接合物时就能完成。因此，探针#25对链亲和素-HRP比对人血清具有更高的亲和性。
实施例6在混合的人和牛血清中使用探针#25检测链亲和素-HRP接合物下面的实施例证明，在混合的生物样品中，对探针具有高亲和性的组分能在低浓度时被检测出来。
为确定少量的强结合蛋白(链亲和素-HRP接合物)能否在存在血清蛋白时被检测出来，在混合的人血清中加入链亲和素-HRP接合物，并检测对探针#25(表Ⅱ)的应答。首先，在一块96孔微滴定板的A1-A3孔中加入150μLPBS和10μL含有浓度为1.0×10-3mg/mL的探针#25的DMSO溶液。然后，在所有三个孔中加入10μL浓度为13.1mg/mL总蛋白的人血清溶液样品(通过在PBS中按1∶5稀释Sigma混合血清Lot#116H4661来获得)。这样，每个孔中人血清的总量为131μg。这三个孔代表测定131μg血清蛋白与探针#25结合的三个重复。
然后，在96孔微滴定板的B1-B3孔中加入150μL PBS和1.0μg含有浓度为1.0×10-3mg/mL的探针#25的DMSO溶液。在孔B1-B3中加入10μL浓度为13.1mg/mL总蛋白的人血清溶液样品(通过在PBS中按1∶5稀释Sigma混合血清Lot#116H4661来获得)和10μL含有0.1mg/mL总蛋白的链亲和素-HRP接合物溶液样品。每个孔中人血清蛋白的总量为131μg，而链亲和素-HRP接合物的总量是1.0μg。孔B1-B3代表在存在131μg血清蛋白时测定探针#25与1.0μg链亲和素-HRP接合物蛋白结合的三个重复。
微滴定板中样品的荧光偏振在Fluorolie FPM-2荧光偏振微滴定系统中读取。所获得的偏振(mP)数据用三次测定取平均值，设计一种条图来显示在存在链亲和素-HRP接合物和血清蛋白时与只有血清蛋白时偏振(mP)发生的改变。结果如图3所示，它表明探针#25与1.0μg链亲和素-HRP接合物蛋白的结合在存在131μg血清蛋白时很容易检测。这些结果表明，荧光偏振试验是检测探针与以μg/mL浓度存在的样品成分之间的结合的敏感方法。
实施例7 使用探针#1-25为带有或无链亲和素-HRP接合物的血清构建“指纹”下面的实施例证明，少量强结合组分的存在能改变生物样品的指纹。
首先，在96孔微滴定板的A1-A12孔中加入150μLPBS和1.0μL的探针#1-12的DMSO溶液，每种探针的浓度均为1.0×10-3mg/mL。这使得孔A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A11和A12分别含有1.0μL的探针#1、#2、#3、#4、#5、#6、#7、#8、#9、#10、#11和#12(表Ⅱ)的1.0×10-3mg/mL溶液以及150μL PBS。B1-B12孔用相同方式进行处理，作为探针1-12的重复试验。
其次，在同一96孔微滴定板的C1-C12孔中加入150μLPBS和1.0μL的探针#13-24的DMSO溶液，每种探针的浓度均为1.0×10-3mg/mL。这使得孔C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11和C12分别含有1.0μL的探针#13、#14、#15、#16、#17、#18、#19、#20、#21、#22、#23和#24(表Ⅱ)的1.0×10-3mg/mL溶液以及150μL PBS。D1-D12孔用相同方式进行处理，作为探针13-24的重复试验。然后，在孔E1和E2中加入150μLPBS和1.0μL探针#25的1.0×10-3mg/mL DMSO溶液。接着，在96孔板上的A1-A12、B1-B12、C1-C12、D1-D12和E1-E2孔中加入10μL按1∶10稀释的混合人血清(Sigma Lot#116H4661)。10μL血清中的总蛋白含量是65.6μg。
然后，在Fluorolite FPM-2荧光偏振微滴定系统中读取96孔板上每个孔的荧光偏振，所获得的偏振(mP)值在条图上作图，用来显示该血清样品的“指纹”。结果示于图4。
然后，在每个孔中加入10μL含有0.1mg/mL总蛋白的链亲和素-HRP接合物溶液。加到每个孔中的总链亲和素-HRP接合物蛋白为1.0μg。然后，板在Fluorolite FPM-2荧光偏振微滴定系统中读数，所获得的偏振(mP)值在示于图5的条图上作图。该图描述了加有链亲和素-HRP接合物的血清样品的“指纹”。该结果表明，在血清样品中可以检测到少量链亲和素-HRP接合物蛋白的存在，而且这种蛋白能改变观察到的血清指纹。这些结果说明，可以使用荧光偏振试验筛选能区分生物样品中正常和异常组分的探针。
实施例8-9证明，荧光偏振试验可用来筛选能将复杂混合物彼此分开的探针文库。
实施例8 能与人和牛血清差异结合的探针的鉴定使用荧光偏振测定表Ⅱ所列的4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-indacene-3-丙酸(BO)标记的化合物1-19(分子探针，Eugene，OR)与胎牛血清或人血清之间的相互作用。人血清(Sigma Lot#116H4661)含有65.6mg/mL总蛋白，而胎牛血清(Sigma Lot#96H4615)含有47.3mg/mL总蛋白。为减小总蛋白浓度的影响，本实验使用10μL的胎牛血清和47.3/65.6×10μL=7.2μL的人血清。
