生物芯片的进一步改进，通过在微单元表面接枝聚赖氨酸和LI蛋白，可以很好促进轴突的生长，改善生物芯片的活性。
[0035]由于研究对象不同，微结构各部分尺寸参数并不唯一固定，以上为微结构各部分尺寸可能有效的参数范围。
[0036]细胞培养液为业内公知的，可以根据需要进行相应的调整，以保证神经元的正常生长。
[0037]生物芯片的制备:
一种可用于评价药物、生物材料及医疗器械神经毒性的生物芯片的制造方法，包括:
1)在衬底材料上通过光刻技术制作微单元阵列模板；
2)使用PDMS倒模复制出光刻的模板结构；
3)将PDMS芯片贴附于盖玻片上，完成PDMS弹性芯片与玻璃基底的集成；
4)PDMS芯片的亲水性及生物活性后处理。
[0038]步骤I)在衬底材料上通过光刻技术制作微单元阵列模板，包括:
涂胶，将光刻胶SU-8 2025漓在衬底材料上，利用涂胶机完成涂胶；软烘焙，对涂胶后的衬底材料进行两级加热；光刻，利用光刻机制作出微单元阵列模板；光刻后烘焙，对曝光后的衬底材料进行两级加热；显影，利用显影液将硬烘焙后的衬底材料上的光刻胶中没有固化的光刻胶去除；硬烘焙，显影后衬底材料再加热，使模板更坚固。
[0039]其中，所述涂胶机的转速为4000 rpm，所述涂胶机的转动时间为60 S，涂覆光刻胶的厚度为20 Mm ;所述两级加热包括:60?70°C温度下烘焙5分钟，90?100°C温度下烘焙10分钟；所述光刻时间为20 s ;所述显影液为SU-8显影液；所述硬烘焙温度为135°C。
[0040]步骤4) PDMS芯片的亲水性及生物活性后处理，包括:
灭菌处理，120°C高温高压灭菌30分钟；亲水性处理，氧等离子体处理10分钟；聚赖氨酸接枝，浸于I ml的0.1 mg/ml的聚赖氨酸溶液中常温过夜；聚赖氨酸清洗，去离子水洗三遍，最后一遍去离子水保留过夜；表面接枝LI蛋白，吸除前次清洗的去离子水，浸入Iml25μδ/πι1的LI蛋白溶液，37°C作用4小时，最后接种细胞前将LI蛋白吸除并加入全培养液。
[0041]其中，全培养液为含10% FBS、2% B27、l%双抗、100 ng/ml NGF 7s的M199培养基。
[0042]生物芯片的评价:
对上述生物芯片进行不同剂量甲基汞溶液神经毒性评价的方法，包括: 1)将单个鸡胚前脑神经元(E6-E8)经激光引导细胞微排列系统放置于目标微孔中，两侧引导微孔中不放置轴突吸引或排斥微球；
2)实验组:鸡胚前脑神经元接种16小时后，吸除原来的全培养液，并用不含甲基汞的M199溶液洗一次，洗去原来培养液中的血清残留，加入不同浓度甲基汞M199溶液作用4小时后，用M199培养液洗一次，洗去甲基汞溶液残留，然后换回全培养液，细胞恢复48小时后，光学显微镜下观察、统计目标微孔中神经元轴突路径选择状态；
3)对照组:鸡胚前脑神经元接种后，直接用全培养液培养，光学显微镜下观察、统计目标微孔中神经元轴突路径选择状态；
4)将实验组神经元轴突路径选择成功率与对照组进行对比，评价药物、生物材料及医疗器械的神经毒性。
[0043]评价结果:
图5为实施例中的微单元表面不接枝LI分子和接枝LI分子神经元生长情况对照图，其中:(A)不接枝LI分子；(B)接枝LI分子。
[0044]图6为实施例中Y型微单元和T型微单元中神经元轴突路选择结果图，其中:(A)T型，分叉至双侧；(B) T型，转向单侧；(C) Y型，分叉至双侧；(D) Y型，转向单侧。
[0045]图7为实施例中生物芯片的评价结果与传统神经突生长法的评价结果对比图，其中:(A)传统神经突生长法评价结果；(B)生物芯片评价结果(*p〈0.05，卡方检测)。由图7可知，传统神经突生长法对甲基汞神经毒性的检测下限是50nM，而具有单神经元轴突路径选择模型的生物芯片对甲基汞神经毒性的检测下限是5nM，可见本发明所述的生物芯片及其评价方法，比传统神经毒性评价方法灵敏度更高。
[0046]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种可用于评价药物、生物材料以及医疗器械神经毒性的生物芯片，其特征在于:生物芯片由具有不同拐角的微单元阵列组成，微单元由三个微孔及连接三个微孔的微通道组成，微单元以连接目标微孔的微通道为对称轴左右对称，两侧微孔为引导微孔。2.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于:微单元拐角A为0°〈A< 90°。3.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于:微孔直径D为10?ΙΟΟμπι。4.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于:通道宽度W为I?40μπι。5.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于:微结构整体深度H为2?60μπι。6.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于:微通道长度L为10?lOOOMm。7.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于:微单元表面接枝有聚赖氨酸和LI蛋白。8.一种评价药物、生物材料以及医疗器械神经毒性的方法，包括如下步骤: 1)通过激光引导细胞微排列系统将单个神经元放置于生物芯片的目标微孔中； 2)实验组:先用添加有待测物或待测物浸提液的细胞培养液进行培养，再洗去原培养液，用全培养液培养，观察记录目标微孔中单神经元轴突路径选择状态； 3)对照组:用全培养液培养，观察记录目标微孔中单神经元轴突路径选择状态； 4)对比神经元轴突路径选择情况，评价药物、生物材料或医疗器械的神经毒性； 其中，生物芯片如权利要求1?7任意一项所述。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于:引导微孔中的一个放置有轴突吸引或排斥微球。
【专利摘要】本发明公开了一种可用于药物、生物材料以及医疗器械神经毒性评价的生物芯片及其评价方法，涉及微加工与神经毒性评价技术领域。该生物芯片由具有不同拐角的微单元阵列组成，微单元由三个微孔及连接三个微孔的微通道组成，微单元以连接目标微孔的微通道为对称轴左右对称，两侧微孔为引导微孔。本发明的生物芯片及其评价方法，能够在体外实现高通量、高灵敏度的评价药物、生物材料或医疗器械的神经毒性。
【IPC分类】G01N35/00
【公开号】CN105004870
【申请号】CN201510394431
【发明人】魏利娜, 盛立远, 赖琛, 王巧莉, 高志, 张志雄, 奚廷斐
【申请人】北京大学深圳研究院
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年7月7日