一种功能化磁珠分离-酶联适配体检测食品中土霉素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食品中土霉素的检测方法，属于食品安全分析技术领域。
【背景技术】
[0002] 土霉素（Oxytetracycline，0TC),别名5-羟基四环素，地霉素，地灵霉素，氧四环 素等，是一种广谱抗菌药物，常作为牛、猪、家禽、鱼等动物疾病的预防和感染的治疗用药。 然而由于滥用及不遵守休药期规定等原因，造成其在畜产品中的残留，不仅给人类健康带 来严重危害，也给环境造成了严重威胁。世界粮农组织、世界卫生组织、欧盟及我国政府对 食品中土霉素的残留限量作了规定。
[0003] 目前,土霉素检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC)、毛细管电泳法（CE)、液相 色谱-质谱法（HPLC-MS)、酶联免疫吸附法（ELISA)等。但仪器分析方法设备昂贵，前处理 繁琐。快速检测方法通常采用抗原抗体特异相互作用识别模式，但由于受到抗体易失活、制 备依赖免疫动物和细胞、繁琐费时、一些小分子物质难以产生特异性抗体等因素的影响，在 一定程度上限制了抗体在快速检测技术中的应用。
[0004] 核酸适配体(Aptamer)技术的出现弥补了抗体在相关检测领域中应用的不足。 目前已有利用核酸适配子为识别分子应用于食品中土霉素检测的报道。如刘宾(暨南大 学硕士论文）建立了基于配适体的生物素-亲和素酶联检测土霉素的分析方法，但检测限 (1.58凡）不能满足土霉素检测的需要（限量值 ：10〇11^/1^)。1(;[1116七31.(4仙1.01；[111· Acta, 2009，634: 250-254)建立了适配体电化学传感器检测土霉素的分析方法，但适配 体固定步骤相对耗时，且样品基质对电化学信号易造成干扰。2010年他又利用纳米金修饰 的适配体为探针比色检测土霉素（Biosens· Bioelectron 26: 1644-1649)，但无法精确定 量。2014 年 Kim et al. (Biosens· Bioelectron 51: 426 - 430)基于 ELISA 原理，建立了 牛奶中土霉素的间接酶联适配体分析（ic-ELAA)方法，检测限为12. 3 ng/mL，但方法需要将 OTC - BSA包被于酶标板，造成检测时间较长（>IOh)。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单、检测快速、灵敏度高、成本低的功 能化磁珠分离-酶联适配体检测食品中土霉素的方法。
[0006] 本发明的目的通过以下技术方案来具体实现： 一种功能化磁珠分离-酶联适配体检测食品中土霉素的方法，采用核酸适配体-磁纳 米粒子复合物探针，通过HRP-OTC与样品中的OTC直接竞争结合磁珠表面的OTC适配体，底 物显色检测吸光值变化来定量分析样品中土霉素含量。
[0007] 其原理是将适配体通过生物素-亲和素系统固定于纳米磁珠表面，辣根过氧化酶 酶标记OTC (HRP-OTC)与样品中的OTC直接竞争结合磁珠表面的OTC适配体，通过底物显 色检测吸光值变化来定量分析样品中土霉素含量。检测原理如图1所示。
[0008] 核酸适配体-磁纳米粒子复合物探针的制备，采用文献（Wu SJ, Duan N, Wang ZP, et al. Analyst, 2011, 136, 2306-2314)报道的方法进行制备。
[0009] 进一步的，所述的核酸适配体-磁纳米粒子复合物探针为生物素修饰的适配体连 接亲和素修饰的纳米磁珠，即采用化学共沉淀法制备Fe 3O4纳米颗粒，然后利用戊二醛法将 氨基化的纳米磁珠与亲和素偶联。
[0010] 进一步优选，所述OTC核酸适配体的5'端修饰了生物素，通过生物素-亲和素系 统，同时固定于亲和素修饰的纳米磁珠表面。