在96孔微滴定板的A1-A10、B1-B10、C1-C9、D1-D9、E1-E10、F1-F10、G1-G9和H1-H9孔中加入150μL的PBS。在孔A1-A10、B1-B10、C1-C9、D1-D9、E1-E10、F1-F10中加入1.0μL化合物1-10的二甲基亚砜(DMSO)溶液，每种化合物的浓度为1.0×10-3mg/mL。在这种方式中，孔A1、B1、E1和F1每个都含有150μL的PBS和1.0μL1.0×10-3mg/mL的化合物#1的DMSO溶液。与此类似，孔A2、B2、E2和F2都含有150μL的PBS和1.0μL1.0×10-3mg/mL的化合物#2的DMSO溶液，孔3-10也是如此。在孔C1-C9、D1-D9、G1-G9和H1-H9中，加入1.0μL化合物11-19的二甲基亚砜(DMSO)溶液，每种化合物的浓度为1.0×10-3mg/mL。在这种方式中，孔C1、D1、G1和H1每个都含有15μL的PBS和1.0μL1.0×10-3mg/mL的PBS和1.0μL1.0×10-3mg/mL的化合物#12的DMSO溶液。孔13-19也是如此。然后将此板在Fluorolite FPM-2荧光偏振微滴定系统中用485nm的激发滤镜和530nm的发射滤镜进行读数。所获得的偏振(mP)和强度数据代表空白读数。
然后，在含有PBS和如上所述的探针的孔A1-A10、B1-B10、C1-C9、D1-D9中加入7.2μL人血清(Sigma Lot#116H4661)。这样，A1-A10和B1-B10系列是化合物1-10在人血清中的重复试验，系列C1-C9和D1-D9是化合物11-19在人血清中的重复试验。与此类似，在含有PBS和如上所述的探针的孔E1-E10、F1-F10、G1-G9和H1-H9中加入10μL的胎牛血清(Sigma Lot#96H4615)。这样，这样，E1-E10和F1-F10系列是化合物1-10在胎牛血清中的重复试验，系列G1-G9和H1-H9是化合物11-19在胎牛血清中的重复试验。然后按上面的介绍在Fluorolite FPM-2荧光偏振微滴定系统中读取数据。产生的偏振(mP)和强度数据示于图6。对每种探针的mP值作条图。前两个条代表每种探针在人血清中重复试验的值，后两个条代表每种探针在胎牛血清中重复试验的值。该mP数据代表从标记发射偏振的程度。较高的读数表明，标记化合物与一个大分子结合，而较低的读数表示标记化合物结合的程度较低。我们可以看出，化合物#2和#18在人血清中与一种大分子结合的程度比在胎牛血清中高。
实施例9 能与来自不同哺乳动物种类的生物样品差异结合的探针的鉴定下面的实施例证明了生物样品可被彼此区分，包括区分种类与种类、疾病与非疾病，这种区分的基础是当它们用探针文库筛选时产生的差异结合图谱。
在96孔微滴定板中将1μL表3中列出的每种样品与荧光标记的分子组合，并使用Fluorolite FPM-2荧光偏振微滴定系统测量荧光偏振。在荧光偏振试验中使用下面的荧光标记探针终浓度约为0.18nM的BODIPY标记的肌-肌醇-1-磷酸(探针18，Molecular Probes)、终浓度为10.5nM的荧光素标记的phenytoin(探针70；Sigma)、终浓度约为0.096μg/mL的荧光素标记的探针129(Sepracor)、终浓度约为0.078μg/mL的荧光素标记的探针135(Sepracor)、终浓度约为0.09μg/mL的荧光素标记的探针147(Sepracor)。测定每种探针与血浆或细胞抽提物之间相互作用的荧光偏振值。
表3试验中使用的生物样品名单 以荧光偏振值为基础，BODIPY标记的肌-肌醇-1-磷酸(探针18)证明了与来自不同种类的样品的差异结合(图7)。例如，使用探针18，混合的人血浆的荧光偏振值约比混合的牛血清或混合的胎牛血清的荧光偏振值高3倍。但是，在来自相同种类的样品的荧光偏振值中几乎没有观察到差异。例如，使用探针18，在混合的WKY大鼠血浆和混合的SHR大鼠血浆中没有检测到明显的荧光偏振值的差异。这些结果表明，探针如肌-肌醇-1-磷酸可以用来获得有关来自不同种类的信息。
荧光素化的phenytoin(探针70)的荧光偏振值表明，它也是一种能用来区分来自不同种类的血浆的探针(图8)。例如，用探针70获得的混合人血浆的荧光偏振值比其他样品要高得多。此外，在混合的牛血清和混合的胎牛血清之间也检测到荧光偏振值的明显差异。这些结果说明，探针如荧光素化的phenytoin不仅可用于区分来自不同种类的样品，还可用来区分来自同一种类但不同发育时期的样品。
具有类似结构的探针也可用于区分来自不同种类的样品。探针147、129和135在结构上相似(图9A、10A和11A)，都使用固相化学舍成并在一个荧光素骨架上构建，它们能为来自列于表3的6种灵长类动物的血液样品的分类提供足够的信息。探针147和129证明，与灵长类动物(人类和非人类)血浆温育后的荧光偏振值比与非灵长类动物血浆(图9B和10B)温育后高。但是，探针129在与来自猴的血浆温育后比与来自人的血浆温育后显示的偏振信号高(图10B)。探针135与非洲绿猴血浆样品温育后观察到的荧光偏振值比与来自其他猴或人的血浆温育后高(图11B)。因此，可对探针129、135和147与灵长类动物血浆样品的差异结合进行编辑，从而可以使用这些信息来准确地对彼此的样品进行区别。
实施例10 能区分金黄色葡萄球菌和二甲氧基苯基青霉素抗性的金黄色葡萄球菌的探针的鉴定下面的试验用来鉴定能用于区分金黄色葡萄球菌(S.aureus)、二甲氧基苯基青霉素抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)和大肠杆菌(E.coli)的探针。
将金黄色葡萄球菌(SA)、二甲氧基苯基青霉素抗性的金黄色葡萄球菌(MRS)和大肠杆菌(E.coli)接种于25ml或35ml体积的心脑浸出液培养基(BHI，Difco)中。培养物在37℃摇床上温育至大肠杆菌、SA和MRSA的OD660nm值分别达到0.344、0.411和0.367。上述培养物OD660nm值的任何差异在表中说明。在本实验中，在黑色的96孔荧光偏振微滴定板中将5ul培养样品稀释在100ul磷酸缓冲盐(PBS)+0.1％牛γ球蛋白BGG中。接着，在细胞悬液中加入5ul稀释的、终浓度约为10nm的、来自文库的荧光标记探针，将板在37℃温育30分钟或指示的温育时间。温育之后，使用Fluorolite FPM-2荧光偏振微滴定系统测定每个样品中的荧光偏振数量。对每种探针进行重复的荧光偏振测定。
荧光偏振实验中使用的荧光标记探针从外面购买或在Sepracor合成。表4列出了探针名称、使用的荧光标记、探针来源和探针号。
表4 荧光标记探针方库 根据荧光偏振值，有四个探针(11A、10B、6D和10E)显示与葡萄球菌菌株的结合对比与BHI培养基(未接种)或大肠杆菌样品的结合有差异(表5)。使用探针10B、10E和6D重复荧光偏振试验以确定它们能够用来区分SA与MRSA。探针10B和10E不能显示与金黄色葡萄球菌(SA)和二甲氧基苯基青霉素抗性的金黄色葡萄球菌(MRS)的差异结合。使用探针10B或10E，在SA、MRSA、大肠杆菌和未接种的BHI培养基样品中没有获得明显的荧光偏振值差异(表6)。因此，探针10B和10E不能用来区分SA与MRSA、大肠杆菌和未接种的BHI培养基。
表5用荧光标记分子检测的细菌培养物样品的荧光偏振值 表6 探针10B和10E不能用于区分细菌菌株 由使用探针6D的荧光偏振试验获得的结果表明，该探针能用于区分SA与MRSA、大肠杆菌和未接种的BHI培养基(表7；图2)。与甲氧基苯基青霉素抗性的金黄色葡萄球菌(MRS)、未接种的BHI培养基和大肠杆菌(E.coli)相比，从金黄色葡萄球菌(SA)可以获得较高的荧光偏振值。这个荧光偏振值的差异只有当细菌样品来自温育了5小时以上的培养物时才能检测到(表7；图12)。只有在培养物温育时间是7.5小时或24小时时，SA样品才显示比MRSA样品的荧光偏振值高。从BHI培养基获得的荧光偏振值只有在培养物温育时间是7.5小时或24小时时，才比从SA和MRSA获得的荧光偏振值低。相反，大肠杆菌一直显示最低的荧光偏振值。因此，探针6D与细菌样品组分的结合能力随细菌培养物温育时间的增加而改变。
由探针6D获得的荧光偏振水平在SA样品中随时间而增加，但在其他样品中随时间而减小。例如，大肠杆菌的荧光偏振值从由温育1小时的培养物获得的样品的211.8+／-8.8mP减少到由温育24小时的培养物获得的样品的173.4+/-3.1mP(表7)。相反，SA的荧光偏振值从由温育1小时的培养物获得的样品的233.3+/-5.1mP增加到由温育24小时的培养物获得的样品的279.0+/-3.3mP(表7)。这些结果说明，探针6D优先与SA的某些未知组分结合，而随着温育时间的增加，这些组分的表达也增加。而且，这些结果还表明，探针6D可以用来区分SA与MRSA。
本实施例证明，该试验系统可用于筛选能区分细菌菌株的探针。在本实施例中，从一个含80种荧光标记探针的小文库中发现了一个能用于区分上面介绍的实验中所使用的三种细菌菌株的探针(6D)。
表7探针6D能用于区分细菌菌株 实施例11 探针6D从其他细菌菌株中区分金黄色葡萄球菌的能力下面的实验用来确定探针6D是否能用于从其他细菌中区分金黄色葡萄球菌(SA)。
将5种不同细菌菌株的12个培养物接种于35ml体积的心脑浸出液培养基(BHI，Difco)中。虽然每种培养物的种类对实验者来说是未知的，但已知4种培养物含有金黄色葡萄球菌(SA)，2种培养物含有甲氧基苯基青霉素抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)，2种含有喹啉抗性的金黄色葡萄球菌(QRSA)，2种含有万古霉素抗性的屎肠球菌(VREF)。培养物在37℃摇床上温育过夜。第2天，从12个培养物中每个取出7个5ul的样品，并在黑色的96孔荧光偏振微滴定板中将其稀释于100ul磷酸缓冲盐(PBS)+0.1％牛γ球蛋白BGG中。接着，将5ul约10nM探针6D荧光素标记的Sep0119288加入到细胞悬液中，并将板在37℃温育30分钟或指示的温育时间。温育后，使用FluoroliteFPM-2荧光偏振微滴定系统测定每个样品中的荧光偏振数量。将12种未鉴定培养物每种的7个样品的最高和最低偏振读数除去，对剩下的5个值求平均数和标准差。
对含有细菌细胞的细菌培养物样品测定的荧光偏振值示于表8。根据荧光偏振值对12种培养物的荧光偏振试验结果进行分组。这些分组示于图13。每种分组都相当于一个细菌菌株(表9)。SA培养物具有最高荧光偏振值，大肠杆菌具有最低的荧光偏振值(图13)。因此，使用这种简单的荧光探针，可以将12种未知的培养物准确地分成5个菌株，并且可将SA从本研究使用的其他有机体中区分出来。