[0011] 作为优选方案，上述的功能化磁珠分离-酶联适配体检测食品中土霉素的方法， 包括如下步骤： 1) HRP-OTC与OTC直接竞争结合固定于纳米磁珠表面的OTC适配体： a. 将步骤1)中制得的纳米磁珠分散于PBS中，取100 μ L添加到酶标板孔中，磁分离， 去上清； b. 每孔中加入20〇μL封闭液，37°C孵育40min，磁分离，PBST洗涤多余的封闭液； c. 然后于每孔中依次加入50 μ L HRP-OTC和50 μ LOTC标准品溶液，37°C孵育40min， 磁分离，PBST洗涤液洗涤； d. 每孔中加入100 μ L TMB底物显色液，37°C避光反应20min ; e. 最后每孔中加入100 μ L终止液终止反应，酶标仪450nm测吸光值； 2) 标准曲线的绘制 按步骤1)的操作步骤对土霉素标准品进行检测，建立标准曲线，OTC标准品浓度依次 为0. 5、1、2、5、10、25、50、100 ng/mL，以不同土霉素浓度的对数为横坐标，以抑制率B/B。为 纵坐标作图，绘制标准曲线，建立回归方程，Btl=OTC标准品浓度为Ong/mL所对应的吸光度； B :OTC标准品不同浓度所对应的吸光度； 3) 将食品样品提取液代替标准品溶液，按照步骤1)所述步骤进行检测，根据步骤2)的 标准曲线计算食品样品中OTC的含量。
[0012] 进一步优选的，所述步骤1)的步骤a中，核酸适配体-磁纳米粒子复合物探针分 散后的浓度为1.0 mg/mL。
[0013] 进一步优选的，所述封闭液为0· 1% BSA。
[0014] 进一步优选的，所述终止液为2. 0 mol/L的H2SO4溶液。
[0015] 根据标准曲线计算计算IC5tl值为14. 47 ng/mL (IC 5(|值：抑制率为50%所对应的 药物浓度）和检测限LOD为0. 88ng/mL (L0D :吸收值为Btl-空白对照3倍标准偏差所对应 的标品浓度） 本发明针对传统大型仪器不能实现现场快速检测、前处理繁琐、以及免疫分析方法需 要制备抗体的缺点，利用纳米磁珠快速分离及有效富集靶物质的优点，适配体的高特异性 和选择性特点，及酶标板的高通量筛选特性，建立了磁珠分离-酶联适配体检测方法，可用 于食品中土霉素残留的快速(检测时间：l〇〇min)、高灵敏（L0D :0. 88ng/mL)检测。与传统的 ELISA和酶联适配体（ELAA)相比，本发明提高了检测速度、灵敏度和特异性，降低了检测成 本。
[0016] 与传统ELISA和酶联适配体（ELAA)相比，优点如下： (1)此方法不需要制备抗体，适配体可体外人工合成，制备简单，节约劳动力； (2) 检测成本低于传统的免疫分析方法； (3) 相对于微孔板，磁纳米颗粒可充分发挥比表面积及小尺寸效应，提供更多的结合位 点，提高检测的特异性； (4) 相对于以微孔板为载体的ELAA分析方法，适配体不需要包被在酶标板上，缩短了 分析时间(本发明检测时间为lOOmin，以微孔板为载体的ELAA分析方法则需要IOh以上)， 同时适配体修饰磁珠均匀分散于溶液中，加快了识别分子与靶物质的结合速率，使检测速 度大大提高； (5) 在外加磁场的作用下通过磁分离可实现样品一步分离和靶物质有效富集，使洗涤 更彻底，降低基质干扰，提高了分析方法的信噪比与灵敏度。
【附图说明】
[0017] 图1是功能化纳米磁珠分离-酶联适配体检测土霉素的原理图； 图2是氨基化纳米磁珠扫描电镜图； 图3是氨基化纳米磁珠红外表征图；580 cm-1为Fe-O的伸缩振动，2854、2920和3433 CnT1为C - H和N - H的伸缩振动，1633 cm 4为氨基化纳米材料上的N - H的变形振动。
[0018] 图4是亲和素结合纳米磁珠的紫外扫描图，a.亲和素原液吸光值；b.亲和素结 合纳米磁珠后的上清液吸光值； 图5是磁珠分离-酶联适配体检测土霉素的标准曲线图； 图6是本发明与国标方法检测同一样品中土霉素的相关性曲线。
【具体实施方式】
[0019] 以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用 于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0020] 以下实施例中所用适配体是根据文献报道（Niazi JH.，Lee SJ, Kim YS, et al. Bioorgan· Med. Chem.，2008，16: 1254-1261)，由上海生物工程技术有限公司合成。 5; -biotin- GGAATTCGCTAGCACGTTGACGCTGGTGCCCGGTTGTGGTGCGAGTGTTGTGTGGATCCGAGCTC CACGTG-3 ; (Mw, 22052. I; Tm, 80.1 ° C) 实施例1 :牛奶样品测定 一、核酸适配体-磁纳米粒子复合物探针的制备 核酸适配体-磁纳米粒子复合物探针的制备采用文献SJ, Duan N, Wang ZP, et al. Analyst, 2011, 136, 2306-2314)报道的方法进行制备。
[0021] 1.氨基化纳米磁珠的制备：在30mL乙二醇中加入6. 5g的1,6-己二胺