表8使用探针6D检测的12种未确定培养物的荧光偏振值
表9.根据荧光偏振值将12种未鉴定的细菌培养物分成5个对应于细菌菌株的组
本实施例证明，本发明提供了一种区分细菌菌株的方法。而且，本实施例表明，本发明的技术可用于检测和诊断感染性微生物。
实施例12配体文库的合成方法1荧光标记的胺的液相合成伯胺和仲胺分别用FITC(1.2倍)在存在二甲基吡啶(DMAP)的情况下在DMF或DMSO中在室温下分别用FITC(1.2倍)进行处理(如果使用胺盐，加入等量的三乙基胺使胺游离)。大约24小时后，将2倍量的胺清除树脂((tris-(2-aminoethyl)-amine polystryrene HL树脂)加入到反应混合物中。24-48小时后，过滤混合物除去树脂，并进一步用DMSO将含有纯化的荧光标记配体的滤液稀释到筛选所需的浓度。表10列出了按照方案Ⅰ使用液相合成的荧光标记胺。
表10表10 荧光标记胺的名单
方法2胺氨基甲酸Wang树脂的合成将Wang树脂(25g，20mmol，0.8mmol/g载量)和carbonyldiimidazole(CDI)(20g，120mmol)在干燥的THF(180ml)中在室温振荡2天。将混合物过滤，并用DMF、THF和CH2Cl2彻底洗涤树脂，干燥树脂，从而获得imidazole carbonyl Wang树脂(27g)。
然后在单独的反应管中用哌嗪(1.7g，20mmol)、同型哌嗪(2.0g，20mmol)或4，4’-trimethylenedipiperidine(4.2g，20mmol)在THF/DMF(1∶1，40ml)中在室温下处理imidazole carbonyl Wang树脂(5g，4mmol，0.8mmol/g载量)20分钟。然后用DMF、THF和CH2Cl2彻底洗涤树脂，真空干燥，分别获得相应胺氨基甲酸Wang树脂。
方法3通过胺氨基甲酸接头合成Wang树脂上的DTAF将胺氨基甲酸Wang树脂(1.0倍量)与DTAF盐酸(2.5倍量)在DMF中在存在diisopropylethylamine(DIPEA)(4.0倍量)的情况下在室温振荡12-17小时。过滤树脂，并用DMF、THF和CH2Cl2彻底洗涤树脂，真空干燥，得到Wang树脂上的monochlorotriazylfluorescein。
方法4通过胺接头合成三苯甲基或氯三苯甲基树脂上的DTAF将三苯甲基胺或2-氯三苯甲基胺树脂(Novabiochem)(0.12mmol，1.0倍量)与DTAF(0.3mmol，2.5倍量)在DMF(ml)中在存在DIPEA(0.48mmol，4.0倍量)的情况下在室温振荡24-40小时。树脂用DMF、THF和CH2Cl2彻底洗涤树脂，真空干燥，产生三苯甲基树脂上的monochlorotriazylfluorescein。
方法5合成RINK树脂上的DTAF用DMF(5ml)中30％的哌啶溶液处理Rink酰胺树脂(1g，0.8mmol，0.8mmol/g载量)2小时，所产生的Rink酰胺树脂用DMF洗涤，接着用DCM洗涤，然后干燥。然后将Rink酰胺树脂(0.8mmol)与5ml DMF中的DTAF(2.5倍量，2mmol)和DIPEA(4.0倍量，3.2mmol)振荡24小时。用DMF/THF洗涤树脂，然后用DCM洗涤，真空干燥，得到Rink树脂上的monochlorotriazylfluorescein。
类似地，Rink树脂上的Fmoc-氨基(在标准的肽合成条件下如DIC/DMAP/DCM由Rink胺树脂和Fmoc-氨基酸制备)在DMF中用哌啶处理来除去Fmoc基团。然后用2.5倍量的DTAF和4.0倍量的DIPEA在DMF中在室温下处理氨基酸Rink树脂24小时。洗涤和干燥后，就得到Rink树脂上的monochlorotriazylfluorescein。
方法6荧光接头与一种二胺的反应一种固相支持如Wang树脂或三苯甲基树脂上的monochlorotriazylfluorescein用4.0倍量的一种对称二胺在DMF中在室温下处理24-40小时，然后用DMF/MeOH洗涤树脂，接着用DCM洗涤，真空干燥，得到一种固相支持上的氨基荧光素。
方法7制备一种荧光素标记的脲化合物文库三种氨基酸Rink树脂(即方案Ⅰ中的L1为CH3、异丁基、苄基)(各500mg，0.4mmol，0.8mmol/g载量)在单独的试管中按照上面方法5中的介绍分别用DTAF(2.5倍量)处理，得到树脂上的三种不同的单氯荧光素衍生物。然后分别用哌嗪(各4.0倍量)和4，4’-trimethylenedipiperidine(4.0倍量)按照方法6处理这些树脂(各250mg，0.2mmol)，得到6种氨基荧光素标记的树脂。然后将这6种氨基荧光素树脂(各25mg，0.02mmol)分别与10种异氰化物(各3.0eq)在THF中以平行方式进行反应，得到60种树脂上的荧光标记脲化合物。然后用30％的TFA/DCM切割树脂，接着真空干燥，得到60种单独标记的荧光脲化合物(用HPLC/MS分析证实)，将它们溶于1ml的DMSO，用于生物筛选。
方法8通过胺接头将DCSF连接到WANG树脂或三苯甲基树脂上将胺氨基甲酸Wang树脂(4mmol，0.8mmol/g)与DCSF(2.0倍量，8mmol)在50ml干燥的DMF中在存在DIPEA(2.0倍量，8mmol)的情况下在室温振荡2-3小时。然后用DMF、MeOH、接着用DCM洗涤树脂，干燥，得到Wang树脂上的monochlorosulfofluorescein。
以相似的方式，用DCSF在存在DIPEA的情况下在DMF中处理一种哌嗪三苯甲基树脂，得到三苯甲基树脂上的monochlorosulfofluorescein。
方法9monochlorosulfofluorescein与环二胺的反应来自方法8的Wang树脂上的荧光素(1.33mmol，1.0倍量)用一种环二胺如哌嗪(4.0mmol，3.0倍量)在10ml的DMF中处理24小时。然后用DMF/MeOH洗涤树脂，接着用DCM洗涤，真空干燥，得到Wang树脂上的氨基sulfofluorescein。
方法10制备sulfofluorescein标记的文库含有不同的二胺接头(例如哌嗪、同型哌嗪和4，4’-trimethylenedipiperidine的组合物)的氨基sulfofluorescein Wang树脂以一种平行的方式用不同的有机酸(10倍量)在存在一种偶联试剂如diisopropylcarbodiimide(DIC)(10倍量)和DMAP(5.0倍量)在DMF/DCM中在室温下处理24-48小时。当胺被完全酰化后(接着切下少量树脂进行HPLC)，用DMF/MeOH洗涤树脂，接着用DCM洗涤，真空干燥。然后使用30％的TFA/DCM切割树脂，接着真空干燥，得到所需的荧光素标记的化合物。
方法11荧光素标记的QUINZALINONE的合成第1步，Wang树脂结合的O-羟胺(参考文献Floyd，C.D.等，Tetrahedron Lett.1996，vol.37，8045)(2.0g，1.6mmol，0.8mmol/g载量)用isatoic酐(6.4mmol，4.0倍量)在25ml的DMF中在存在DMAP(0.8mmol，0.5倍量)的情况下在65-70℃振荡处理26小时。然后过滤所产生的树脂混合物，并用DMF、MeOH和DCM彻底洗涤，干燥，得到树脂上的N-羟胺。
第2步，N-羟胺树脂(0.04mmol，50mg，0.8mmol/g载量)用商业渠道获得的第一组Fmoc保护的α-氨基酸(0.2mmol，5.0倍量)、偶联试剂PyBrOP(Bromo-tris-pyrrolidino-phosphoniumhexafluorophosphate，0.2mmol，5.0倍量)和DMAP(0.2mmol，5.0倍量)在二甲基乙胺(DMAC)溶剂(0.6ml)中在60-65℃振荡处理20-24小时。将树脂过滤，并用DMF、MeOH和DCM彻底洗涤，干燥，得到树脂上的quinazolinone。然后将树脂悬于DMF中的(0.6ml)的30％哌啶中，以从氨基基团上除去Fmoc保护基团，在过滤和洗涤后，得到游离的氨基quinazolinone树脂，用于下一个反应性模块的连接。
第3步，树脂上的氨基quinazolinone(50mg，0.04mmol)用第二组Fmoc保护的α-氨基酸(0.2mmol，5.0倍量)、偶联试剂DIG(diisopropylcarbodiimide，0.2mmol，5.0倍量)和DMAP(0.2mmol，5.0倍量)在DMF(0.6ml)中在室温下处理20-24小时。然后将树脂过滤，并用DMF、MeOH和DCM彻底洗涤，干燥。然后将树脂悬于DMF中(0.6ml)的30％哌啶中，以从氨基基团上除去Fmoc保护基团，在过滤和洗涤后，得到游离氨基树脂，用于染料的连接。
第4步，氨基树脂(0.04mmol)用DTAF-HCl染料(Dichlorotriazylamino fluorescein monohydropylethylamine，0.08mmol，2.0倍量)和DIPEA(diisopropylethylamine，0.16mmol，4.0倍量)在DMF(0.6ml)中在室温下振荡处理20-24小时。然后将树脂过滤，并用DMF、MeOH和DCM彻底洗涤，干燥，得到荧光标记的树脂上的quinazolinone。
第5步，荧光标记的树脂(0.04mmol)用DCM中(1.0ml)的30％三氟乙酸(TFA)在室温下振荡处理1-2小时。将此混合物过滤，并用0.5ml的DCM洗涤树脂。收集合并的滤液，真空蒸发进行干燥，得到所需的荧光标记的quinazolinone配体，后者可溶于DMSO用于筛选。
使用不同的isatoic酐和Fmoc-保护的氨基酸以平行的方式进行上述反应，就可制备上述荧光标记的quinazolinone配体文库。
方法12使用固相上的UGI偶联合成配体Rink胺树脂(1.0倍量)(用DMF中25％的哌啶处理商业化的Rink胺树脂制备)在MeOH/DCM(1∶2，v/v)中膨胀。加入酐(10倍量)和Fmoc-保护的氨基酸(10倍量)。混合物在室温下振荡1-2小时。然后加入异氰化物(10倍量)。混合物在室温下振荡20-24小时。然后将树脂过滤，并用DMF、MeOH和DCM充分洗涤，并干燥。树脂接着用DMF中的25％哌啶处理，得到含有一个游离氨基基团的树脂。然后将该树脂用DMF中的2.0-3.0倍量的DTAF和4-6倍量的DIPEA处理，在常规的过滤和洗涤后，得到树脂上的荧光标记的配体。然后用TFA/DCM从树脂上切割并干燥，得到所需的荧光标记的配体。
实施例13使用荧光偏振区分和鉴定人血清样品下面的实施例说明使用本发明来区分和/或鉴定两个或更多的人血清样品。例如，当样品用一个探针文库进行筛选时，根据所产生的结合图谱的差异，正常和异常血清可相互区别。此外，使用合适的探针溶液，本发明可用来将糖尿病血清与正常或其他非糖尿病血清区别。下面的讨论说明了可用于区分人血清样品的一般方法。
将来自三个不同文库板(XN1192、XN1043-58、GY1175-96和板1)的荧光标记探针与购自Western States Plasma Company(Fallbrook，CA)的血清样品混合。血清样品包含来自三个糖尿病病人(由参考实验室证明是糖尿病)的混合的糖尿病血清和来自正常个体的混合血清(Lot HS300；SeraCare，Oceanside，California)。
首先，将2.5ul每种荧光标记探针(1-10nM)与95ul缓冲液(PBS+O.03％十二烷基硫酸锂)和5ul血清在96孔板中混合。然后将混合物在37℃温育30分钟。将指示的血清样品在20，000xg离心3.5小时，并取5ul下层的、淡黄色的血清层，进行探针结合分析。使用FluoroliteFPM-2荧光偏振微滴定系统测定每种探针与每种样品的荧光偏振。每种探针对每种样品检测三个重复，并求取平均的荧光偏振值(mP)。
在使用80种荧光素标记的探针进行的初步筛选中，探针在从两种血清样品中获得的荧光偏振值中显示明显的差异。表11中列出的和表12中描述的探针在从正常的混合血清(Lot HS300)和糖尿病血清获得的荧光偏振值中显示明显的差异(图14)。表11中列出的12种探针中有10种在糖尿病血清中获得的荧光偏振值比在正常血清(LotHS300)中获得的要高。这些结果显示，探针58A2、58A3、58A6、58B6、58B7、58B11、58H8、96G3、54G3和P184优先与糖尿病血清中的某些成分结合。 从正常(Lot HS300)和糖尿病血清样品获得的荧光偏振值有差异的一个可能的原因是，糖尿病血清中的脂类含量比正常血清中高。为确定糖尿病血清中的脂类含量是否影响所获得的荧光偏振值，通过离心将血清样品脱去脂类，并使用表11中列出的相同探针测定荧光偏振值．用这些探针获得的荧光偏振值列于表12，并在图15中用图形的方式描述．使用探针58A2、58A3、58A6、58B6、58B7、58B11、58H8、96G3、54G3和P1B4在糖尿病血清和正常血清(Lot HS300)中获得的荧光偏振值之间的差异程度在血清被脱去脂类时似乎更大。脱脂糖尿病血清的荧光偏振值比未脱脂的糖尿病血清高。这些结果说明，糖尿病血清中的脂类含量不能解释为什么糖尿病血清比正常血清(Lot HS300)更优先结合探针58A2、58A3、58A6、58B6、58B7、58B11、58H8、96G3、54G3和P184。而且，这些结果表明，糖尿病血清中存在的脂类能降低探针58A2、58A3、58A6、58B6、58B7、58B1l、58H8、96G3、54G3和P1B4与糖尿病血清中存在的另一种组分的结合亲和性。 对于探针56C6和54E8，脱脂糖尿病血清和脱脂正常血清(LotHS300)之间的荧光偏振值差异与在两种含有脂类的血清中观察到的差异相比没有改变。但是，除去血清中含有的脂类大大影响了使用探针54G3和P1B4从正常(Lot HS300)和糖尿病血清中获得的荧光偏振值差异。在存在脂类时，使用这两种探针在糖尿病血清中获得的荧光偏振值明显高于从正常血清(Lot HS300)获得的值。但是，在脱脂血清中，使用探针54G3和P1B4从正常(Lot HS300)和糖尿病血清中获得的荧光偏振值几乎相同。这些结果说明探针54G3和P1B4与糖尿病血清中的一种脂类可溶性配体结合。脱脂对探针结合的影响说明，探针至少与三种或更多的靶的结合。
总的来说，上面介绍的结果证明，人血清样品可使用本发明介绍的以荧光偏振为基础的试验彼此区分。而且，本实施例使用的方法可用于鉴定能区分正常和糖尿病血清的探针。
表Ⅱ实施例4-8中的BO-和FL-标记的化合物
表Ⅱ(续)实施例4-8中的BO-和FL-标记的化合物
表Ⅱ(续)实施例4-8中的BO-和FL-标记的化合物
表12本发明中使用的探针的结构
本发明并不限于在这里介绍的特殊实施方案的范围内，这些实施方案只是用来说明本发明的各个方面。事实上，除了这里显示和介绍的内容，根据前面的介绍和附图，本发明的各种修改对本领域的技术人员来说非常明显。这些修改也在附录的权利要求的范围内。
这里引用的所有参考文献在用于所有目的时都在这里全文引入作为参考。
权利要求
1．分析由分子组分的混合物组成的样品的方法，包括(a)将该样品与一种分子探针文库在允许分子探针与其特殊的结合伙伴结合的条件下作用；并(b)使用一种均一的试验系统检测分子探针文库的单个成员与样品中的分子组分的任何结合，其中文库成员与样品的结合图谱为该样品提供了一种分子指纹。
2．权利要求1的方法，其中分子探针文库的成员是被标记的。
3．权利要求2的方法，其中标记是荧光。
4．权利要求3的方法，其中文库成员与样品组分的结合用荧光偏振来检测。
5．权利要求2的方法，其中分子探针与一种光激活功能基团交联。
6．权利要求5的方法，其中功能基团被活化，并且在探针与样品的一种组分之间形成一种化学键。
7．权利要求2的方法，其中探针用一种闪烁剂标记，样品的组分用放射性标记。
8．权利要求7的方法，其中探针与生物样品的组分之间的相互作用导致光发射。
9．权利要求1或4的方法，其中文库的成员是生物分子。
10．权利要求9的方法，其中文库中的生物分子是糖蛋白、脂蛋白、蛋白、多肽、肽、肽类似物、氨基酸、多糖、寡糖、糖、多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、核苷、DNA或一种衍生物、RNA或一种衍生物、脂、糖脂、脂多糖、有机分子或无机分子。
11．权利要求10的方法，其中文库中的生物分子是受体、配体、抗体、抗原、表位、生长因子、细胞因子、或趋化因子。
12．权利要求1或4的方法，其中样品是病人样品或临床样品。
13．权利要求1或4的方法，其中样品是体液、尿液、淋巴、全血、血清、血浆、红细胞、白细胞、组织、细胞、细胞抽提物、体外转录或翻译的产物、病毒、微生物、或病原有机体的抽提物。
14．权利要求13的方法，其中将使用分子探针文库在样品中产生的分子指纹与使用分子探针文库在阴性对照样品中产生的分子指纹进行比较。
15．权利要求14的方法，其中阴性对照样品来自一个正常的供体。
16．权利要求13的方法，其中将使用分子探针文库在样品中产生的分子指纹与使用分子探针文库在阳性对照样品中产生的分子指纹进行比较。
17．权利要求16的方法，其中阳性对照样品来自一个生病或受影响的供体。
18．权利要求1或4的方法，其中样品中分子组分是糖蛋白、脂蛋白、蛋白、多肽、肽、肽类似物或氨基酸。
19．权利要求1或4的方法，其中样品中的分子组分是多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、核苷、DNA或一个衍生物、或RNA或一个衍生物。
20．权利要求1或4的方法，其中样品中的分子组分是多糖、寡糖或糖。
21．权利要求1或4的方法，其中样品中的分子组分是脂类、糖脂、脂多糖或脂蛋白。
22．权利要求1或4的方法，其中样品中的分子组分是有机分子或无机分子。
23．权利要求1或4的方法，其中样品中的分子组分是受体、配体、抗体、抗原、表位、生长因子、细胞因子或趋化因子。
24．一种分析生物样品的试验，包括(a)将生物样品与荧光标记的探针文库作用；并(b)检测每种荧光标记探针与生物样品的结合相互作用。
25．一种区分生物样品的方法，包括(a)将生物样品与相同的荧光标记探针文库作用；(b)检测每种探针与每种生物样品的结合相互作用，并(c)鉴定一种能将生物样品彼此区分的结合相互作用图谱。
26．一种鉴定有重要治疗和诊断意义的生物靶和用于药物发展的引导结构的方法，包括(a)将两种相同的探针文库与两种生物样品作用，其中第一种生物样品是对照；(b)使用均一的试验系统检测每种探针与生物样品的一个组分之间的结合相互作用；并(c)鉴定第二种生物样品特征性的探针/生物组分结合相互作用，其中这样鉴定的组分是一种生物靶，而对该生物组分具有亲和性的探针是发展药物的一种引导结构。
27．一种分析由分子组分混合物组成的样品的试验，所说的试验包括(a)将分子探针文库的成员连接到这样的支架上，该支架带有一个能被一种特殊的催化剂切割的位点，在位点的每一侧各有一个标记，从而提供分子探针/支架结构物；(b)将分子探针/支架结构物与样品组合，其中对样品中存在的一种分子组分具有亲和性的分子探针与该样品组分结合，形成一种能阻断支架的切割位点的复合物；(c)在混合物中加入特殊催化剂，使不包含一个结合的样品组分的支架被切割；并(d)检测未结合的分子探针从支架上的释放或复合物在支架上的保留；其中文库成员与样品的结合图谱提供样品的一种分子指纹。
28．权利要求21的试验，其中支架包含DNA、肽、肽类似物或其他聚合物。
29．权利要求21的试验，其中对生物样品中存在的一种受体具有亲和性的配体与该受体结合，并阻断支架特异的试剂接近支架。
30．权利要求21的试验，其中支架特异的结合试剂是一种药物、肽、寡肽、多肽、蛋白、糖蛋白、脂蛋白、糖、寡糖、多糖、有机或无机分子。
31．权利要求21的试验，其中支架特异的结合试剂不与配体和受体之间发生相互作用的支架区域结合。
32．权利要求21的试验，其中支架包括一种标记，该标记在结合蛋白与筛选序列结合时被封闭，这样接近该标记就表明支架特异的结合试剂不存在以及配体/受体相互作用存在。
33．根据权利要求21的试验，其中配体与第一个标记连接在支架的同一侧，并且试验进一步包括在第一个标记处将支架固定，加入催化剂后洗涤，来除去被切割的支架的未固定的部分，这种被切割的部分包括第二个标记，其中完整的支架通过第二个标记的存在来鉴定。
34．权利要求27的试验，其中支架由双链DNA组成，而标记是一种生物素化的核苷酸。
35．一种区分相同类型的生物样品的方法，包括(a)将相同的探针文库的成员连接到含有一个切割位点并且在该位点两侧都有标记的支架上；(b)将生物样品与相同的探针文库及相同的特异性催化剂作用；(c)检测每种探针与每种生物样品的结合相互作用；并(d)鉴定能使生物样品彼此区分的结合相互作用的图谱。
36．权利要求30的试验，它进一步包括使用一种对照生物样品和鉴定非对照生物样品特征性的探针/生物样品组分结合相互作用，其中这样鉴定的组分是生物靶，对该生物组分具有亲和性的探针是发展药物的引导结构。
37．合成标记配体文库的方法，包括(a)将一种荧光染料通过一种可切割的连接方式固定在一种固相支持物上，组成第一种产物混合物；(b)将所说的第一种产物混合物与一种或多种化合物或化合物的混合物在一定温度下反应足够的时间，组成第二种产物混合物；并(c)将反应混合物从固相支持物上切割下来，组成标记配体文库；其中荧光染料包括两个反应性半分子，它们独立地选自卤素、硫基、醇、醚、酯、醛、酮、羧酸、硝基、胺、酰胺、硅烷、以及它们的保护或非保护的衍生物。
38．权利要求37的方法，其中荧光染料是一种罗丹明衍生物、花菁衍生物、荧光素衍生物、色氨酸衍生物、香豆素衍生物、萘衍生物、双吡啶衍生物、三吡啶衍生物、有机金属复合物。
39．权利要求37的方法，其中固相支持物含有一个接头，而接头是一种卤素、硫基、醇、醚、酯、醛、酮、羧酸、硝基、胺、酰胺、硅烷、以及它们的保护或非保护的衍生物。
40．合成标记的配体文库的方法，包括(a)通过一种可切割接头将化合物固定在固相支持物上；(b)将一种荧光染料连接到固定的化合物上；并(c)从固相支持上切下分子－荧光染料反应产物，产生荧光标记的配体文库。
41．一种分析待测试剂的毒性特征的方法，包括(a)将两种相同的探针文库与两种生物样品作用，其中第一种生物样品是对照，而第二种生物样品用待测试剂作用；(b)检测每种探针与生物样品之间的结合相互作用；并(c)鉴定第二种生物样品特征性的探针/样品结合相互作用。
42．在生物样品中测定毒性试剂存在的方法，包括(a)将两种相同的探针文库与两种生物样品作用，其中第一种生物样品是已用毒性试剂处理的阳性对照；(b)检测每种探针与每种生物样品之间的结合相互作用；并(c)在第二种生物样品中鉴定作为阳性对照样品的特征的探针/毒性试剂结合相互作用。
43．权利要求41或42的方法，其中探针与生物样品之间的结合相互作用使用一种均一的试验系统来检测。
44．权利要求43的方法，其中探针文库被荧光或化学发光标记。
45．分析样品的蛋白组成的方法，包括使用权利要求1或26的方法制备样品中糖蛋白、脂蛋白、蛋白质、多肽、肽、肽类似物或氨基酸的分子指纹。
46．在病人中诊断疾病或疾患的方法，包括(a)使用权利要求45的方法制备从病人获得的生物样品的分子指纹；并(b)将病人样品的分子指纹与阳性或阴性对照样品的分子指纹进行比较。
47．在病人中预测药物或治疗效果的方法，包括(a)使用权利要求45的方法制备从病人获得的生物样品的分子指纹；并(b)将病人样品的分子指纹与(ⅰ)对药物或治疗应答以及对药物或治疗不应答、(ⅱ)对药物或治疗产生有害反应的病人的分子指纹进行比较。
48．在病人中监测治疗效果的方法，包括(a)在治疗前和一段时间后，使用权利要求45的方法制备从病人获得的生物样品的分子指纹；并(b)将病人样品产生的分子指纹与阳性或阴性对照样品的分子指纹进行比较。
49．分析样品的核苷酸组成的方法，包括使用权利要求1或26的方法制备样品中多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、核苷、DNA或一种衍生物、RNA或一种衍生物的分子指纹。
50．在病人中诊断疾病或疾患的方法，包括(a)使用权利要求49的方法制备从病人获得的生物样品的分子指纹；并(b)将病人样品的分子指纹与阳性或阴性对照样品的分子指纹进行比较。
51．在病人中诊断药物或治疗效果的方法，包括(a)使用权利要求49的方法制备从病人获得的生物样品的分子指纹；并(b)将病人样品的分子指纹与(ⅰ)对药物或治疗应答以及对药物或治疗不应答、(ⅱ)对药物或治疗产生有害反应的病人的分子指纹进行比较。
52．在病人中监测治疗效果的方法，包括(a)在治疗前和一段时间后，使用权利要求49的方法制备从病人获得的生物样品的分子指纹；并(b)将病人样品产生的分子指纹与阳性或阴性对照样品的分子指纹进行比较。
53．一种分析样品的分子组分的试剂盒，包括(a)一种分子探针文库；和(b)一种检测文库成员与样品中的分子组分结合的均一的或液相的手段。
54．根据权利要求53的试剂盒，其中探针文库用一种荧光标记，检测手段是一种荧光偏振仪器。
55．权利要求54的试剂盒，它进一步包括为文库的每个成员提供一种反应容器工具，使之适合于进行均一的试验。
56．权利要求54的试剂盒，它进一步包括一种支架，文库的成员可释放地与该支架连接。
57．权利要求54的试剂盒，其中分子探针文库被选择来与糖尿病、感染性疾病、炎症疾病、心脏病、赘生性疾病、自身免疫疾病和中枢神经系统疾病相关的分子组分结合。
全文摘要
本发明的组合筛选试验和检测方法包括高多样性的化合物文库,这种高多样性的化合物文库能用作指纹,来鉴别生物样品间存在的特异性分子差异。由本发明的组合筛选试验和检测方法鉴定的特异性分子差异是诊断和开发治疗的潜在的靶。本发明的方法可用于诊断、药物发现、以及基因组学和蛋白组学。图1是本发明的方法的图示,它显示了表Ⅱ中介绍的分子探针与人血清样品之间的相互作用。
文档编号G01N33/532GK1285001SQ98813707
公开日2001年2月21日 申请日期1998年12月18日 优先权日1997年12月18日
发明者D·L·赫夫纳, C·M·泽普, Y·高, S·W·琼斯 申请人:塞普拉科有限公司